لقد طورنا طريقة إصابة الأعصاب لفحص تعصيب العضلات بشكل موثوق ، وبالتالي تجديد الوصلات العصبية العضلية في الفئران. تتضمن هذه التقنية إصابة العصب الشظوي المشترك عن طريق جراحة بسيطة وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة. إعادة تعصيب العضلات في ثم تقييم عن طريق تركيب العضلة الباسطة الطويلة بالكامل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العصب الشظية الإصابات الطريقة: مقايسة موثوقة لتحديد واختبار العوامل التي إصلاح العضلية المفارق
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الوصل العصبي العضلي (NMJ) يخضع لتغيرات هيكلية ووظيفية الضارة نتيجة للتقدم في السن والإصابات والأمراض. وبالتالي، لا بد من فهم التغيرات الخلوية والجزيئية تشارك في صيانة وإصلاح لل NMJs. لهذا الغرض، قمنا بتطوير طريقة وبشكل متواصل لدراسة تجديد لل NMJs في الفئران. هذه الطريقة إصابة العصب ينطوي على سحق العصب الشظوي المشترك لأنه يمر فوق الرأس الوحشي من وتر عضلة الساق بالقرب من الركبة. استخدام 70 يوم إناث الفئران القديمة، علينا أن نبرهن على المحاور الحركية تبدأ reinnervate الأهداف بعد المشبكي السابقة خلال 7 أيام بعد سحق. انهم إعادة احتلال المناطق تماما متشابك السابقة من قبل 12 يوما. لتحديد موثوقية هذه الطريقة الإصابة، قارنا معدلات عودة التعصيب بين الأفراد 70 يوم إناث الفئران القديمة. وجدنا أن عدد المواقع بعد المشبكي reinnervated مماثل بين الفئران في 7 و 9 و 12 يوما بعد سحق. لتحديد ما إذا كانويمكن أيضا أن هذا الاختبار إصابة استخدامها لمقارنة التغيرات الجزيئية في العضلات، درسنا مستويات غاما فرعية من مستقبلات العضلات النيكوتينيك (غاما الاستشاري لحقوق الإنسان) وكيناز العضلات محددة (المسك). الوحيدات غاما الاستشاري لحقوق الإنسان والمسك لوupregulated للغاية إزالة التعصيب التالية والعودة إلى مستويات طبيعية بعد عودة التعصيب من لل NMJs. لقد وجدنا علاقة وثيقة بين مستويات النص لهذه الجينات ووضع تعصيب العضلات. ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب سيعجل فهمنا للتغيرات الخلوية والجزيئية تشارك في إصلاح NMJ ونقاط الاشتباك العصبي الأخرى.
المقدمة
في الشابة السليمة ، يعد الوصلة العصبية العضلية (NMJ) اتصالا مستقرا للغاية بين ما قبل المشبك ، والنهاية العصبية لمحور عصبي α حركي ، وما بعد المشبك ، وهي المنطقة المتخصصة في ألياف عضلية خارج الغشاء حيث تتجمع مستقبلات أستيل كولين النيكوتين (AChRs) بشكل انتقائي1. يعد التعيين المثالي تقريبا للأجهزة قبل وبعد التشابك ضروريا للنقل العصبي السليم ، وبقاء الخلايا العصبية ذات الحركية α والألياف العضلية والوظيفة الحركية. لسوء الحظ ، تتأثر وظيفة NMJ سلبا بالشيخوخة والأمراض مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) وأمراض المناعة الذاتية وإصابة العضلات والأعصاب الطرفية2-5. غالبا ما تؤدي هذه الإهانات إلى تنكس النهايات العصبية قبل المشبكية ، مما يترك العضلات منزوعة التعصيب ويغير المهارات الحركية بشكل كبير. لهذا السبب ، أصبح تحديد الجزيئات التي تعمل على الحفاظ على NMJ وإصلاحه أولوية. نظرا لأن الأعصاب الطرفية تجدد الأهداف وتعصبها ، فقد تم استخدام نماذج إصابة الأعصاب الطرفية لتحديد التغيرات الجزيئية المرتبطة بتجديد NMJs.
