يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مجمع متضاعف الكتروليتي للهيبارين ربط تسليم عظمية عامل نمو المجال

7.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54202

⸱

أغسطس 22, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM), National University of Ireland Galway, 3Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore, 4Tissue Engineering Program, National University of Singapore, 5Department of Orthopaedic Surgery and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California, Los Angeles

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'> تم ترسيب مجمعات البولي إلكتروليت ذاتية التجميع (PEC) المصنعة من الهيبارين والبروتامين على حبات الجينات لاحتجاز وتنظيم إطلاق عوامل النمو العظمية. تتيح استراتيجية التسليم هذه تقليل جرعة BMP-2 بمقدار 20 ضعفا في تطبيقات دمج العمود الفقري. توضح هذه المقالة فوائد وتصنيع PECs.

الملخص

أثناء العمليات الجراحية الترميمية العظام، يتم تحميل كميات supraphysiological من عوامل النمو تجريبيا على السقالات لتعزيز نجاح الاندماج العظمي. مطلوبة جرعات كبيرة من العوامل البيولوجية قوية للغاية نظرا لعامل النمو عدم الاستقرار نتيجة لتدهور الأنزيمية السريع وكذلك عدم الكفاءة الناقل في توطين كميات كافية من عامل النمو في مواقع الزرع. وبالتالي، يمكن أن الاستراتيجيات التي تطيل استقرار عوامل النمو مثل BMP-2 / NELL-1، والسيطرة على الإفراج عنهم بالفعل خفض الجرعة الفعالة، وبالتالي تقلل من الحاجة إلى جرعات أكبر أثناء العمليات الجراحية تجديد العظام في المستقبل. وهذا بدوره سوف يقلل الآثار الجانبية وتكاليف عامل النمو. تم ملفقة المتوقَّع (PECs) الذاتي تجميعها لتوفير تحكم أفضل من BMP-2 / NELL-1 التسليم عن طريق الهيبارين ملزمة وتحقيق المزيد من النمو تحفيز عامل النشاط الحيوي من خلال تعزيز الاستقرار في الجسم الحي. نحن هنا توضيح بساطة PEC تلفيق الذي يساعد في deliveراي لمجموعة متنوعة من عوامل النمو خلال عملية جراحية العظام الترميمية.

المقدمة

وقد تم الإبلاغ عن حدوث فصال كاذب إلى أن تصل إلى 10-45٪ في الانصهار في العمود الفقري التنكسية ومراجعة عملية جراحية في العمود الفقري 1. للحد من معدل المفصل الموهم خلال انصهار العمود الفقري وغيرها من العمليات الجراحية الترميمية العظام، أدخلت عوامل النمو المكونة للعظم مثل BMP-2، نيل-1 1 وصفائح المستمدة عامل النمو (PDGF) لتعزيز دي نوفو تكون العظم. ومن بين هؤلاء، BMP-2 هو خيار شعبي لدمج الفقرات 2. على الرغم من أن قوة من BMP-2 في تحريض وتسهيل تكوين العظام الجديدة قد تم راسخة 3؛ لا تزال مضاعفات هامة سريريا مثل تشكيل منتبذ العظام، تورم مصلي وتشكيل ورم دموي، والاستجابة الالتهابية، التهاب الجذر، الفقري عظام النهايات الجسم، والقذف إلى الوراء لتكون من القضايا ذات الاهتمام نظرا لكميات supraphysiological المستخدمة 4،5.

