يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الأمثل الفيروسة البطيئة إنتاج وزراعة الخلايا الشروط الضرورية لبنجاح خلايا تنبيغ الإنسان الشعبي الأساسي طلائي

19.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54176

⸱

يوليو 22, 2016

 ,  , 
1Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care, and Sleep Medicine, University of Miami, Miller School of Medicine, 2Department of Cell Biology, University of Miami, Miller School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يصعب نقل الخلايا الظهارية القصبية البشرية الأولية. يصف هذا البروتوكول إنتاج فيروسات العدسات وتركيزها بالإضافة إلى ظروف الثقافة المثلى اللازمة لتحقيق عمليات نقل عالية الكفاءة في هذه الخلايا خلال التمايز إلى ظهارة كاذبة.

الملخص

في الثقافة المختبر من خلايا الإنسان الأولية الظهارية الشعب الهوائية (HBE) باستخدام الظروف واجهة الهواء السائل يوفر نموذجا مفيدا لدراسة عمليات تمايز الخلايا الهوائية وظيفة. في السنوات القليلة الماضية، واستخدام ناقلات lentiviral للتسليم التحوير أصبح ممارسة شائعة. في حين أن هناك تقارير تنبيغ الهوائية الخلايا الظهارية متباينة تماما مع بعض lentiviruses كتبته الزائفة غير بفيروس نقص المناعة البشرية، وكفاءة تنبيغ الشاملة هي عادة ما تكون أقل من 15٪. بروتوكول المقدمة هنا يوفر طريقة موثوقة وفعالة لإنتاج lentiviruses وتنبيغ الخلايا الظهارية الشعب الهوائية الإنسان الأساسية. استخدام الخلايا الظهارية القصبية غير متمايزة، تنبيغ في وسائل الإعلام نمو الظهارية الشعب الهوائية، في حين أن نعلق الخلايا، مع تعدد العوامل إصابة 4 يوفر الكفاءات قريبة من 100٪. يصف هذا البروتوكول، خطوة بخطوة، وإعداد وتركيز ناقلات lentiviral ارتفاع عيار والعشرينعملية تنبيغ ه. ويناقش التجارب هي التي تحدد شروط الثقافة الأمثل لتحقيق transductions ذات كفاءة عالية للخلايا الظهارية القصبية الإنسان الأساسية.

المقدمة

وقد وفرت تطوير، lentiviruses pseudotyped-تكرار معيب (LV) الباحثين وسيلة آمنة وفعالة لتوصيل الجينات المحورة في المختبر 1. بسبب التعبير على المدى الطويل، يمكن لهذه LV أيضا أن تستخدم لإيصال العوامل العلاجية في الجسم الحي 2،3. إنتاج LV يتطلب شارك في ترنسفكأيشن الكلى الجنينية البشرية (كلوة) خلايا مع العديد من البلازميدات: ناقل نقل، هفوة التعبئة والتغليف / بول، مراجعة التعبئة والتغليف، ومغلف حويصلي فيروس التهاب الفم بروتين سكري (VSV-G) البلازميدات. تعتبر أنظمة التعبئة والتغليف الجيل الثالث أكثر أمانا من أنظمة الجيل الثاني ليتم ترميز الجينات تزيد السرعة على البلازميد التعبئة والتغليف منفصلة، ​​مما يقلل من إمكانية إعادة التركيب لإنتاج تكرار الفيروسة البطيئة المختصة. على الرغم من أن أنظمة التعبئة والتغليف الجيل الثاني المحصول الكلي خمس وحدات التنبيغ أعلى أضعاف، وانقسام الجينوم الفيروسي الأصلي لخلقانخفض نظام الجيل الثالث على مستوى تنبيغ فقط الحد الأدنى 3،4.

بينما خطوط الخلايا يمكن transduced أكثر سهولة وكفاءة، تحولت الباحثين تركيزها على الخلايا الأولية، لأن هذه هي أكثر تمثيلا في الجسم الحي الأنسجة 5،6. ومع ذلك، الخلايا الأولية مستعصية على تنبيغ. في حين تم الإبلاغ عن تنبيغ الخلايا الظهارية مجرى الهواء متباينة تماما، لم تتجاوز الكفاءة العامة 15٪ 7.