غالبا ما تتضمن نماذج إصابة الأعصاب الطرفية < p class = 'jove_content '> إما قطع أو سحق فروع عصبية معينةتماما 6. بعد القطع ، يجب إصلاح الأنبوب العصبي ، مما يؤخر التجديد المحوري وتعصيب الخلايا والأنسجة المستهدفة. تؤدي شدة هذا النوع من الإصابات أيضا إلى تعرج المحاور العصبية بعيدا عن مسارها الأصلي ، مما يؤدي إلى فشلها في الوصول إلى الأهداف الأصلية. هذا على عكس الأعصاب المصابة عن طريق السحق حيث يظل العصبية الداخلية متجاورة ، مما يوفر مسارا لإعادة النمو الفعال والسليم للمحاور المتجددة. كما أنه يسمح للمحاور بالعثور على شركائها الأصليين من ألياف العضلات وإعادة تعصيبهم. بغض النظر عن نموذج الإصابة ، هناك عدد من التغييرات الخلوية والجزيئية التي يجب أن تحدث حتى تتمكن المحاور من تجديد الأهداف وتعصيبها. بعد الإصابة ، يتم تكسير الجزء العصبي القريب من الهدف وإزالته عبر عملية تسمى التنكس الحجري7. تتضمن هذه العملية إعادة برمجة خلايا شوان وإزالة التمايز فيها إلى خلايا غير مائية تفرز عوامل التجدد ، وتزيل المايلين ، وتجنيد البلاعم في موقع الإصابة8. تكمل البلاعم بدورها إزالة المايلين والحطام المحوري ، مما قد يعيق نمو المحور العصبيالمتجدد 9. في موازاة ذلك ، تنشط الخلايا العصبية الحركية والحسية الآليات اللازمة لتعزيز تجديد محاورها المقطوعة. بمجرد أن يصل المحور العصبي المتجدد إلى الهدف ، يجب أن يتحول من مخروط نمو إلى نهاية عصبية قادرة على نقل المعلومات بشكل صحيح (للمحاور الحركية) أو تلقي (للمحاور الحسية)10. في هذا الصدد ، تخضع محاور ألفا الحركية لسلسلة من التغييرات المنسقة جيدا والتي تبلغ ذروتها في تمايز مخروط نموها إلى نهاية عصب قبل المشبكي تعمل بكامل طاقتها والتي تتعارض تماما تقريبا مع موقع ما بعد التشابك على ألياف العضلاتالمستهدفة 11.كانت الأعصاب الوركي والظنبوب والملحقات هي الخيارات الأساسية لدراسة تجديد المحور وNMJ12-14. ومع ذلك ، هناك عدد من العيوب عند استخدام هذه النماذج لفحص التغيرات الخلوية والجزيئية المرتبطة بتجديد NMJs بين وفي ظل ظروف مختلفة. أولا ، يمد العصب الوركي غالبية عضلات الطرف الخلفي ، مع إصابة تحد بشكل كبير من الحركة والإحساس. لذلك لا يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة تأثير التمرين بمفرده أو بالاشتراك مع عوامل أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العصب الوركي عبارة عن بنية سميكة إلى حد ما وبالتالي يتطلب قدرا كبيرا من قوة الضغط لإصابة جميع المحاور بالكامل. وهذا بدوره قد يؤدي إلى القطع الكامل للمحاور العصبية الأكثر سطحية مع ترك الأنبوب العصبي للمحاور الكذبة العميقة سليمة ، مما يؤدي إلى تباين كبير في معدل ودقة التجديد بين هذه المحاور. يعد القطع الكامل لهذا العصب أقل رغبة نظرا لأن العديد من المحاور العصبية ستفشل في إعادة الاتصال بنفس ألياف العضلات. مما يزيد الأمور تعقيدا ، أن العصب الوركي يمتلك تباينا تشريحيا جوهريا ، سواء في عدد وموقع منشأ فروع الأعصاب الطرفية. لذلك من الصعب جدا الإصابة في نفس الموقع. في حين أن العصب الظنبوبي أصغر حجما وأكثر قابلية لسحق الإصابات ، إلا أنه لا يوجد أيضا معلم متاح بسهولة ليكون بمثابة موقع آفة لهذا الفرع العصبي.