لذلك، وتخفيض جرعة من BMP-2 لا يزال يمثل استراتيجية ذات الصلة في فييغري للحد من الآثار الجانبية. الى جانب ذلك، ثمة حاجة لأنظمة الناقل فعالة لقمع إطلاق سراح دفعة الأولي من BMP-2 التي لوحظت في أنظمة الإسفنج الناقل الكولاجين المعاصر وتعزيز تسليم لفترات طويلة والمترجمة من هذا خلوى قوية. طبقة تلو طبقة التجميع الذاتي للبالتناوب polyelectrolytes الموجبة والأيونية يمكن استخدامها كوسيلة من وسائل الانضباطي لبناء المجمعات متضاعف الكتروليتي على سطح المصفوفات سقالة أو المواد القابلة للزرع 6. في هذا الصدد، وقد اعترف الهيبارين (المعروف لديها أعلى كثافة الشحنة السلبية من كل العوامل البيولوجية) لربط بشوق مع مجموعة متنوعة من عوامل النمو عبر المجالات الكهروستاتيكية والهيبارين ملزمة. في الواقع، وقد تبين الهيبارين لإطالة عمر النصف، وبالتالي تحفيز النشاط الحيوي لعدة عوامل النمو.

وبناء على هذا، تتكيف مجموعتنا بروتوكول التجميع الذاتي طبقة تلو طبقة اختلاق مجمع متضاعف الكتروليتي القائم على الهيبارين (PEC) أن الأحمال ويحافظ على bioactivities من عوامل النمو المكونة للعظم خلال تجميد 7،8. كانت ملفقة جوهر ميكروبيدات الجينات التي يشابك بقايا من الجينات مع ثنائي التكافؤ الموجبة الكالسيوم أو السترونتيوم أيونات α-L-guluronate (G). جوهر الجينات هو سقالة المصفوفة القابلة للتحلل. وبعد الزرع، هو resorbed في السرير الانصهار توفير غرفة لنشوب عظمي. يستخدم بولي-L-ليسين (PLL) أو بروتامين كطبقة الموجبة تشبيك مع كل من مصفوفة سقالة (في هذه الحالة، جوهر الجينات ميكروبيدات الناقل) والهيبارين سالبة الشحنة. في حين أن وظائف طبقة الهيبارين الأيونية لتحقيق الاستقرار وتوطين عوامل النمو تحميلها. وقد تبين طبقة ثلاثية PEC لزيادة قدرة التحميل عامل النمو في نموذج الخنازير 9. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت ناقلات PEC للحد بنجاح الجرعة الفعالة للBMP-2 بنسبة لا تقل عن 20 ضعفا في الفئران (10) ونماذج الخنازير لدمج الفقرات 8.

ntent "> هنا، ونحن التقرير أساليب افتعال المتوقَّع (PECs) لتعزيز النمو تسليم عامل في الانصهار في العمود الفقري وغيرها من العمليات الجراحية الترميمية العظام باستخدام BMP-2 كعامل نمو المكونة للعظم نموذج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الحل الجيني

  1. حل 200 ملغ من الجينات الصوديوم (غير المشع) أو 400 ملغ من 8 مراد المشع الجينات الصوديوم في 10 مل من الماء المقطر المزدوج ويهز لمدة 1 ساعة لالجينات غير يشع و 15 دقيقة عن الجينات المشع. تخزين حل الجينات في 4 درجات مئوية خلال الليل. تصفية حل الجينات مع العقيمة 0.2 ميكرومتر حقنة تصفية قبل تلفيق ميكروبيدات الجينات.

