يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تطوير عضوي نموذج متعددة الخلايا ثلاثي الأبعاد من الأمعاء الغشاء المخاطي الإنسان نمت في ظل الجاذبية

9.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54148

⸱

يوليو 25, 2016

 ,  , 
1Center for Vaccine Development, Department of Pediatrics, University of Maryland School of Medicine, 2Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital for Children

في هذه المقالة

ملخص

خلايا تنمو في (3-D) بيئة ثلاثية الأبعاد تمثل تحسنا ملحوظا خلال زراعة الخلايا في بيئات 2-D (على سبيل المثال، قوارير أو أطباق). نحن هنا وصف تطوير نموذج عضوي النمط 3-D متعددة الخلايا في الغشاء المخاطي في الأمعاء البشرية المستزرعة في ظل انعدام الجاذبية التي تقدمها الدورية جدار الأوعية الدموية (RWV) المفاعلات الحيوية.

الملخص

لأن الخلايا التي تنمو في (3-D) بيئة ثلاثية الأبعاد لديها القدرة على سد العديد من الثغرات في زراعة الخلايا في بيئات 2-D (على سبيل المثال، قوارير أو أطباق). في الواقع، من المسلم به على نطاق واسع أن الخلايا المزروعة في قوارير أو أطباق تميل إلى التقليل من التمييز وفقدان الميزات المتخصصة التابعة للأنسجة التي تشتق منها. حاليا، هناك أساسا نوعان من نظم الاستزراع 3-D حيث هي المصنفة الخلايا في السقالات محاكاة المصفوفة خارج الخلية الأم (ECM): (أ) نماذج ثابتة ونماذج (ب) باستخدام المفاعلات الحيوية. كان الانطلاقة الأولى للساكنة نماذج 3-D. نماذج 3-D باستخدام المفاعلات الحيوية مثل الدورية جدار الأوعية الدموية (RWV) المفاعلات الحيوية هي تطور أكثر حداثة. تم تطوير المفهوم الأصلي للالمفاعلات الحيوية RWV في مركز جونسون للفضاء التابع لناسا في 1990s في وقت مبكر، ويعتقد أن التغلب على القيود المفروضة على نماذج ثابتة مثل تطوير ميتة، النوى الميتة. في المفاعلات الحيوية RWV قد تحايل عشرهو المشكلة عن طريق توفير ديناميات السوائل التي تسمح للنشر كفاءة من المواد المغذية والأكسجين. هذه المفاعلات الحيوية تتكون من قاعدة المدورة التي تعمل على دعم وتدوير شكلين مختلفين من السفن الثقافة التي تختلف من حيث النوع مصدر التهوية: (1) بطء تحول السفن الجانبي (STLVs) مع مكساج المشارك المحوري في المركز، أو (2 ) سفن ارتفاع نسبة الارتفاع (HARVs) مع الأوكسجين عبر، سيليكون المطاط غشاء نقل الغاز مسطح. هذه السفن تسمح نقل الغاز كفاءة مع تجنب تشكيل فقاعة ويترتب على ذلك الاضطراب. هذه الظروف تؤدي إلى تدفق الصفحي والحد الأدنى من قوة القص أن النماذج خفض الثقل (الجاذبية الصغرى) داخل سفينة الثقافة. نحن هنا وصف تطوير نموذج عضوي النمط 3-D متعددة الخلايا في الغشاء المخاطي المعوي البشري يتكون من خط الأمعاء الظهارية الخلايا والخلايا الليمفاوية الإنسان الأساسية، والخلايا البطانية والخلايا الليفية مثقف تحت الجاذبية الصغرى التي تقدمها مفاعل حيوي RWV. </ P>