كما تم استخدام فرع العصب الإضافي (جزء من العصب القحفي الحادي عشر) الذي يغذي العضلة القصية الترقوية الخشائية لدراسة تجديد NMJs15. هذا العصب جذاب بشكل خاص لأنه يمكن تصوير NMJs في العضلة القصية الترقوية الخشائية بسهولة أكبر في الحية مقارنة ب NMJs في العضلات الأخرى. ولكن على غرار الأعصاب الوركي والظنبوبي ، لا يوجد معلم محدد يمكن استخدامه لإصابة هذا العصب في نفس الموقع ، مما يحده كنموذج لمقارنة تجديد NMJs بين الفردية في مجموعة تجريبية. يقدم موقع الآفة غير المتسق تباينا في معدلات إعادة تعصيب NMJ. بسبب أوجه القصور هذه ، يستخدم الإجراء المقدم هنا إصابة فرع عصبي محيطي مختلف لفحص NMJs المتجددة.
يحتوي >jove_content<العصب الشظوي المشترك ، المعروف أيضا باسم العصب الشظوي المشترك ، والذي يطلق عليه أيضا العصب الشظوي المشترك ، على العديد من الميزات التي تجعله عصبا موثوقا به لفحص تجديد NMJs بين وعبر العلاجات المختلفة. العصب الشظوي المشترك له مسار تشريحي يمكن التنبؤ به لأنه يمر فوق وتر الرأس الجانبي لعضلة المعدة في الركبة ، ويعمل التقاطع كمعلم مستقر للآفات. يتم الوصول إلى العصب من خلال شق صغير طفيف التوغل بالقرب من العضلات محل الاهتمام ولكن منفصلا تشريحيا. توضح النتائج المقدمة هنا أن المحاور الحركية المتجددة تبدأ في إصلاح NMJs في عضلة الباسطة الأصابع الطويلة (EDL) بعد 8 أيام من سحق العصب الشظوي في إناث الفئران الشابة البالغة البالغة 70 يوما. الأهم من ذلك ، أن نمط ومعدل إعادة التعصيب متسقان بين من نفس العمر والجنس ، وبالتالي يوفر نموذجا موثوقا للإصابة من شأنه أن يسرع بشكل كبير من فهمنا للتغيرات الخلوية والجزيئية المطلوبة للحفاظ على NMJs وإصلاحها.الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت جميع التجارب تحت المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة والبروتوكولات الحيوانية التي وافقت عليها لجنة جامعة فرجينيا للتكنولوجيا المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام.
1. الحيوانات التحضير لجراحة
- تخدير الفئران مع خليط من الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن تحت الجلد الإربي مع معقمة 1 مل حقنة الأنسولين. يحتوي الحل الناقل خليط من المياه المالحة 0.9٪ و 17.4 ملغ / مل الكيتامين و 2.6 ملغ / مل زيلازين. وضع الحيوانات مرة أخرى في أقفاص في انتظار الدواء إلى حيز التنفيذ.
ملاحظة: إذا لم جرعة التحميل توفر التخدير كافية لمدة الإجراء، قد يتم حقن إضافية 25٪ من جرعة التحميل. - الحيوانات رصد وظيفة في حقن للتحقق من وتيرة التنفس ثابتة والاكتئاب المناسب من مستويات الإثارة. التحقق من مستوى الإثارة مع قليل القدم الخلفية، والتي ينبغي أن تثير أي رد عندما تخدير بما فيه الكفاية.