2. الجيني ميكروبيدات تلفيق

  1. تطهير مولد حبة كهرباء وضخ حقنة مع 70٪ من الإيثانول ووضعها في الدرجة الثانية البيولوجية السلامة مجلس الوزراء (الشكل 1).
  2. وضع حوض زجاجي مع شريط مغناطيسي داخل مولد حبة.
  3. تعيين القطب ذراع مولد حبة 9 سم فوق الحوض.
  4. قم بتوصيل كابل كهربائي من مولد حبة لالمسمار مخرش 2 من القطب الذراع، وتصب 80 مل من SrCl 2 الحل فيحوض.
  5. تحميل 5 مل من 0.2 ميكرون حل الجينات التي تمت تصفيتها في أنبوب حقنة والمطاط. بعد توصيل أنبوب من المطاط إلى القطب الذراع، والتبديل على ضخ حقنة في 5 مل / ساعة لمدة 2 دقيقة لطرد الهواء داخل الأنبوب وتسليم حل الجينات إلى غيض من فوهة. إيقاف ضخ حقنة.
  6. بعد ذلك، التبديل على encapsulator ثم ضخ حقنة لبدء توليد ميكروبيدات. ضبط معدل تدفق الجينات في 5 مل / ساعة والجهد عند 5.8 كيلو فولت على encapsulator. تجاهل ميكروبيدات ولدت خلال أول دقيقتين (أو الأولية 0.5 مل من محلول الجينات التي تضخ من الحقنة)، كما تميل هذه ميكروبيدات أن يكون الحجم غير منتظمة وعلى شكل.
  7. جمع ميكروبيدات اللاحقة في محلول كلوريد 0.2 M السترونتيوم. إيقاف كل من ضخ حقنة وencapsulator (بهذا الترتيب) بعد ضخ حجم المعدة مسبقا من حل الجينات. كرر هذا لدفعات لاحقة من تلفيق ميكروبيدات. عند الانتهاء، تحويل لو ضخ حقنة أولا، تليها encapsulator.
  8. تخزين ميكروبيدات في 20 مل من محلول كلوريد 0.2 M السترونتيوم في 4 درجات مئوية خلال الليل لاستكمال عبر ربط وتثبيت هلام.

3. الحجم قياس ميكروبيدات الجيني

  1. جمع 0.5 مل من ميكروبيدات الجينات مع ماصة بلاستيكية ووضعها على شريحة زجاجية. عرض ميكروبيدات تحت المجهر الضوئي في 10X التكبير. خذ عشر صور من ميكروبيدات مع الكاميرا المجهر CCD. حفظ الصور مع شريط النطاق (500 ميكرون) في تنسيق TIFF في قرار 2048 س 1536.
  2. باستخدام أدوات طول في ImageJ، وقياس حجم ميكروبيدات وشريط المقياس (الشكل 2). تحويل طول ميكروبيدات من بكسل إلى ميكرومتر.
    1. انقر على أدوات الخط ورسم خط عبر وسط حبة الجينات.
    2. انقر على "تحليل" على شريط القوائم واختيار "القياس". سوف تظهر نافذة منبثقة.
    3. كرر الخطوات من 3.2.1-3.2.2 لقياس كل حبات الجينات داخل الصورة. قياس شريط النطاق على الصورة.
    4. تحويل قطر حبة الجينات لطول الفعلي باستخدام الصيغة: طول حبة الجينات / طول شريط مقياس × 500 ميكرون. على سبيل المثال، 1.420 (القطر يقاس يماغيج) / 2،657 (مقياس طول شريط تقاس يماغيج) * 500 ميكرون = 267 ميكرون.
  3. النظر في متوسط ​​حجم 100 ميكروبيدات (يعني ± الانحراف المعياري) كحجم تمثيلي من كل دفعة من ميكروبيدات.

4. التعقيم

  1. جمع ميكروبيدات باستخدام النايلون مصفاة 100 ميكرون وتغسل حبات مع الماء المقطر مزدوجة.
  2. باستخدام ملعقة، ونقل جميع ميكروبيدات مصنوعة من 0.1 مل من محلول الجينات في أنبوب microcentrifuge 2 مل، وتغطي مع الشاش لمنع جفاف.
  3. وأخيرا، تعقيم ميكروبيدات بواسطة التعقيم باستخدام وضع السائل (115 درجة مئوية، لمدة 15 دقيقة) أو وفقا للممواصفات anufacturer و. إضافة 1.5 لتر من الماء المقطر إلى غرفة لمنع حبات من التجفيف.