المقدمة

وذكرت تقارير ان الانطلاقة الأولى في بناء نموذج 3-D في وقت مبكر من 1980s عندما بدأ العلماء للتحقيق في أنواع مختلفة من سقالة (على سبيل المثال، laminin، نوع الكولاجين الأول، الكولاجين الرابع، والفيبرونكتين) والكوكتيلات من عوامل النمو لتحسين خلية الى خلية والتفاعلات ECM من "ثابت" نماذج 3-D 1-7. ومنذ ذلك الحين، كانت المشكلة الرئيسية مع هذه النماذج القيود في نقل المواد المغذية والأكسجين داخل المتوسطة والأنسجة يبني 8. وعلى النقيض من الخلايا في البيئة في الجسم الحي الذي يتلقى تدفق مستمر من المواد المغذية والأكسجين من المحيط شبكات الأوعية الدموية، وطبيعة ثابتة من هذه النماذج تعيق التوزيع الفعال منهم إلى الخلايا. على سبيل المثال، سوف المجاميع خلية ولدت في في المختبر النماذج الثابتة التي تتجاوز بضعة ملليمترات في حجم تتطور دائما ميتة، النوى الميتة 9. في المفاعلات الحيوية RWV قد تحايل على هذه المشكلةمن خلال توفير ديناميات السوائل التي تسمح للنشر أكفأ من المغذيات والأكسجين 10-12. ومع ذلك، حتى الآن، العمل باستخدام المفاعلات الحيوية RWV اقتصرت على إدراج واحد أو اثنين من أنواع الخلايا 13-17. وعلاوة على ذلك، بدلا من التوجه المكاني مماثلة لأنسجة الأم، تلك الخلايا شكلت المجاميع الخلية. وكان السبب الرئيسي لهذه القيود عدم وجود سقالة قادرة على دمج الخلايا بطريقة متكاملة. السقالات المستخدمة في المفاعلات الحيوية RWV حتى الآن تتكون، مع استثناءات قليلة 16-18، وذلك أساسا من ميكروبيدات الاصطناعية، واسطوانات أنبوبي أو ورقة صغيرة 13-15،19-23. هذه هي مواد شديدة تركيبتها والمرونة لا يمكن التلاعب بها، والتي تعلق الخلايا إلى سطحها. وبالتالي، فإنه من غير المحتمل أن هذه النماذج سيوفر النظام الذي لتقييم وبطريقة متكاملة، ومختلف مكونات الخلية مثل خلايا انسجة (على سبيل المثال، الخلايا الليفية، الخلايا المناعية والبطانية) أن لياليأن تفرق hould معها داخل سقالة لتقليد بشكل وثيق الأنسجة البشرية.

نحن هنا وصف تطوير نموذج عضوي النمط 3-D متعددة الخلايا في الغشاء المخاطي المعوي البشري يتكون من خط الأمعاء الظهارية الخلايا والخلايا الليمفاوية الإنسان الأساسية، والخلايا البطانية، والخلايا الليفية 24. وكانت هذه الخلايا المستزرعة تحت الجاذبية الصغرى تقدم من قبل مفاعل حيوي RWV 13،25-30. في نموذجنا 3-D، إدارة المحتوى في المؤسسة تمتلك العديد من الخصائص المتميزة، مثل الأسمولية مماثلة إلى مستنبت (على سبيل المثال، القيود الأنتشارى تذكر خلال ثقافة)، والقدرة على دمج الخلايا وغيرها من البروتينات المصفوفة خارج الخلية ذات الصلة، فضلا عن صلابة مناسبة لاستخدامها في المفاعلات الحيوية 24. النظم البيولوجية معقدة جدا، وعلى مدى السنوات القليلة الماضية، كان هناك تحول في التركيز على البحوث المخاطية نحو دراسة التفاعلات الخلية مع محيطهم بدلا من دراستها في isolatioن. على وجه الخصوص، على أهمية التفاعلات خلية خلية في التأثير على بقاء الخلية المعوية والتمايز موثق جيدا 31-34. على وجه التحديد، والاتصالات بين الخلايا الظهارية ومكانها المناسب له تأثير عميق على توسيع الخلايا الظهارية والتمايز 35. في الواقع، ومن المسلم به على نطاق واسع ليس فقط من خلية إلى خلية لكن أيضا التفاعلات الخلية الى ECM حاسمة لصيانة وتمايز الخلايا الظهارية في نماذج الثقافة 3-D. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن البروتينات الأمعاء ECM مثل الكولاجين أنا 24،36،37، laminin 38 و 39 الفيبرونكتين دور فعال في التأثير على الخلايا الظهارية في الأمعاء للحصول على التوجه المكاني على غرار الغشاء المخاطي الأصلي. وهكذا، وتطوير التكنولوجيات الجديدة، مثل لدينا نموذج 3-D 24، التي يمكن أن تحاكي مطلوب تنوع المظهري للامعاء إذا تنوي الباحثين لإعادة العمارة الخلوية والهيكلية المعقدةوظيفة المكروية القناة الهضمية. وتمثل هذه النماذج أداة هامة في تطوير وتقييم الأدوية عن طريق الفم الجديدة واللقاحات المرشحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بيان الأخلاق: جمعت جميع عينات الدم من المتطوعين الذين شاركوا في عدد بروتوكول HP-00040025-1. وافقت جامعة ميريلاند مجلس المراجعة المؤسسية هذا البروتوكول وأذن جمع عينات الدم من المتطوعين الأصحاء للدراسات المدرجة في هذه المخطوطة. وأوضح أن الغرض من هذه الدراسة للمتطوعين، وجميع المتطوعين أعطى علم، وقعت الموافقة قبل سحب الدم.