ملاحظة: هذه عادة ما يستغرق 3-5دقيقة لالماوس الشباب البالغين بمعدل 25 إلى 30 غراما. إذا كان هذا الحيوان لا يزال استجابة بعد 10 دقيقة بعد الحقن، ويمكن حقن إضافية 25٪ من جرعة التحميل التخدير. - تطبيق الفازلين والزيوت المعدنية الخفيفة مرهم للعين للعيون الحيوان لمنع جفاف. إزالة الحيوانات من القفص ومكان على سطح نظيف ومستو. حلق أطرافهم هند المطلوب من القدم إلى الحوض باستخدام الانتهازي الشعر الكهربائي، وفضح فقط الجانب الوحشي من أطرافهم.
- تطبيق مزيل الشعر الكيميائية إلى الموقع حلق لمدة 1 دقيقة. يدويا إزالة الشعر باستخدام مناديل المختبر. نظيفة منطقة نزعه مع مختبر محو غارقة في الايثانول.
2. إجراء العمليات الجراحية
- تعقيم الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم أو غيرها من طريقة المناسب. تنظيف الموقع الجراحي ومجلس الجراحي مع 80٪ من الإيثانول / H 2 0. تطهير موقع الجراحية مع proviodine. ضع الماوس على متن الجراحية وتتماشى مع القيود أطرافهم. احتفظعلى أطرافه الخلفية الهدف في وضع الطبيعي تشريحيا مع مفصل الركبة تمديد قليلا دون دوران داخلي أو خارجي.
- وضع الحيوان ومجلس تحت المجهر الجراحي. توجيه إلى موقع شق السليم عن طريق الجس من المعالم السطحية، وتحديدا في مفصل الركبة عظمي والتلال بين الأمامية الظنبوبي وعضلات الساق.
- إجراء شق حوالي 3 سم من خلال الجلد باستخدام مشرط أو الربيع مقص أثناء استخدام ملقط العامة التي تجتاح. جعل شق عمودي على مسار الكامنة وراء العصب الشظوي المشترك.
- مواصلة شق طريق اللفافة السطحية، وفضح الفخذية ذات الرأسين والعضلة المتسعة الوحشية العضلات. فصل هذه العضلات من خلال قطع اللفافة العميقة التي تربط. وينبغي أن يكون قطع 1-2 سم كافية.
- التراجع عن الفخذية ذات الرأسين العضلات caudally باستخدام الكامشات الميكانيكية، وكشف عن العصب الشظوي المشترك.
- تتبع العصب قريب حتى بين لتم العثور على القسم مع وتر الرأس الوحشي للعضلة الساق. ملاحظة: التعرض قد يتطلب معالجة إضافية من الجلد تراجع والعضلات. يستخدم هذا التقاطع باعتبارها معلما مستقر للإصابة العصب.
- فهم العصب مع ملقط غرامة، والتوفيق بين النصائح بطريقة موازية للالحدود الجانبية للوتر الساق. سحق العصب الشظوي المشترك من خلال تطبيق ثابت والضغط الجاد لمدة 5 ثوان.
- تأكيد سحق الكامل للعصب عن طريق التفتيش البصري من خلال نطاق العمليات الجراحية. وسوف تظهر شفافة في موقع الإصابة. إذا باستخدام الفئران معربا عن البروتينات الفلورية في المحاور الطرفية، ومضان تختفي من موقع الإصابة.
- إزالة مبعدات وإعادة ترتيب العضلات في مواقعها التشريحية. إغلاق موقع شق مع 6-0 خيوط الحرير. 1-3 خيوط متقطعة بسيطة كافية. وضع يتعافى الماوس على وسادة التدفئة في قفص نظيفة.
- رصد جميع الحيوانات لمدة 2 ساعة بعد الأوبرانشوئها للتحقق من التنفس وأي ردود فعل سلبية على التخدير. إدارة جرعة أولية من البوبرينورفين 0،05-0،10 ملغ / كغ عن طريق الحقن تحت الجلد الإربي مباشرة بعد التعافي من الجراحة. منح 3 جرعات إضافية كل 12 ساعة على مدى ساعة 48 القادمة. بعد الشفاء التام، والعودة الفئران إلى مرفق للرعاية الحيوان.