وصفت هنا هو عبارة عن بروتوكول يتيح إنتاج لفس ارتفاع عيار. ويرد نهج خطوة بخطوة لتحقيق ما يقرب من 100٪ كفاءة ترنسدوكأيشن إلى خلايا HBE الأولية. وبشكل أكثر تحديدا، يصف بروتوكول الظروف المثلى ثقافة دور أساسي للنجاح 3. لفترة وجيزة، و transfected الخلايا 293T كلوة باستخدام lentiviral pCDH ناقلات التعبير مع EF-1 المروج القيادة التعبير عن تعزيز الفلورية الخضراء بروتين (EGFP) أو mCherry، وهو بروتين أحمر فلوري، ونظام التعبئة والتغليف من الجيل الثالث. يتم جمع لفس صدر في وسائل الإعلام 24-72 ساعة في وقت لاحق. تتركز جزيئات الفيروس مع البولي ايثيلين جلايكول (PEG)، وهي طريقة مريحة وسهلة للتركيز الفيروسي، قبل تقدير عيار استخدام عدة انزيم مرتبط P24 مستضد المناعي فحص (ELISA). وفي وقت لاحق، وtransduced خلايا HBE الأولية غير متمايزة في وسائل الاعلام انتشار (القصبي متوسط ​​النمو الظهاري أو BEGM) 8، في حين يعلق (بعد أن trypsinized)، في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) عامل 4، مضيفا بروميد hexadimethrine واحتضان لمدة 16 ساعة ( بين عشية وضحاها). ثم يسمح للخلايا للتمييز. منذ يتم التعبير عن التحوير الفيروسي على المدى الطويل (باستخدام المروج المناسب، انظر المناقشة)، وسيتم الحفاظ التعبير في جميع أنحاء التمايز في ظهارة الهوائية كاذبة أو يمكن أن يتسبب (باستخدام المروج محرض) بعد التمايز.

الحمار = "jove_content"> هذا البروتوكول هو من اهتمام واسع للباحثين الذين يرغبون في استخدام خلايا HBE الأولية بدلا من خطوط الخلايا، ويمكن أن تكون قابلة للتكيف مع غيرها من الصعب تنبيغ أنواع الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. المرحلة 1: ثقافة كلوة 293T

  1. إعداد خلايا كلوة وسائل الإعلام (على النحو المشار إليه وسائل الإعلام كلوة) وذلك بإضافة 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ (ت / ت) البنسلين / الستربتومايسين إلى ارتفاع نسبة الجلوكوز Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM).
  2. طبقة واحدة 10 سم صحن زراعة الأنسجة مع الكولاجين الأول ميكس 30 ميكرولتر من الكولاجين أنا في 2 مل من الماء المقطر. نشر هذا المزيج على طبق واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  3. إزالة المزيج وترك الجافة طبق في مجلس الوزراء تدفق الصفحي لمدة 15 دقيقة.
  4. لوحة الخلايا كلوة على طبق المغلفة في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 6 خلايا في 10 مل سائل الإعلام كلوة واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  5. عندما خلايا كلوة هي 50-60٪ متكدسة (الشكل 1A، 2-3 أيام بعد الطلاء)، انتقل إلى مرحلة 2. التقييم البصري من confluency كافية. ليس هناك حاجة إلى تقدير.
    ملاحظة: خلايا كلوة يتم تربيتها في وسائل الإعلام كلوة (انظر أعلاه). عندما تصل confluency، رمهلا يمكن تقسيم (مثل 1/5) أو المجمدة أسفل لاستخدامها لاحقا.

2. المرحلة 2: الإنتاج وتركيز Lentiviruses (لفس) في خلايا كلوة

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ البروتوكولات بما يتماشى مع اللوائح المؤسسية والحكومية تحت + (تعزيز BSL-2) الأوضاع في الولايات المتحدة الأمريكية BSL-2.