ملاحظة: انظر الجدول رقم 1 لإعداد ملحق المتوسط. انظر الجدول 2 لإعداد وسائل الإعلام والثقافة 3-D.

1. إعداد السفن الثقافة

  1. فك الغطاء من ميناء تعبئة من مل الأوعية الدموية 50 وملء مع 50 مل من مستنبت معقم (على سبيل المثال، RPMI). تنفيذ كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة في غطاء الصفحي.
  2. استبدال الغطاء ومسح أي وسيط المسكوب على أي سطح مع 70٪ من الإيثانول.
  3. السماح للسفينة إلى incubأكل لمدة 15 دقيقة على الأقل إلى O / N في RT.
  4. استخدام منفذ التعبئة لتجاهل مستنبت وإضافة 30 مل من 3-D مستنبت.
  5. مسح أي وسيط المسكوب على أي سطح مع 70٪ من الإيثانول.

2. إعداد خلايا

  1. خط الظهاري البشري خلية (HCT-8) 24،40.
    1. ثقافة الخلايا في RPMI تستكمل مع 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 2 مم L-الجلوتامين، 1 ملم البيروفات الصوديوم، و 10 ملي HEPES العازلة و 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS ) (ملحق 1). في 70٪ confluency، تقسيم الخلايا في نسبة 1: 5.
  2. الليفية القولون الإنسان (خلايا CCD-18Co) 24،41.
    1. ثقافة الخلايا في متوسطة بصل النسر المخصب مع الملحق 1 في confluency، تقسيم الخلايا في نسبة 1: 3.
  3. السري الإنسان الوريد غشائي (HUVEC) خلايا 24،42.
    1. خلايا الثقافة في غشائي بصل متوسطة (EBM) إثراء المتوسطة مع 100 ميكروغرام / مل الهيبارين، 3 ميكروغرام / مل البطانية الملحق نمو الخلايا (رسم القلب)، وتكملة 1 في 70٪ confluency، تقسيم الخلايا في نسبة 1: 2.
  4. اللمفاويات / وحيدات
    1. عزل الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي (PBMC) من الدم عن طريق الطرد المركزي التدرج الكثافة باستخدام التقنيات القياسية 43.
      1. لفترة وجيزة، وذلك باستخدام 10 مل ماصة، إضافة بعناية 30 مل من الدم المخفف (1: 1 الدم: الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)) في أنبوب 50 مل مخروطي الشكل تحتوي على 10 مل من وسائل الاعلام الكثافة الطرد المركزي. بعد الخطوة الطرد المركزي، والخلايا الليمفاوية وحيدات يقيم في طبقة "البيضاء" بين وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي وطبقات البلازما.
      2. جمع الطبقة البيضاء باستخدام ماصة نقل. تجنب التلوث محببة عن طريق الحد من مجموعة من وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي. بعد غسل 43، شحد ذاته PBMC كما هي أو cryopreserved في السائل N 2.
        ملاحظة: من المهم تسليط الضوء على أن PBMC تتكون إلى حد كبير من الخلايا الليمفاوية وحيدات، مع نسبة ضئيلة من الخلايا الجذعية وأنواع الخلايا الأخرى.
  5. تنمو كل الخلايا تحت ظروف التربية قياسية عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2.