3. عزل وتلون باسطة إبهام اليد العضلات (مؤسسة كهرباء لبنان)
- تضحية الحيوانات باستخدام الأيزوفلورين. الاستغناء عن 0.5 مل الأيزوفلورين السائل في أنبوب 50 مل محملة labwipes ماصة. وضع أنبوب لم يسبق لهم اللعب مع الحيوان في مختومة 2500 سم 3 غرفة. لا يقل عن 4 دقائق من التعرض كافية. اختبار لفقدان جفني الثنائي، إصبع القدم قرصة، وردود الفعل ذيل قرصة لضمان أن كل حيوان فاقد الوعي قبل الشروع في الارواء.
- يروي Transcardially 16 الحيوانات لأول مرة مع 10 مل 0.1M برنامج تلفزيوني، ثم 25 مل من 4٪ لامتصاص العرق في 0.1M برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). الهيبارين (30 وحدة / 20غرام من وزن الحيوان) ويمكن إضافة مع برنامج تلفزيوني (10 وحدة / مل) لمنع تخثر الدم في سرير الشعرية الصغيرة، وتحسين النتائج الارواء.
- إزالة الجلد الذي يغطي أطرافه الخلفية باستخدام مقص لقطع عرضيا خلال الجلد حول محيط البطن. قشر أسفل الجلد الماضي أطرافه الخلفية والقدمين باستخدام ملقط.
- إزالة اللفافة السطحية من الأطراف الخلفية من خلال استيعاب وتقشير بالملقط. إذا باستخدام الفئران معربا عن البروتينات الفلورية في المحاور الطرفية، بعد إصلاح الفئران كله بين عشية وضحاها في PFA 4٪ في 50 مل أنابيب. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: الثابتة الفئران يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. إذا لم يكن كذلك، تخطي هذه الخطوة وانتقل إلى الخطوة 3.6 بدون حيوانات تحديد بعد. - تشريح خارج العضلات مؤسسة كهرباء لبنان 18 من الماوس أطرافه الخلفية، ويجري التأكد من الحفاظ القريبة والبعيدة الأوتار سليمة قدر الإمكان.
- احتضان العضلات مؤسسة كهرباء لبنان في عرقلة العازلة (1X PBS تحتوي على 0.5٪ تريتون X-100، 3٪ BSA و 5٪ مصل الماعز) لمدة 1 ساعة على الأقل.
- لتصور المحاور الحركية ومحطات أعصابهم والعضلات مكان في أنابيب تحتوي على خيط عصبي (1: 1000) وsynaptotagmin-2 (1: 250) الأجسام المضادة المخفف في عرقلة العازلة لمدة 3 أيام. غسل العضلات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X و 10 دقيقة في كل مرة. ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا باستخدام الفئران معربا عن البروتينات الفلورية (XFP) في المحاور الطرفية.
- وصمة عار على الجانب المقابل لم يصب بأذى مؤسسة كهرباء لبنان كعنصر تحكم إيجابية لكامل تعصيب NMJ. وينبغي أن يتضمن ضوابط السلبية على مؤسسة كهرباء لبنان التي تم الحصول عليها في 4 أيام بعد الإصابة، نقطة زمنية حيث NMJ غير المزالة التعصيب تماما، فضلا عن مؤسسة كهرباء لبنان الملون مع الأجسام المضادة الثانوية فقط.
- احتضان العضلات مع الأجسام المضادة الثانوية الموسومة fluorescently المناسبة للكشف عن خيط عصبي وsynaptotagmin-2 لمدة 1 يوم. غسل العضلات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X و 10 دقيقة في كل مرة. ملاحظة: يمكن أن تنفذ هذه الخطوة مع الخطوة 3.10. تخطي هذه الخطوة إذا باستخدام الفئران معربا عن البروتينات الفلورية في المحاور الطرفية.
- لتصور postsyالمنطقة naptic من NMJ، احتضان العضلات مع 5 ميكروغرام / مل اليكسا 555 مترافق ألفا بنغاروتوكسين المخفف في عرقلة العازلة لا يقل عن 2 ساعة. غسل العضلات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X و 10 دقيقة في كل مرة.