5. بروتامين والهيبارين طلاء

  1. داخل غطاء BSL-2، احتضان ميكروبيدات العقيمة مع 1 مل من 2 ملغ / مل حل بروتامين (تعقيمها باستخدام 0.2 ميكرون تصفية حقنة) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. بعد احتضان ميكروبيدات لمدة 1 ساعة (الخطوة 5.1)، وجمع 150 ميكرولتر من الحل بروتامين للحمض bicinchoninic (microBCA) اختبار الصغير (المادة 6).
  3. غسل بروتامين المغلفة ميكروبيدات مرتين مع الماء المقطر مزدوجة. تدور باستمرار باستخدام أعلى مقاعد البدلاء أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي، ونضح الماء باستخدام حقنة.
  4. احتضان بروتامين المغلفة ميكروبيدات مع 1 مل من 0.5 ملغ / مل حل الهيبارين (تعقيمها باستخدام 0.2 ميكرون تصفية حقنة) لمدة 30 دقيقة إلى إنشاء مجمع متضاعف الكتروليتي (PEC).
  5. بعد احتضان بروتامين المغلفة ميكروبيدات وأو 30 دقيقة (الخطوة 5.4)، وجمع 400 ميكرولتر من محلول الهيبارين لتحديد محتوى الهيبارين (المادة 7).
  6. بعد الحضانة، ويغسل الهيبارين غير منضم من المتوقَّع (PECs) عن طريق غسل مرتين مع الماء المقطر مزدوجة.

6. بروتامين المحتوى

  1. إجراء اختبار microBCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لفترة وجيزة، إضافة 150 حل بروتامين ميكرولتر (جمعها قبل وبعد الحضانة مع ميكروبيدات) في 96 لوحة جيدا. إضافة 150 ميكرولتر microBCA حل العاملة.
  2. استخدام محلول الزلال (0، 0.5، 1، 2، 5، 10، 20، 40 و 200 ميكروغرام / مل)، ومعايير المعايرة.
  3. احتضان الخليط لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية. قياس الامتصاصية مع معمل في 562 نانومتر.
  4. استخدام منحنى القياسية لتحديد تركيز بروتامين من كل عينة غير معروفة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  5. تحديد محتوى بروتامين من ميكروبيدات بطرح المبلغ الإجمالي للبروتامين فيحل طلاء (قبل الحضانة مع ميكروبيدات) من مبلغ بروتامين المتبقية في حل طلاء (بعد الحضانة مع ميكروبيدات).

7. الهيبارين المحتوى

  1. إعداد 10 مل من محلول العمل عن طريق إذابة 4 ملغ طولويدين الأزرق و 20 ملغ كلوريد الصوديوم في 0.01 N حمض الهيدروكلوريك.
  2. إضافة 400 ميكرولتر من عينة (من الخطوة 5.5) إلى حل العاملة في نسبة 2: 3 ودوامة لمدة 30 ثانية.
  3. إضافة 600 ميكرولتر من ن الهكسان (حجم يعادل الحل كاشف العمل) ودوامة الخليط لاستخراج طولويدين الأزرق مجمع الهيبارين.
  4. نضح 200 ميكرولتر من المرحلة المائية بواسطة حقنة بعد الانفصال المرحلة.
  5. قياس كمية المستخرج من الامم المتحدة طولويدين الأزرق الواردة في المرحلة المائية باستخدام معمل في 631 نانومتر.
  6. إعداد الحلول الهيبارين مستوى 0-20 ميكروغرام / مل.
  7. رسم القراءة 631 نيوتن متر من كل معيار الهيبارين مقابل تركيز الهيبارين في ميكروغرام / مل. استخدام منحنى القياسية لتحديد تركيز الهيبارين من كل عينة.