3. إعداد خلايا الكولاجين جزءا لا يتجزأ،

  1. تحديد عدد إدراج احتاج استنادا إلى أرقام من الظروف التجريبية ليتم انشاء. ضع العدد المناسب من يدخل في الآبار من لوحة 6 جيدا.
  2. إعداد تعليق HUVEC والخلايا الليفية:
    1. غسل القوارير مرتين في برنامج تلفزيوني وفصل الخلايا باستخدام التربسين، 0.25٪ (1X) مع ethylenediaminetetraacetate 0.05٪ التربسين- تيتراصوديوم (التربسين-EDTA). إضافة ما يكفي من حل التربسين لتغطية مجمل مساحة زراعة الخلايا. يحدث انفصال عادة في غضون 5 إلى 15 دقيقة
    2. جمعخلايا منفصلة في 50 مل أنبوب تحتوي على 30 مل من المتوسط ​​التعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) -30٪ FBS المتوسطة.
    3. أنبوب الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 10 دقيقة.
    4. resuspend الخلايا في 30 مل من DMEM 30٪ FBS المتوسطة.
    5. عد العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة عن طريق تمييع 20 ميكرولتر من معلق الخلايا مع 20 ميكرولتر من التريبان صبغة زرقاء. تحميل عدادة الكريات مع خليط الخلية. سوف PBMCs قابلة للحياة تكون بيضاء واضحة. سوف nonviable PBMC اكتساب صبغة وأصبح الأزرق.
      1. resuspend كل نوع من الخلايا في DMEM 30٪ FBS المتوسطة بتركيز 5-8 × 10 7 خلايا مل - 1.
  3. إعداد المواد الهلامية الكولاجين التي تحتوي على خلية
    ملاحظة: كل سفينة يتطلب إعداد ~ 5 مل من هلام الكولاجين التي تحتوي على الخلية.
    1. في أنبوب 50 مل مخروطي تحضير الخليط الكولاجين عن طريق إضافة 1 وسائل الاعلام س DMEM، على أن تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 2 مم L-الجلوتامين و 10٪ للحرارة inactivatإد FBS زائد 3 ملغ / مل البقري الكولاجين-I، 10 ميكروغرام / laminin مل و 40 ميكروغرام / مل الكولاجين الرابع، 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين، 2 ميكروغرام / مل الهيبارين بروتيوغليكان كبريتات و 15 ملي هيدروكسيد الصوديوم (للوصول إلى درجة الحموضة الفسيولوجية).
    2. إغلاق أنبوب وتخلط بواسطة قلب عدة مرات حتى يتم المتجانس الخليط تماما. تجنب تشكيل فقاعة.
      هام: حافظ على الخليط على الجليد لمنع gelification.
      1. خطوة حاسمة: إذا تطور خليط ظهور الحمضية (صفراء اللون)، إضافة بضع قطرات من معقم 1 N هيدروكسيد الصوديوم لتحييد الخليط.
    3. إضافة HUVEC المركز والخلايا الليفية في مناطق ذات كثافة من 1،0-1،2 و1،5-2،0 × 10 6 خلية / مل على التوالي إلى المخصب الكولاجين خليط (المذكورة أعلاه). إغلاق أنابيب وتخلط بواسطة قلب عدة مرات حتى يتم المتجانس الخليط تماما. تجنب تشكيل فقاعة. هام: حافظ على الخليط على الجليد لمنع gelification.
    4. إضافة 4-5 مل من الكولاجين التي تحتوي على خليةهلام إلى كل إدراج، وتحميلها من قبل في بئر لوحة 6، والسماح للgelify في غطاء محرك السيارة مع حركة قليلة أو معدومة لمدة 1 ساعة.
    5. بعد 1 ساعة، ونقل لوحة 6 جيدا إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة لل1-2 ساعات إضافية.
    6. العودة لوحة 6 جيدا لغطاء محرك السيارة، وبمساعدة ملقط معقم ومشرط قطع جو معقم و مطهر الغشاء من إدراج فصل الجل التي تحتوي على خلية من الغشاء. قطع هلام منفصلة إلى مربعات صغيرة (~ 5 × 5 مم).
    7. إضافة مربعات صغيرة تحتوي على الخلية في حارف 50 مل باستخدام منفذ التعبئة.
  4. إعداد تعليق كليات التقنية العليا-8 خلايا الظهارية:
    1. غسل القوارير مرتين في برنامج تلفزيوني وفصل الخلايا باستخدام التربسين، 0.25٪ (1X) مع العلاج التربسين-EDTA. إضافة ما يكفي من حل التربسين لتغطية مجمل مساحة زراعة الخلايا. يحدث انفصال عادة في غضون 10 إلى 15 دقيقة.
    2. جمع خلايا منفصلة في 30 مل من DMEM 30٪ FBS المتوسطة.
    3. Centrifأويغه DMEM 30٪ FBS المتوسطة التي تحتوي على أنبوب في 500 x ج لمدة 10 دقيقة.
    4. resuspend الخلايا في 30 مل من DMEM 30٪ FBS المتوسطة.
    5. عد العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة كما هو موضح في 3.2.5.
    6. Resuspend وكليات التقنية العليا-8 الخلايا الظهارية في DMEM 30٪ FBS المتوسطة بتركيز 10 7 خلايا مل - 1.
    7. إضافة 1 مل من كليات التقنية العليا-8 خلايا الظهارية المركزة في حارف 50 مل باستخدام منفذ التعبئة.
  5. باستخدام منفذ التعبئة، إضافة إضافي مستنبت 3-D حتى السفينة كاملة تقريبا (~ 20 مل).
  6. استبدال الغطاء ومسح الشفة من ميناء ملء مع 70٪ من الإيثانول.
  7. وضع حقنة في كل منفذ حقنة من RWV: وضع 5 مل حقنة تحتوي على 3-4 مل من 3-D مستنبت في منفذ واحد وحقنة 5 مل فارغة في منفذ آخر.
  8. إزالة أي فقاعات مرئية عن طريق سحب في حقنة فارغة في حين يتم حقن تقريبا نفس حجم المتوسط ​​عبر ميناء حقنة أخرى.
  9. ضع فيسSELS في مفاعل حيوي، تشغيل الطاقة وضبط سرعة إلى حوالي 13-14 التناوب في الدقيقة الواحدة.
    ملاحظة: خطوة حاسمة: قد تحتاج معدل دوران لتعديلها عدة مرات خلال تجربة للحفاظ على الخلايا التي تدور داخل السفينة، وبالتالي تجنب الاتصال مع جدران الأوعية.
  10. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 تحت الجاذبية الصغرى، التي تقدمها مفاعل حيوي RWV.
  11. تغيير الثقافة المتوسطة كل 3-4 أيام عن طريق استبدال حوالي 30 مل مع الطازجة مستنبت 3-D.
  12. بعد 4 أيام (± 1 يوم)، وإزالة السفن من مفاعل حيوي وإضافة الخلايا الليمفاوية / حيدات في الأوعية (2 × 10 7 / سفينة).
  13. وضع السفن مرة أخرى في مفاعل حيوي عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 5 أيام إضافية (± 1 يوم).
  14. بعد 5 أيام إضافية (يوم 9 من ثقافة)، إضافة اللمفاويات / حيدات في الأوعية (2 × 10 7 / سفينة) ومواصلة الثقافات لمدة تصل إلى 12 يوما إضافية.
  15. تغيير الثقافة المتوسطة كل 3-4 أيام عن طريق استبدال حوالي 30 مل مع الطازجة مستنبت 3-D.