  1. (كانت lipofectamine وغيرها من العوامل ترنسفكأيشن يست فعالة مثل إجراء هطول الكالسيوم) Transfect باستخدام إجراء هطول الكالسيوم. من المستحسن استخدام مجموعة ترنسفكأيشن التجارية لضمان إعادة الإنتاج، على الرغم من تعديل الإجراء على النحو التالي. تقديم جميع الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة. هذا هو اليوم 0.
  2. لكل طبق 10 سم من خلايا HEK293، مزيج 4.5 ميكروغرام من المغلف الحمض النووي pMD2-VSVG، 7.5 ميكروغرام تغليف الحمض النووي pMDLg / pRRE، 3.75 ميكروغرام الحمض النووي pRSV-لفة، 10 ميكروغرام الحمض النووي من ناقلات التعبير lentiviral، 86 ميكرولتر من محلول 2 M الكالسيوم ، والماء المعقم في أنبوب الطرد المركزي 15 مل إلى الحجم النهائي من 700 ميكرولتر(ترد اثنين الحلول الأخيرة في عدة ترنسفكأيشن التجارية).
  3. قطرة من الحكمة، إضافة 700 ميكرولتر من مخزنة المالحة HEPES-2X (HBS، المنصوص عليها في عدة ترنسفكأيشن)، في حين vortexing ل(في مجلس الوزراء تدفق الصفحي)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (تنفيذ الخطوة 4 أثناء انتظار).
  4. خلال فترة الحضانة في وقت مبكر، إيداع 5 ميكرولتر من مزيج على شريحة. تحقق الحبرية تحت المجهر مع الهدف 10X، مع التركيز ببطء صعودا وهبوطا. وينبغي أن يكون راسب غرامة مرئية، مما يؤكد عملية ترسيب فوسفات الكالسيوم (الشكل 1B).
  5. توقف هطول الأمطار بعد 30 دقيقة وذلك بإضافة 10 مل من كلوة الخلايا وسائل الإعلام وماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج.
  6. خذ طبق من خلايا كلوة من الخطوة 2.1-2.5، وإزالة المتوسطة (يوم 0). إضافة الحل راسب من الخطوة 2.5 بعناية وببطء على طول حافة الطبق.
  7. في اليوم التالي (يوم 1)، إزالة والتخلص من المتوسط ​​تحتوي على راسب واستبدالها ثإيث 10 مل من كلوة المتوسطة. تحقق من وراسب غرامة تحت المجهر: يجب أن تكون مرئية في طبق في المساحات الفارغة بين الخلايا (أرقام 1C ود).
  8. في يوم 2، وجمع وسائل الإعلام مع حقنة والتصفية من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرون في أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على 3.8 مل من 40٪ البولي ايثيلين جلايكول (PEG) حل. عكس 5X لخلط وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة (للPEG يعجل في تشكيل، ولكن لا تزيد عن 5 أيام) حتى كل من مجموعات الفيروسات هي كاملة.
  9. كرر الخطوة 2.8 في أيام 3 و 4. في يوم 4 لا تحل محل مع كلوة المتوسطة ولكن يطهر مع التبييض 10٪ وتجاهل الطبق.
  10. الطرد المركزي جميع أنابيب جمع (عادة جميع المجموعات معا في يوم 5) في 1650 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير الفيروس. إزالة والتخلص من طاف، وتدور مرة أخرى في 1650 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لجمع وإزالة أي المتبقية من PEG طاف.
  11. Resusيعتمدون بيليه من كل أنبوب في 200 ميكرولتر من الشعب الهوائية متوسطة النمو الظهاري (BEGM) دون أمفوتيريسين ب 8. تجمع بعضهم البعض، وقسامة في 200 ميكرولتر. فيروس مخزن في -80 درجة مئوية. قسامة من 10 ميكرولتر إضافية لأداء HIV-1 الكمامة (P24) المستضد ELISA الفحص.
  12. استخدام عدة ELISA التجارية، إجراء الفحص الجيني p24 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. الفحص يعطي تقديرا للP24 الفيروسي في الغرام / مل.

3. المرحلة 3: خلايا الثقافة الابتدائية HBE

  1. لوحة الخلايا HBE في 10 مل BEGM وسائل الإعلام (مع 100 ميكرولتر الأمفوتريسين B إذا تم استخدام مرور 0 خلايا للقضاء على التلوث الفطري ممكن) في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 6 الخلايا في الكولاجين أنا المغلفة صحن 10 سم زراعة الأنسجة. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. في اليوم التالي، وإزالة المتوسطة واستبدالها مع 10 مل BEGM (مع 100 ميكرولتر الأمفوتريسين B للمرور 0 الخلايا) ليصبح المجموع 4 أيام. العودة إلى الحاضنة.
  3. بعد 4 دآيس، واستخدام BEGM فقط دون وسائل الاعلام أمفوتيريسين B. تغيير كل يوم.
  4. عندما الخلايا هي 80-90٪ متكدسة (الشكل 2A؛ ~ 7 أيام بعد الطلاء)، والمضي قدما مع التنبيغ (الالتفات إلى 3.5 لإعداد قبل تنبيغ). مرة أخرى، وتقييم البصرية من confluency كافية. ليس هناك حاجة إلى تقدير.
  5. قبل تنبيغ، معطف إدراج الدعم قابلة للاختراق مع حل الكولاجين الرابع مخففة 1/10 بالماء المقطر المعقم. إضافة 200 ميكرولتر من كل إدراج وترك بين عشية وضحاها الجاف في مجلس الوزراء تدفق الصفحي.

