يصف البروتوكول نموذجا جديدا لغرفة نافذة عظم الفخذ الفئران يمكن استخدامه لتتبع حركة الخلايا في نخاع عظم الفخذ في الجسم الحي. يستخدم الفحص المجهري الفلوري متعدد الفوتون داخل الحيوية لتصوير ثلاثة مكونات لنخاع عظم الفخذ (الأوعية الدموية ومصفوفة الكولاجين والعدلات) بمرور الوقت.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عظم الفخذ نافذة الغرفة نموذج ل
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نخاع العظام هو عضو معقد يحتوي على العديد من الخلايا المكونة للدم وغير المكونة للدم. تشارك هذه الخلايا في العديد من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك تكون الدم وتنظيم المناعة وتنظيم الورم. توفر الطرق الشائعة الاستخدام لفهم الإجراءات الخلوية في نخاع العظام ، مثل الأنسجة وتعداد الدم ، معلومات ثابتة بدلا من التقاط العمل الديناميكي للمكونات الخلوية المتعددة في الجسم الحي. لاستكمال الطرق القياسية ، تم تطوير نموذج قائم على غرفة النافذة (WC) لتمكين التصوير التسلسلي في الجسم الحي للخلايا والهياكل في نخاع عظم الفئران. يصف هذا البروتوكول إجراء جراحيا لتركيب المرحاض في عظم الفخذ ، من أجل تسهيل الوصول البصري طويل الأمد إلى نخاع عظم الفخذ. على وجه الخصوص ، لإثبات فائدته التجريبية ، تم استخدام نهج المرحاض هذا لتصوير وتتبع العدلات داخل شبكة الأوعية الدموية لعظم الفخذ ، وبالتالي توفير طريقة جديدة لتصور وقياس الاتجار بالخلايا المناعية وتنظيمها في نخاع العظام. يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة في نخاع عظم الفئران ، مثل تكون الدم وزرع الخلايا الجذعية والاستجابات المناعية في الحالات المرضية ، بما في ذلك السرطان.
المقدمة
نخاع العظام هو الجهاز الهام تشارك في تكون الدم وتنظيم جهاز المناعة. وهو يتألف من عنصر المكونة للدم التي تحتوي على الجذعية والسلف الخلايا المكونة للدم (HSPCs)، وعنصر اللحمية التي تحتوي على الخلايا الاولية غير المكونة للدم التي تؤدي إلى خلايا اللحمة المتوسطة 1. ثلثي النشاط للدم مكرس لتوليد خلايا الدم النخاعي 2. على وجه الخصوص، ويتم إنتاج عدد كبير من العدلات في نخاع العظم، مع 1-2 × 10 11 الخلايا المتولدة يوميا في الكبار الإنسان العادي 2. العدلات هي خط الدفاع الأول ضد العدوى الميكروبية ومحفوظة في معظمها في نخاع العظم حتى يؤدي الإجهاد تعبئة لتكملة العدلات المحيطية 1،3. بالإضافة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم تنفيذ جميع الأعمال الحيوان تحت بروتوكول # 2615 التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام شبكة الصحة جامعة.
1. إعداد الجراحي للماوس
- قبل الجراحة، وتعقيم جميع الأدوات الجراحية وغرفة نافذة (WC) من خلال التعقيم. تكملة مياه الشرب مع 50 ملغم / كغم من وزن الجسم من أموكسيسيلين قبل 2 أيام إلى عملية جراحية. حقن الفأر مع 0.1 ملغم / كغم من وزن الجسم من البوبرينورفين البريتونى 4 ساعات قبل الجراحة.