4. حصاد الثقافات 3-D للعلم الأنسجة

  1. مع المعونة من الحصاد ماصة نقل كل جزء هلام الصغيرة، التي تسمى الآن "بناء" في لوحة ستة جيدا تحتوي على 10 مل من العازلة الفورمالين 10٪. يترك لمدة 3 ساعة على RT أو 12-16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  2. إعداد وتجهيز الأنسجة وأشرطة التضمين عن طريق وضع العلامات وإضافة قطعتين من منصات خزعة الرغوة في كل الكاسيت.
  3. تزج الأشرطة العازلة في الفورمالين 10٪.
  4. بمساعدة ملقط وضع بنيات-ثابت بين فوم اثنين.
  5. تزج الأشرطة العازلة في الفورمالين 10٪.
  6. السير في الإجراءات القياسية لالتضمين، باجتزاء، وتلطيخ 44.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

سابقا كنا المهندسة 3-D نموذج عضوي النمط متعددة الخلايا في الغشاء المخاطي المعوي البشري يتكون من خط الأمعاء الظهارية الخلايا والخلايا الليمفاوية الإنسان الأساسية، والخلايا البطانية والخلايا الليفية مثقف في ظل ظروف الجاذبية الصغرى 24 (الشكل 1). كانت جزءا لا يتجزأ الخلايا الليفية والخلايا البطانية في الكولاجين أنا المصفوفة المخصب مع إضافي الأمعاء الطابق السفلي بروتينات غشاء 45 (أي، laminin، الكولاج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا المخطوط، وصفنا تطوير نموذج الهندسة البيولوجية من الغشاء المخاطي المعوي البشري يتكون من أنواع الخلايا مضاعفات بما في ذلك الخلايا الليمفاوية الإنسان الأساسية، الخلايا الليفية، والخلايا البطانية، وكذلك الأمعاء خطوط الخلايا الظهارية 24. في هذا النموذج 3-D، ومثقف خلايا داخل المصفوفة خارج الخلية الكولاجين الغنية في ظل ظروف الجاذبية الصغرى 24.