8. متحد البؤر صورة هيكل طبقة تلو طبقة

  1. افتعال بروتامين، الهيبارين وNELL-1 / BMP-2 التناظرية الفلورسنت CF-405 بروتامين (الأزرق)، CF 594 الهيبارين (الحمراء)، وFITC المسمى NELL-1 / FITC المسمى (الأخضر) BMP-2 + الهيبارين + بروتامين وفقا لالصانع ورقة البيانات التقنية.
  2. معطف 100 ميكروغرام ميكروبيدات مع 300 ميكرولتر من التناظرية الفلورسنت (طريقة الطلاء كما هو موضح في 5،3-5،6) CF-405 بروتامين (الأزرق) (2 ملغ / مل، 1 ساعة حضانة)، CF 594 الهيبارين (أحمر) (0.5 ملغ / مل، 30 دقيقة)، وFITC المسمى NELL-1 / FITC المسمى (الأخضر) BMP-2 (1.5 ملغ / مل، بين عشية وضحاها). غسل ميكروبيدات مرتين مع الماء المقطر لإزالة غير منضم بروتامين الفلورسنت، الهيبارين وNELL-1 / BMP-2.
  3. مراقبة هيكل طبقة تلو طبقة (الشكل 3) باستخدام مجهر متحد البؤر في التكبير 10x 7

9. BMP-2وNELL-1 امتصاص والإصدار

  1. تحميل 13.3 ميكرولتر من 1.5 ملغ / مل من BMP-2 أو NELL-1 حل على 100 ميكروغرام من PEC. احتضان PEC في 4 درجات مئوية تحت 30 دورة في الدقيقة اهتزاز لمدة 10 ساعة.
  2. تزج ميكروبيدات في 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عند 37 درجة مئوية مع ثابتة تهز (30 دورة في الدقيقة).
  3. جمع 1 مل من طاف واستبدالها مع 1 مل برنامج تلفزيوني بعد 1 و 3 و 6 و 10 و 14 يوما.
  4. تقييم امتصاص وإطلاق سراح كفاءة BMP-2 باستخدام طريقة ELISA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تقييم امتصاص وإطلاق سراح كفاءة NELL-1 باستخدام carboxybenzoyl الكينولين-2-كاربوكسالدهيد (CBQCA) طريقة البروتين فحص وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  5. تحديد الإفراج التراكمي في وقت (ر):
    الإفراج التراكمي في وقت (ر) = بيان في وقت (ر) + الإفراج السابق في وقت (تي 1).
  6. رسم الافراج التراكمي للBMP-2 و NELL-1 مع الزمن.

10. في المختبر النشاط الحيويمن NELL-1

ملاحظة: تم تقييم النشاط الحيوي من NELL-1 المفرج عنهم من PEC عن طريق قياس قدرته على زيادة التعبير عن الفوسفاتيز القلوية (ALP) في أرنب العظام خلايا نخاع الجذعية (rBMSC).