- لتركيب العضلات كلها على الشرائح الزجاجية موجبة الشحنة، ووضع العضلات مباشرة على الشريحة، إضافة بضع قطرات من الجلسرين المتوسطة القائمة على الشريحة المتزايدة، وتغطي مع ساترة. اضغط على ساترة ضد الشريحة لشد العضلات. نقع قبالة سائل الإعلام متزايدة من محيط الشريحة وساترة باستخدام مناديل المختبر. تطبيق طلاء الأظافر لختم حواف بين ساترة والشريحة.
4. التصوير وتحليل البيانات
- لتحليل بنية لل NMJs، صورة العضلات مؤسسة كهرباء لبنان باستخدام متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر مجهزة لإثارة 488، 555 و 633 نانومتر الخفيفة والتقاط الضوء المنبعث مع 20X 40X والأهداف.
- تصور كامل لل NMJs، وخلق أقصى قدر من الصور كثافة إسقاط ثانية البصريمتباعدة ستعقد 1-2 ميكرون تمتد بعيدا من أدنى إلى أعلى المناطق مرئية من NMJ. خلق توقعات كثافة القصوى باستخدام التصوير البرمجيات المتاحة تجاريا.
- لتحديد معدلات عودة التعصيب، تصنيف لل NMJs على النحو التالي: 1) المزالة التعصيب تماما = الموقع بعد المشبكي يخلو تماما من الاتصال مع المحور، أقل من 5٪ colocalization بين محور عصبي وACHRS. 2) معصب جزئيا = محور عصبي تتداخل جزئيا postsynapse، colocalization 5-95٪ بين محور عصبي وACHRS. 3) تعصيب كامل = تقريبا بدل المثالي بين قبل وبعد المشبك، أكبر من 95٪ colocalization بين محور عصبي وACHRS. استبعاد لل NMJs التي تقع عموديا على مستوى التصوير أو لا تصور بشكل كامل في الصورة. ملاحظة: في كل هذه التجارب، تم فحص لا يقل عن 3 الحيوانات و 50 لل NMJs لكل حيوان. واعتبرت نتائج هامة باستخدام الطالب اختبار t مع قيمة P أقل من 0.05.
- للتشويش على المشغل، يمكن للأفراد منفصل أداءالجراحة وصورة التحليل. دون معرفة مجموعات العلاج، يمكن للمحلل أن يكون موضوعيا مع NMJ التهديف. بدلا من ذلك، يمكن أن تكون الصور العشوائية وعرضها على مشغل للتحليل دون معرفة المصدر الحيواني.
5. الكمي PCR
- تضحية الحيوانات باستخدام الأيزوفلورين وخلع عنق الرحم. إزالة الجلد واللفافة السطحية التي تغطي عضلات الساق وفقا لخطوة 3.3. تشريح الأمامية الظنبوبي والعضلات مؤسسة كهرباء لبنان وفقا لخطوة 3.4.
- فلاش تجميد الأمامية الظنبوبي كامل والعضلات مؤسسة كهرباء لبنان في أنبوب 1.5 مل على النيتروجين السائل. إزالة أنسجة من أنبوب وضعها في هاون قبل المبردة المغمورة جزئيا في النيتروجين السائل. طحن العضلات المجمدة الى مسحوق ناعم باستخدام هاون ومدقة.
- حل مسحوق العضلات المجمدة إلى المتاحة تجاريا كاشف استخراج الحمض النووي الريبي وتنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي وإزالة الحمض النووي الجيني مع مجموعة المتاحة تجاريا وفقا لط الشركة المصنعةnstructions.
- أداء النسخ العكسي مع مزيج الناسخ العكسي المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- أداء QPCR استخدام عدة متاحة تجاريا باستخدام الجينات التدبير المنزلي المناسبة (انظر الجدول المواد). استخدام الكمي PCR cycler الحرارية المتاحة تجاريا لتنفيذ PCR (انظر الجدول المواد).