كما هو موضح سابقا، وأبرز ملامح هذا النموذج هي: <...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه تم تقديم طلب براءة اختراع أمريكي غير مؤقت في مكتب براءات الاختراع والعلامات التجارية الأمريكي (الرقم: 13/360,539).

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من قبل المنح البحثية الفيدرالية ل NIAID و NIH و DHHS R01 AI036525 و U19 AI082655 (CCHI) إلى MBS ومن خلال منح المعاهد الوطنية للصحة DK048373 AF. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية أو المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

مفاعل حيوي صندوق خلايا مكمل نمو الخلايا البطانية القاعدية
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
رباعي الدوار / وعاء الجدار الدوار المستقل (RWV)   ؛SyntheconRCCs-4DQلما يصل إلى 4 سفن. تتوفر أيضا نماذج ذات سفن أكثر أو أقل.
SyntheconD-405القابل للتصرف سعة 50 ملمع 4 أوعية
ظهارية HCT-8  ATCCCCL-244
CCD-18Co الخلايا الليفية  ATCCCRL-1459
الخلايا البطانية للوريد السري البشريATCCCRL-1730HUVEC
عامل نمو الخلايا الليفية - أساسي & nbsp ؛SigmaF0291bFGF
عامل الخلايا الجذعية سيجماS7901SCF
عامل نمو خلايا الكبد SigmaH1404HGF
Endothelin 3SigmaE9137
LamininSigmaL2020معزولة من الفأر Engelbreth-Holm-Swarm ورم
عامل النمو البطاني الوعائي  SigmaV7259VEGF
عامل مثبط لسرطان الدم  سانتا كروزsc-4377(LIF
AdenineSigmaA2786
الأنسولينSigmaI-6634
3،3 '، 5-triiodo-L-thyronine   ؛سيجماT-6397T3
توكسين الكوليراسيجماC-8052
فيبرونيكتينBD354008معزولة من البلازما البشرية
apo-TransferrinSigmaT-1147
HeparinSigmaH3149
Heparan sulfate  proteoglycanSigmaH4777معزولة من الغشاء القاعدي للفأر  ورم Engelbreth-Holm-Swarm
Collagen IVSigmaC5533معزول من المشيمة
البشرية مصل بقري الجنين المعطل بالحرارة  Invitrogen10437-028
D-MEM ، مسحوقInvitrogen12800-017
10٪ فورمالين & ndash ؛ PBS فيشر ساينتفيكSF100-4
الكولاجين البقري من النوع الأول   ؛InvitrogenA1064401
Trypsin-EDTA فيشر ScientificMT25-052-CI
بيروفات الصوديومInvitrogen11360-070
Gentamicin Invitrogen15750-060
البنسلين / الستربتومينسين  Invitrogen15140-122
L-GlutamineInvitrogen25030-081
HepesInvitrogen15630-080
Ham's F-12Invitrogen11765-054
Basal Medium EagleInvitrogen21010-046BME
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Endothelial المتوسطةLonza CC-3156EBM-2
Millipore02-102ECGS

المراجع

  1. Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
  2. Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
  3. Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
  4. Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
  5. Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
  6. Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
  7. Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
  8. Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
  9. Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
  10. Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
  11. Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  12. Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  13. Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
  14. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
  15. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
  16. Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
  17. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
  18. Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
  19. He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
  20. Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
  21. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
  22. Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
  23. Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
  24. Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
  25. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
  26. Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
  27. Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
  28. Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
  29. Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
  30. Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
  31. Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
  32. Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
  33. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
  34. Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651(2014).
  35. Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
  36. Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
  37. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814(2014).
  38. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
  39. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
  40. Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
  41. Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
  42. Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
  43. Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
  44. Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064(2014).
  45. Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
  46. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
  47. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
  48. Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
  49. Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
  50. Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
  51. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
  52. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  53. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  54. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

زراعة الجاذبية الصغرىوعاء الجدار الدوارنموذج عضوي ثلاثي الأبعادزراعة متعددة الخلاياتحضير هلام الكولاجينتقنية عزل الخلاياطريقة السرنجة المزدوجةالطمر النسيجيسمات شبيهة بالزغابات
تطوير عضوي نموذج متعددة الخلايا ثلاثي الأبعاد من الأمعاء الغشاء المخاطي الإنسان نمت في ظل الجاذبية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.