4. المرحلة 4: تنبيغ من خلايا HBE

  1. إزالة وسائل الإعلام، إضافة 3 مل من 0.1٪ التربسين في 1 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل في الفوسفات مخزنة المالحة (EDTA / PBS)، واحتضان 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. الاختيار تحت المجهر (الهدف 10X) لمعرفة ما إذا كان يتم فصل كل الخلايا. إن لم يكن، والعودة إلى الحاضنة لمدة 5 دقائق إضافية.
  2. عندما يتم فصل كل الخلايا، إضافة 3مل من مثبط التربسين فول الصويا (SBTI 1 ملغ / مل)، وخلط ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. بيليه الخلايا من خلال الدوران في 460 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة طاف بيليه resuspend في 3 مل من BEGM والمضي قدما في العد.
  4. Resuspend الخلايا HBE (الآن مرور 1 أو P1) على نسبة 2 × 10 5 خلايا لكل واحد 12 ملم قابلة للاختراق إدراج الدعم في 400 ميكرولتر من BEGM (انظر الجدول 2). استقراء هذه الأرقام على أساس كمية من إدراج دعم نفاذية التي سيتم transduced.
سطح مساحة السطح تعداد الخلايا وسائل الإعلام حجم (وسائل الإعلام)
صحن 10 سم 52.7 سم 2 1 × 10 6 BEGM 10 مل
تصفية 12 ملم 1.13 سم 2 2 × 10 5 BEGM 400 ميكرولتر
تصفية 24 ملم 4.52 سم 2 8 × 10 5 BEGM 800 ميكرولتر

الجدول 2: وسائل الإعلام الاستقراء في عدد خلايا.

  1. باستخدام وافر من العدوى عامل (وزارة الداخلية) 4، إضافة الحجم المناسب من الفيروس إلى الخلية تعليق.
  2. إضافة بروميد hexadimethrine إلى 2 ميكروغرام / مل تركيز النهائي.
  3. الاستغناء عن 400 ميكرولتر من مزيج (BEGM، HBE الخلايا، الفيروسات وبروميد hexadimethrine) في إدراج دعم منفذة في حجرة قمي، وإضافة 1 مل من BEGM وحده إلى مقصورة basolateral. احتضان ليلا 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. خلايا دائما لوحة HBE دون الفيروسات، والتحكم واختيار اختبار بوروميسين إن وجدت.
  4. في اليوم التالي، عينيوسائل الإعلام قمي وbasolateral الامد، ويغسل مع برنامج تلفزيوني، واستبدال كل من المقصورات مع واجهة الهواء السائل (علي) وسائل الاعلام 8.
  5. عندما متموجة الخلايا، وإزالة السوائل القمي (المعروف باسم إنشاء واجهة الهواء السائل). نستمر في تغيير المتوسطة (علي) في حجرة أسفل كل يوم حتى تصل إلى مرحلة النضج الكامل. في وقت لاحق عادة 3-4 أسابيع.
    ملاحظة: إذا كان يحتوي على ناقلات lentiviral جين اختيار مثل بوروميسين، وخلايا يمكن اختيار بإضافة بوروميسين وفقا لمنحنى تركيز الاختيار. لخلايا HBE، وقد تم تحديد تركيز 1 ميكروغرام / مل لتكون مثالية لاختيار متسقة من الخلايا transduced. ومع ذلك، قد تختلف هذه تركيز للخلايا أو غيره من الظروف وينبغي أن تحدد عن طريق قتل المنحنيات. إضافة بوروميسين يمكن أن تبدأ في وقت مبكر من يوم واحد بعد أن تم استبدال وسائل الاعلام وسائل الاعلام ALI أو في وقت لاحق (2-3 أيام) للسماح للتعبير الكامل للجين الاختيار. تأكد من إضافة بوروميسين لإدراج واحد أن حكما لم يتم transduced. يمكن إضافة بوروميسين حتى تتمايز الخلايا بشكل كامل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الشكل 1 يصور الخطوات الرئيسية المختلفة لتقييم الخلايا وحلول أثناء عملية ترنسفكأيشن. الشكل 1A يظهر confluency الأمثل للخلايا HEK293T قبل ترنسفكأيشن لإنتاج الفيروس. من المهم أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء الطبق. 1B الشكل يكشف راسب في قطرة من خليط ترنسفكأيشن باستخدام البصريات مجال مشرق والهدف 10X. أكثر من رواسب تبدو وكأنها حبيبات الرمل بدلا من الكتل، وأكثر كفاءة ترنسفكأيشن يكون. في هذه ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول المذكورة هنا يؤكد ما يقرب من 100٪ من الكفاءة تنبيغ. ومع ذلك، هناك خطوات خلال العملية التي تعتبر مهمة لتحقيق هذا الهدف. على سبيل المثال، أثناء عملية ترنسفكأيشن، وجود رواسب في مزيج التنبيغ (قطرة) أو في طبق اليوم بعد تنبيغ (أرقام 1B ود) وكلاهما ذات الصلة لترنسفكأيشن جيد. غياب راسب أو وجود تكتلات ويمكن أن يعزى ذلك إلى إغفال واحدة من الكواشف ترنسفكأيشن، قضية الحموضة، أو إعداد البلازميد سيئة. إذا كان راسب مفقود، وهناك احتمال كبير أن أيا منها لن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر الوكالة الحياة التحالف الجهاز الانتعاش من جامعة ميامي لتوفير الرئتين. كما نشكر الدكتورة ليزا Künzi لإعداد الحمض النووي المستخدمة في التجارب هو مبين في الشكل 2B و 3-D، الدكتور بن Gerovac وليزا نوفاك لفيروس mCherry المستخدمة في التجارب في الأرقام 3A إلى C. كما نشكر غابرييل Gaidosh من مرفق التصوير، قسم طب العيون في جامعة ميامي.