  1. البذور 20،000 rBMSCs لكل بئر في 24 لوحة جيدا والسماح لها أن تنمو ليوم واحد مع 1 مل من Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) + 10٪ الجنين المصل البقري (FBS) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. بعد 24 ساعة، استبدال المتوسطة مع 1 مل من وسيلة عظمي المنشأ (DMEM تستكمل مع FBS 10٪، 2٪ البنسلين ستربتومايسين، 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك، 10 مليمول / لتر بيتا سكرولي، و 10 -8 مول / لتر ديكساميثازون ) لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  3. وضع 300 ميكروغرام PEC-NELL-1 (من الخطوة 8.2) وPEC داخل إدراج ثقافة خلية (TC إدراج) للحفاظ على المتوقَّع (PECs) منفصلة من الخلايا (هذا يتجنب تبييض ميكروبيدات PEC خلال تغيير المتوسطة عظمي المنشأ). إدراج مكان TC في 24 جيدا ررأكل لمدة 14 يوما.
  4. مرة واحدة كل ثلاثة أيام، نضح 1 مل من المتوسط ​​عظمي المنشأ عن طريق وضع إبرة خارج إدراج TC، واستبدالها مع 1 مل من المتوسط ​​عظمي المنشأ الطازجة.
  5. بعد 7 و 14 يوما من الحضانة، وتحديد نشاط حزب العمال الاسترالى مع عدة ALP الفحص وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة في المجموعة.
    1. خلايا ليز مع العازلة فحص تحتوي على 0.1٪ TritonX-100 في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. كشط الخلايا الالتزام باستخدام مكشطة الخلية. احتضان تعليق خلية في 4 درجات مئوية في إطار التحريض لمدة 60 دقيقة على الأقل.
    2. الطرد المركزي تعليق خلية في 2500 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. جمع طاف للفحص ALP.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من القلوية حل القياسية الفوسفاتيز تخفيفه بشكل متسلسل 200-0 نانوغرام / مل إلى آبار 96 لوحة جيدا. المبالغ النهائية على مستوى الفوسفاتيز القلوية هي 10، 5، 2.5، 1.2، 0.6، 0.3، 0.15، و0 نانوغرام / جيد.
    4. إضافة طاف من الخطوة 10.5.2 (50 ميكرولتر / جيد) وتمييع مع التخفيف بuffer.
    5. إضافة 50 ميكرولتر من ص -nitrophenyl حل الفوسفات (pNPP) الركيزة في كل بئر. مزيج من المواد الكيميائية التي تهز بلطف لوحة لمدة 30 ثانية. احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في الظلام. قياس الامتصاصية في 405 نانومتر التي كتبها قارئ لوحة.
    6. حساب النشاط ألب باستخدام منحنى المعايرة.
  6. تحديد محتوى البروتين باستخدام microBCA عدة البروتين الفحص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تطبيع نشاط حزب العمال الاسترالى بتقسيم النشاط ألب التي كتبها محتوى البروتين.

الجدوى 11. خلية

  1. احتضان 200 ملغ من PEC-NELL-1 مع 1 مل من DMEM + 10٪ FBS عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ل3- (4،5-dimethylthiazol-2-YL) بروميد -2،5-diphenyltetrazolium (الإنتقالي العسكري) فحص.
  2. البذور 2000 rBMSCs لكل بئر (في 100 ميكرولتر من DMEM مع 10٪ FBS) في 96 لوحة جيدا واحتضان لمدة 1 يوم عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
  3. استبدال DMEM + 10٪ FBS مع 100 ميكرولتر من استخراج PEC-NELL-1 / PEC واحتضانعند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
  4. بعد يوم 1 أو 3 أيام من الحضانة، إضافة 10 ميكرولتر من 5 ملغ / مل حل الإنتقالي العسكري ومواصلة احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 4 ساعة في الظلام.
  5. إضافة 100 حل DMSO ميكرولتر إلى كل بئر لإذابة البلورات formazan.
  6. تحديد الامتصاصية في 570 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة.
  7. حساب معدل النمو النسبي:
    figure-protocol-1

