هنا ، نصف طريقة بسيطة للحقن داخل البطين وداخل الأوعية الدموية للجزيئات الفيروسية أو الميكروبيدات الفلورية في دماغ الفأر حديثي الولادة. يمكن الكشف عن نمط توطين الفيروس والجسيمات النانوية عن طريق التقييم المجهري أو عن طريق التهجين في الموقع.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Intracerebroventricular وداخل الأوعية الدموية حقن الفيروسية الجسيمات ونيون ميكروبيدات في الدماغ حديثي الولادة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في دراسة عن التسبب في التهاب الدماغ الفيروسي، وطريقة العدوى أمر بالغ الأهمية. أول اثنين من الطرق الرئيسية المعدية إلى الدماغ هو الطريق الدموي، الذي ينطوي على إصابة الخلايا البطانية وpericytes من الدماغ. والثاني هو intracerebroventricular (ICV) الطريق. مرة واحدة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وقد تنتشر الفيروسات إلى الفضاء تحت العنكبوتية، السحايا، والضفيرة المشيمية عبر السائل المخي الشوكي. في النماذج التجريبية، المراحل الأولى من توزيع الفيروسي الجهاز العصبي المركزي لا تتسم بشكل جيد، وأنه من غير الواضح ما إذا كانت مصابة فقط خلايا معينة في البداية. هنا، قمنا بتحليل توزيع جزيئات الفيروس المضخم للخلايا (CMV) أثناء المرحلة الحادة من الإصابة، ووصف فيروسية الدم الأساسي، بعد ICV أو داخل الأوعية (IV) الحقن في مخ الفأر حديثي الولادة. في نموذج حقن ICV، تم حقن 5 ميكرولتر من الفيروس المضخم للخلايا الفئران (MCMV) أو ميكروبيدات الفلورسنت إلى البطين الجانبي في midpoiالإقليم الشمالي بين الأذن والعين باستخدام حقنة 10 ميكرولتر مع إبرة 27 G. في نموذج حقن الرابع، وكان يستخدم حقنة 1-مل مع إبرة 35 G. تم استخدام نقل transilluminator لتصور الزمان (الوجه) الوريد السطحي للفأرة حديثي الولادة. نحن غرست 50 ميكرولتر من MCMV أو ميكروبيدات الفلورسنت في الوريد الصدغي السطحي. تم حصادها العقول في مختلف نقاط الوقت بعد الحقن. تم الكشف عن الجينوم MCMV استخدام في طريقة التهجين الموضعي. وقد لوحظت ميكروبيدات الفلورسنت أو البروتين الفلوري الأخضر معربا عن جزيئات MCMV المؤتلف بواسطة المجهر الفلورسنت. هذه التقنيات يمكن تطبيقها على العديد من مسببات الأمراض الأخرى للتحقيق في التسبب في التهاب الدماغ.
المقدمة
عند دراسة التهاب الدماغ الفيروسي، والتوزيع الأولي من الجسيمات الفيروسية مهم جدا لفهم المرض والتسبب في ولتحديد أهداف الفيروسية في المخ. وتتراوح معظم الفيروسات في حجم 20-300 نانومتر، على الرغم من أن Pandoravirus أكثر من 700 نانومتر في حجم 1. توزيع الجسيمات الفيروسية في المرحلة الحادة من العدوى قد يعتمد على حجم الجسيمات، وتوزيع المستقبلات الخلوية، أو تقارب من المستقبلات الخلوية للبحث عن الفيروسات. في النماذج الحيوانية، intracerebroventricular (ICV)، داخل الصفاق، المشيمة مباشرة، وعن طريق الوريد (IV) وقد استخدمت العدوى لدراسة المرضية لالتهاب الدماغ الفيروسي. ICV التلقيح بفيروس كثيرا ما يستخدم لإقامة التهابات الجهاز العصبي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية لجنة رعاية الحيوان من جامعة هاماماتسو كلية الطب.
1. إعداد MCMV (سميث سلالة) والمؤتلف M32 تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) -MCMV
- توليد المؤتلف M32-EGFP-MCMV وفقا لطريقة النحو التالي (1،2-1،9) وكما هو موضح سابقا 8.
- استخدام الفيروسات المؤتلف المستمدة من سلالة سميث من MCMV البرية من نوع (عدد الانضمام: U68299). إدراج EGFP (4،361 أزواج الأساس؛ بي بي) بين 37089 و 41450 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وفي دراسة أجريت على التسبب في التهاب الدماغ الفيروسي، وطريقة العدوى هو المهم. يمثل الطريق الدموي التهاب حاد في الخلايا البطانية وpericytes من الدماغ، في حين يمثل الطريق ICV تنتشر العدوى الحادة عن طريق السائل النخاعي من خلال الفضاء تحت العنكبوتية، ووصلت إلى السحايا والضفيرة المشيمية. لتحليل التوزيع الأول للجزيئات في التهاب الدماغ الحاد، في الموقع التهجين اكتشاف الجينوم MCMV والملاحظة المباشرة للجسيمات M32-EGFP-MCMV أو ميكروبيدات الفلورسنت ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في النماذج الحيوانية، ICV، داخل الصفاق، المشيمة مباشرة، والتهابات الرابع تم استخدامها لدراسة التسبب في التهاب الدماغ الفيروسي. ركزنا على ICV وحقن الرابع نماذج من الفئران حديثي الولادة لبساطة الإجراءات والاستفادة من الحقن المباشر للجزيئات في المنطقة المستهدفة. على الرغم من أن العدوى داخل الصفاق هو وسيلة سهلة، والجسيمات الفيروسية تنتشر بشكل منتظم عن طريق 5،24 عملية غير مباشر. عدوى المشيمة المباشر هو طريقة جيدة لدراسة العدوى النظامية الجنينية. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب تد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون السيد ماساكي كانيتا والسيدة هيرومي سوزوكي والسيدة ميتسو كاواشيما (قسم علم الأمراض التجديدية والمعدية ، كلية الطب بجامعة هاماماتسو) على مساعدتهم الفنية الممتازة. تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم ، منحة KAKENHI رقم 23590445.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| تريس ؛ تريس (هيدروكسي ميثيل) - أمينوميثان | سيجما ألدريتش | T-6791 | |
| حمض الهيدروكلوريك | سيجما ألدريتش | H-1758 | |
| pEGFP-N1 ناقلات ؛ | Clontech | # 6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM البوليسترين الفلوري النيل الأحمر 0.04 - 0.06 | Spherotech، Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM البوليسترين الفلوري النيل الأحمر 0.1 - 0.3 | Spherotech، Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM البوليسترين الفلوري النيل الأحمر 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| مصل الماوس 10٪ | DAKO | X0910 | |
| C57BL / 6 ماوس | SLC، Inc. | ||
| ماوس ICR | SLC، Inc. | ||
| محاقن ميكرولتر معدلة (سلسلة 7000) | شركة | ||
| إبرة قياس 35 | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet (R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| عازلة سترات (درجة الحموضة 6) × 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100 مل | |
| بيبسين | سيجما ألدريتش | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| فورماميد | TCI | F0045 | |
| ملح كبريتات ديكستران الصوديوم | سيجما ألدريتش | 42867-5G | |
| دينهاردت محلول (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| الخميرة tRNA (10 مجم / مل) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| شركة Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| مختبرات ناقلات | B4 المترافقة مع FITC | L1104 | |
| مكافحة الماوس CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong & nbsp ؛ الذهب | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
المراجع
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