وقد رعت هذه الدراسة من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، ومؤسسة التليف الكيسي ومضيفات معهد البحوث الطبية الدكتور ماتياس Salathe.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
HEK293T/17 خليةATCCCRL-11268
مصل الأبقار الجنينية (FBS)  استخدام Sigma12306Cعند 10٪
DMEMThermo Scientific11995-040
البنسلين / الستربتومايسين (100x)استخدام Thermo Scientific15140-122في 1x
Collagen IBD Biosciences354231تخفيف 1:75 في الماء المقطر
CalphosClontech631312طقم تعداء يحتوي على محلول كالسيوم 2 م ، 2x محلول HEPES-Buffered (HBS) ومعقم H2< / sub>O
Polythylene glycol 8000VWR Scientific101108-210مخزون 40٪
أمفوتريسين BSigmaA9528يستخدم في 1x
TrypsinSigmaT4799
مثبط التربسين فول الصوياSigmaT9128
Transwell 12 ممCorning3460
Collagen IVSigmaC7521مخفف 1:10 في الماء المقطر
Hexadimethrine bromideSigmaH9268مخزون 2 مجم / مل
بوروميسين (10.000x)استخدام Thermo ScientificA11138-03في 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISAPerkinElmerNEK050001KT
F12Thermo Scientific11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-PuroSystem BiosciencesCD532A-2ناقلات التعبير الفيروسي
pMD2-VSVGAddgene12259التعبئة والتغليف الحمض النووي
pMDLg / pRREAddgene12251التعبئة والتغليف الحمض النووي
pRSV-revAddgene12253الحمض النووي التعبئة والتغليف

المراجع

  1. Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
  2. Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
  3. Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
  4. Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
  5. Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
  6. Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
  7. Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
  8. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
  9. Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
  10. Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
  11. Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
  12. Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
  13. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
  14. Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
  15. Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
  16. Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
  17. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
  18. Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
  19. Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
  20. Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
  21. Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
  22. Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
  23. Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

كفاءة التنقيلتعددية العدوىالواجهة الهوائية السائلةترانسفكشن خلايا HEK293ترسيب فوسفات الكالسيومتركيز الفيروسالترسيب باستخدام البولي إيثيلين جلايكولوسط نمو الظهارة الشعبية
الأمثل الفيروسة البطيئة إنتاج وزراعة الخلايا الشروط الضرورية لبنجاح خلايا تنبيغ الإنسان الشعبي الأساسي طلائي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.