- تخدير الماوس عارية athymic عن طريق ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الفئران نخاع العظم الفخذي يتم الوصول بنجاح باستخدام مرحاض لتمكين التصور العدلات الفردية وشبكات الأوعية الدموية. ويبين الشكل 1 الصك مرحاض ويصف العملية الجراحية، التي تنطوي على التعرض للعظم الفخذ وترقق العظام القشرية للوصول البصرية داخل عظم. وجيد التحمل عملية جراحية في الفئران. كانوا تقييمها لردود الفعل الجسدية السلبية، مثل هند أطرافهم تورم وعدم تحمل الوزن على أطرافهم، وتشويه الذات، الهلل والتهاب الجلد، فضلا عن الأضرار التي لحقت مرحا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في الوقت الحقيقي، والتصوير التسلسلي للعمليات الخلوية الحيوية في نخاع العظام ويوفر المعلومات التي يتم تحدي خلاف ذلك للحصول على استخدام التقنيات التقليدية مثل الأنسجة وإجمالي تعداد الدم. نموذج WC عظم الفخذ هو موضح هنا يوفر فرصا فريدة لتحقيق التعديلات الخلوية والهيكلية في نخاع العظام مع مرور الوقت. على الرغم من أن نموذج عظم الفخذ مرحاض وقد ذكرت سابقا، لدينا تصميم جديد يوفر مجالا والتصوير أكبر من عرض وأصغر حجم مرحاض العام، والتي هي أكثر توافقا للاستخدام في فئران بالغة. نموذج WC عظم ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر مرفق المتقدم بصري المجهر (www.aomf.ca) في الشبكة الصحية الجامعية للمساعدة مع المجهر، والسيد جيسون ايليس من الأميرة مارغريت مركز سرطان محل آلة لتصنيع مرحاض ومرحلة التصوير. كما نود أن نشكر الدكتور ايريس Kulbatski لتحرير مخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| NRCNU-F الفئران العارية الرياضية | تاكونيك | Ncr عارية | 8-10 أسابيع من العمر ، أنثى |
| سالين | باكستر | JB1302P | |
| الكيتامين هيدروكلوريد | Bioniche Animal Health Canada، Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare ، Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| الستارة الجراحية | Proxima | DYNJP2405 | |
| وسادة التدفئة الكهربائية | Life العلامة التجارية | 57800827375 | |
| المجهر المجسم | Leica | Leica M60 | |
| مرهم العين (جل المسيل للدموع) | Novartis ؛ | T296 / 2 | |
| 7.5٪ بيتادين | بوردو فريدريك Co | 67618-151-16 | |
| 70٪ كحول الأيزوبروبيل | GreenField | P010IP7P | |
| 10٪ بيتادين | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| مقبض مشرط | 3Fine Science Tools | 10003-12 | |
| شفرة مشرط (# 15) | VWR | 89176-368 | |
| مقص الربيع منحني | أدوات العلوم الدقيقة | 15023-10 | |
| لخلاط الأطفال | 13013-14 | ||
| أدوات العلوم الدقيقة | 14094-11 | ||
| ملقط Graefe ناعم | إضافي أدوات العلوم الدقيقة | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | أدوات العلوم الدقيقة | 13008-12 | |
| الحفر الصغير | هارفارد Apparaus | 72-6065 | |
| نتوءات الحفر | الدقيقة أدوات العلوم الدقيقة | 19007-14 | |
| نافذة عظم الفخذ | PMCC آلة | متجر تصميم مخصص | 9.1 مم - 8.5 مم - 7.5 مم (القطر الخارجي إلى الداخلي) ، 2.16 مم (نصف قطر فتحتين) ، 13.9 مم (المسافة بين فتحتين) ، 0.7 مم (سمك) |
| شريط على شكل حرف U | آلة PMCC | تصميم مخصص | 13.8 مم (طول) ، 1.6 مم (عرض) ، 3.7 مم (ارتفاع) |
| غطاء زجاجي (8 مم) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| حلقة الاحتفاظ (8 مم) | ACKLAND GRANINGER | UNSPSC # | |
| المكسرات (الفولاذ المقاوم للصدأ السداسية) | Fistenal | 70701 | |
| أسمنت الأسنان | 3M | RelyX U200 | |
| خياطة (5-0 Monosof Black) | Covioien | SN-5698 | |
| حامل إبرة Halsey | أدوات العلوم الدقيقة | 12501-13 | |
| بوبرينورفين (Temgesic) | ريكيت بينكيزر | DIN 0281251 | |
| ميلوكسيكام (ميتاكام) | بوهرينجر إنجلهايم | دين 02240463 | |
| أموكسيسيلين (كلامافوكس) فايزر | دين 02027879 | ||
| FITC-ديكستران | سيجما-ألدريتش | FD2000S | |
| APC- مضاد للفأر Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| مجهر ثنائي الفوتون LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| مرحلة التصوير | PMCC متجر آلة | تصميم مخصص | 15.9 سم (طول) ، 11 سم (عرض) ، 0.9 سم (ارتفاع) |
| برنامج Imaris | Bitplane | Imaris 8.0 | برنامج تحليل الصور الموصوف في القسم 3 من البروتوكول ؛ |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | برنامج التقاط الصور الموصوف في القسم 2 من البروتوكول |
المراجع
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