- ضبط درجة الحرارة الصلب إلى 58 درجة مئوية. ضبط المعلمات الدراجات إضافية لمواصفات الشركة المصنعة من مزيج الأخضر طق البلمرة / SYBR. تشمل خطوة منحنى ذوبان النهائية في برنامج cycler الحرارية التي تتكون من 0.5 درجة مئوية الزيادات الإضافية من 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية لاختبار خصوصية التمهيدي والتمهيدي تشكيل ديمر.
- تحديد مستويات التعبير مرنا النسبية عن طريق 2 - طريقة ΔΔCT 21 باستخدام 18S RNA كما الجين السيطرة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
العصب الشظوي المشترك، وتسمى أيضا العصب الشظوي المشترك، ينشأ من العصب الوركي فوق المبأبضية، حيث يتأرجح حول رأس الشظية على الجانب الأمامي للساق (الشكل 1A). هناك فروع لها في الأعصاب الشظوية سطحية وعميقة، جنبا إلى جنب تزويد dorsiflexors القدم وأصابع القدم (الأمامية الظنبوبي، باسطة إبهام اليد وخنصر اليد، وأباهيم قدمية الباسطة العضلات إبهام اليد)، وeverters القدم (عضلات الشظوية). كما يحمل هذا العصب الألياف الحسية التي توقع على ظهر القدم ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطريقة المعروضة في هذه المخطوطة يوفر فرصا فريدة لتحديد الآليات التي تشارك في إصلاح الوصلات العصبية والعضلية (NMJ). هذا الأسلوب ينطوي على سحق العصب الشظوي المشترك لأنها تمر على وتر الساق بالقرب من الركبة. وتبين لنا أنه بعد ثانية فقط 5 من ضغط العصب مع ملقط، يلاحظ انحطاط كامل من قبل 4 أيام بعد الإصابة. في الفئران الشباب البالغين، تبدأ محاور ألفا الحركية إلى reinnervate مواقع متشابك السابقة في عضلة باسطة إبهام اليد (مؤسسة كهرباء لبنان) في 7 أيام بعد الإصابة، وبلغت ذروتها في الاصلاح م...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون أعضاء مختبر فالديز على المدخلات الفكرية في التجارب والتعليقات على المخطوطة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Ketamine | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| بوبرينورفين | زوفارم | 1Z-73000-150910 | |
| ناير | ناير | ||
| كيم مناديل مبللة | Kimtech | 34155 | |
| ماكينة حلاقة كهربائية | برينتري Scientific | CLP-64800 | |
| 80٪ EtOH / H2< / sub>0 | |||
| 10٪ بروفيودين | |||
| 1 مل مقص | |||
| Vannas | 91500-09 | ||
| رقم 15 مشرط | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| # 5 ملقط | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 خياطة حريرية على إبرة القطع العكسية | ؛ خياطة اكسبريس | 752B | |
| وسادة تسخين القوارض | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| مجسات جزيئية | مترافقة alpha-BTX | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Microscope | أوليمبوس | 562037192 | |
| Zeiss 700 مجهر متحد البؤر | Zeiss | ||
| مضخة التروية التمعجية متغيرة التدفق | فيشر ساينتفيك | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet مرهم | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 | الأجسام المضادة للأجسام المضادة | ||
| عبر الإنترنت ABIN2475842 |
المراجع
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Front. Neurosci. 8, 252(2014).
- Apel, P. J., Alton, T., et al. How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats. J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).
- Balice-Gordon, R. J. Age-related changes in neuromuscular innervation. Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).
- Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PloS one. 7 (4), e34640(2012).
- Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Pre-existing pathways promote precise projection patterns. Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).
- Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration. Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).
- Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110(2011).
- Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury. Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).
- Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
- Geuna, S. The sciatic nerve injury model in pre-clinical research. J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. J. Vis. Exp. (81), e50657(2013).
- Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
- Feng, G., Mellor, R. H., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Bowen, D. C., Park, J. S., et al. Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction. Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).
- Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle. Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