12. التعبئة والتغليف في سقالة وBMP-2 و NELL-1 تحميل

  1. حزمة المتوقَّع (PECs) في المسام من bioresorbable Polycaprolactone الصف الطبية - فوسفات ثلاثي الكالسيوم (mPCL-TCP) سقالة باستخدام ملعقة معقمة داخل غرفة BSL-2.
  2. إضافة 1.5 ملغ / مل حل من BMP-2 أو NELL-1 على منصة الاعدام mPCL-TCP محملة PEC واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في الناقل لدينا، وقد تم اختيار بروتامين كبديل للبولي-L-ليسين لأنه يتمتع بخصائص كيميائية مماثلة، وأنه وافق ادارة الاغذية والعقاقير كمضاد الهيبارين. وأظهرت النتائج المجهر الضوئي أن ميكروبيدات غير المشع كانت كروية الشكل يبلغ قطرها 267 ± 14 ميكرون. (0.35 ملم فوهة، معدل التدفق من 5 مل / ساعة و5.8 كيلو فولت). غالبية ميكروبيدات المشع ذات شكل دمعة. كان القطر يقاس على جزء من جولة في ميكروبيدات المشع 212 ± 30 ميكرون (0،35 ملم فوهة، ومعدل 4 مل / ساعة و6 كيلو ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويعرض هذا البروتوكول طريقة لإعداد بيكس من خلال طبقة تلو طبقة التجميع الذاتي. هو تصور بنية طبقة تلو طبقة باستخدام نظائرها الفلورسنت من بروتامين، الهيبارين، BMP-2 و NELL-1 و متحد البؤر المجهري. امتصاص وإطلاق سراح الاختبارات تظهر أن الهيبارين على PEC يتوسط عظمي المنشأ امتصاص عامل نمو والافراج عنهم. كفاءة امتصاص طريقة PEC هي: NELL-1: 86.7 ± 2.7٪، BMP-2: 70.5 ± 3.1٪. الناقل PEC لديه تعديل أفضل من NELL-1 (20٪) الإفراج مقارنة محض سطح حاملة الامتزاز مثل جزيئات الأباتيت الكالسيوم (40-80٪) ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسات من قبل المجلس الوطني للبحوث الطبية ، وعالم السريري - منحة البحوث الفردية (CS-IRG) ، NMRC / CIRG / 1372/2013 و NMRC EDG / 0022/2008.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
علوم الحياة Acrodisc 25  مم مرشح حقنة مع 0.2   ؛ ومايكرو. م غشاء سوبورPALL PN4612البروتامين المعقم ، محلول الهيبارين عن طريق الترشيح الفائق
24 لوحة خليةنجمة & nbsp ؛662160
96 لوحة بئر Nuclon Delta SurfaceThermo Fisher Scientific167008
(3- (4،5-Dimethylthiazol-2-yl) -2،5-Diphenyltetrazolium Bromide) ، MTTSigma AldrichM5655قياس السمية الخلوية ل PEC-NELL-1
AcetoneFisher ScientificA / 0600/17ترسيب CF-405
المسمى البروتامين
Alamar BlueInvitrogen ، Life TechnologiesDAL 1025قياس السمية الخلوية لمجموعة
الفوسفاتيز القلويةAnaspecAS-72146
كلوريد الأمونيومMerckArt 1145كاشف الإيقاف في وضع العلامات على FITC
ميثيل سلفوكسيد اللامائي (DMSO)Invitrogen ، Life TechnologiesD12345مذيب لأيزوثيوسيانات الفلورسنت I
ثنائي ميثيل سلفوكسيد ( DMSO)سيجما ألدريتشDissolve  formazan 
الأوتوكلافHirayamaHU-110تعقيم حبات الجينات بالبخار
بيتا جليسروفاتسيجما ألدريتشG9422
BMP-2 (طقم غرس العظام الكبيرة II)  Medtronic Sofarmor Danek ، ممفيس تينيسي ، الولايات المتحدة الأمريكية7510800عامل النمو العظمي ، هناك حاجة إلى غسيل الكلى لإزالة مكون المثبت الذي يتداخل مع اقتران FITC
Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA)   ؛Thermo Fisher ScientificA-6222لتحديد مصفاة خلية البروتين NELL-1
(100   ومايكرو. م)BD Science352360عقد PEC
لمكشطة خلية فحص ALP 290   ؛ مم بليد ويد 20   ؛ ممSPL Life Science90030افصل الخلية عن 24 لوحة بئر
CF 405S ، Succinimidyl EsterSigma AldrichSCJ4600013صبغة الفلورسنت الزرقاء لوضع العلامات على البروتامين
CF 594 ، HydrazideSigma AldrichSCJ4600031صبغة فلورية حمراء عميقة لوضع العلامات على الهيبارين
جهاز طرد مركزيBeckman CoulterMicrofuge 22R
مجهر متحد البؤرأوليمبوس FV1000
ديكساميثازونسيجما ألدريتشD4902مكون من وسط نمو العظم
ديكستران تتحلية الأعمدةبيرس (حراري علمي)  43230
DMEMGibco 12320
BMP-2 Quantikine ELISA KitR & D نظامDBP200تحديد BMP-2 إطلاق
مصل الأبقار الجنيني FBSHycloneSV30160.03
Fluoescein Isothiocyananate, Isomer ISigma AldrichF7250صبغة الفلورسنت الخضراء ل NELL-1 و BMP-2 وضع العلامات
على إدراج ثقافة الخلايا ThinCert ،
ل 24 لوحة بئر ، معقمة		Greiner   ؛662630يمنع غسل PEC عند تغيير مضخة حقنة هافارد أبارتوس المتوسطة العظمية
(11 زائد)جهاز هافارد70-2208
ن-هكسان (>99٪)سيجما ألدريتش139386
هيبارينسيجما ألدريتشH3149يرتبط بعامل نمو هشاشة العظام
مع مجال ربط الهيبارين
حمض الهيدروكلوريك (37٪)Merck 100317
حاضنةالموثقC8150
MicroBCA مجموعة فحص البروتينعلم الحرارة23235
قارئ الصفيحةالدقيقة TecanInfinite M200لمقايسات ALP و microBCA
تغليف خلية NiscoNisco Engineering Incوحدة تغليف VAR V1
المجهر الفلوريأوليمبوسسقالة IX71
mPCL-TCP (حجم المسام 1.3   مم)OsteoporePCL-TCP 0/90عقد PEC ل in vivo< / em> دراسة
البنسلين الستربتومايسين 10,000 وحدة / مل ، 100 & nbsp ؛ ملHyclone Cell CultureSV30010مضاد حيوي
10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)محلول VivantisPB0344-1L10x ، Ultra Pure Grade
Poly-L-Lysine MW 15،000-30،000Sigma AldrichP2568ملح
كبريتات البروتامين متعدد الاكتواب ، من SalmonSigma AldrichP4020Polycation
ShakerLabnetS2025
أنابيب غسيل الكلى من جلد الثعبان 3,500 MWCO 22  مم × 35 قدماThermo Fisher Scientific68035قم بإزالة FITC غير المتفاعل عن طريق غسيل الكلى
كلوريد الصوديومMerck1.06404.1000
هيدروكسيد الصوديومQrecS5158
بيكربونات الصوديومالأمريكية البيولوجيةS4000كربونات الصوديوم العازلة
Sigma AldrichS7795-500Gعازلة
كلوريد السترونتيوم سداسي هيدراتسيجما ألدريتش255521Crosslinker لملعقة الجينات
3dia
5 مل حقنةTerumo140425Rيؤثر قطر المحقنة على معدل التدفق
75 سم < سوب > 2 < / sup> قارورة ثقافة الخلية معلقةالرقبة Corning730720
تولويدين بلوسيجما ألدريتش52040فحص
التربسين 1xHyclone Cell CultureSH30042.01
ألجينات الصوديومNovamatrix (FMC Biopolymer ، برينستون ، نيوجيرسي)Pronova UPMVGالمادة الأساسية للميكروبيدات
فحص PEC-BMP-2 (ALP) ثنائي شديدة التآكل آلة الهيبارين

المراجع

  1. Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
  2. Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
  3. Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
  4. Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
  5. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  6. Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
  7. Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
  8. Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
  9. Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
  10. Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
  11. Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
  12. Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
  13. Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

حبيبات الألجينات الدقيقةالمجهر البؤريمقايسة الفوسفاتاز القلويالبروتين المكون للعظمالجزيء الشبيه بـ NELLطلاء البروتامين والهيبارينمحلول كلوريد السترونشيوم
مجمع متضاعف الكتروليتي للهيبارين ربط تسليم عظمية عامل نمو المجال
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.