Method Article

طريقة سهلة لمحطة Polysome التنميط

DOI:

10.3791/54231

⸱

August 28th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Génétique et Biophysique des Plantes, Aix-Marseille Université, 2UMR 7265 Biologie Végétale & Microbiologie Environnementales, CNRS, 3BIAM, CEA, 4Department of Biology, Biocenter, University of Copenhagen, 5Laboratoire de Chimie Bactérienne, 6CNRS, LCB UMR 7283, Aix Marseille Université

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة سهلة لاستخراج وتجزئة النصوص من الأنسجة النباتية على أساس عدد الريبوسومات المقلدة. يسمح بتقدير عالمي لنشاط الترجمة وتحديد الحالة الانتقالية لأنواع mRNAs محددة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترجمة mRNA إلى بروتين هي عملية بيولوجية أساسية ومنظمة للغاية. يعتبر التنميط متعدد الجمرات معيارا ذهبيا لتحليل التنظيم الانتقالي. الطريقة الموضحة هنا هي طريقة سهلة واقتصادية لتجزئة البوليسومات من الأنسجة النباتية المختلفة. يتم عمل تدرج السكروز دون الحاجة إلى صانع التدرج عن طريق تجميد كل طبقة بالتتابع. ثم يتم تحضير المستخلصات العصارية الخلوية في مخزن مؤقت يحتوي على سيكلوهيكسيميد وكلورامفينيكول لتثبيت الريبوسومات العصارية الخلوية والكلوروبلاستيك إلى mRNA ويتم تحميلها على تدرج السكروز. بعد الطرد المركزي ، يتم جمع ستة كسور مباشرة من أسفل التدرج إلى أعلى التدرج ، دون اختراق أنبوب الطرد المركزي الفائق. أثناء التجميع ، تتم قراءة الامتصاص عند 260 نانومتر بشكل مستمر لإنشاء ملف تعريف متعدد الأشكال يعطي لمحة سريعة عن النشاط الانتقالي العالمي. ثم يتم تجميع الكسور لإعداد ثلاث مجموعات مختلفة من mRNA: polysomes ، mRNAs المرتبطة بعدة ريبوسومات. أحادي الجسيمات ، mRNAs المرتبطة بريبوسوم واحد ؛ و mRNAs غير المرتبطة بالريبوسومات. ثم يتم استخراج mRNAs. تم التحقق من صحة هذا البروتوكول للنباتات والأنسجة المختلفة بما في ذلك شتلات نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا والنباتات البالغة ، وأوراق نيكوتيانا بنثاميانا ، وأوراق Solanum lycopersicum ، و Oryza sativa.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخليق البروتين هو عملية أساسية ومكلفة بقوة في جميع الخلايا 1. أولا وقبل كل شيء، يجب أن الخلايا استثمار الطاقة في إنتاج الآلات الترجمة، والريبوسومات. على سبيل المثال خلية الخميرة تقسيم بنشاط تنتج ما يصل الى 2000 الريبوسومات في الدقيقة الواحدة. ويتطلب هذا الإنتاج إلى 60٪ من إجمالي النشاط النسخي، وتصل إلى 90٪ من النشاط الربط الكلي للخلية 2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطاقة اللازمة لتركيب الأحماض الأمينية، أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال والسندات الببتيد. في النباتات، إضافة حمض أميني واحد إلى تكاليف سلسلة ببتيد 4،5-5،9 جزيئات ATP 3. ولذلك، فإنه ليس من المستغرب أن الترجمة من مرنا إلى البروتين هو مو....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد 20 إلى 50٪ (ث / ت) السكروز التدرجات

ملاحظة: مصنوعة من التدرجات من 4 طبقات من السكروز (50٪، 35٪ و 2 طبقات من 20٪) في 13.2 مل أنبوب نابذة فائقة السرعة. في تجربتنا، وسكب السكروز 20٪ في طبقتين منفصلتين يحسن إلى حد كبير نوعية الاستعدادات polysome.

  1. إعداد الحلول الأسهم. التأكد من أن جميع الحلول ريبونوكلياز والدناز الحرة.
    1. إعداد 10X محلول الملح: 400 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الأدب، وغالبا ما تظهر ملامح polysome من الكسر الضوء على جزء الثقيل نتيجة الطريقة التي يتم جمعها التدرجات، أي من أعلى إلى أسفل. منذ ذلك الحين في بروتوكول صفها هنا يتم جمع التدرجات من الأسفل إلى الأعلى، لمحات نظهر تبدأ جزء الثقيل (وpolysomes) والذهاب إلى الأجزاء الخفيفة (مفارز الريبوسوم مجاني والرنا) (الشكل 2A). ثم نقوم بجمع كل التدرج في ستة 2 مل الكسور، ولكن أجزاء أصغر يمكن جمع ما إذا كان تحليل أكثر تفصيلا لمحتوى polysome لابد من.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول الذي نقدمه هنا هو طريقة سهلة ورخيصة لتوليد ملفات تعريف polysome وعزل mRNAs المرتبطة بpolysomes أو الريبوسومات المفردة أو خالية من الريبوسومات. تم وصف مجموعة واسعة من طرق تجزئة تعدد الجثوم المختلفة في الأدبيات. تم تحسين الطريقة التي وصفناها هنا للاحتفاظ بالمركبات الضرورية فقط وتم تكييفها مع المواد النباتية. على وجه الخصوص ، قمنا بتقليل كمية المنظف11 وأضفنا الكلورامفينيكول إلى المخزن المؤقت لتثبيت الريبوسومات البلاستيكية الكلورية في الرنا المرسال (كما يفعل سيكلوهيكسيمايد للريبوسومات العصارة الخلوية) <.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية (وكالة الاستخبارات الوطنية-14-CE02-0010). نشكر الدكتور بنيامين الميدان والدكتور إيلودي Lanet لقراءة نقدية للمخطوطة. نشكر السيد ميشيل تيريز لمساعدته مع تحرير الفيديو.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أنبوب الطرد المركزي الفائق ، thinwall ، polyallomer - 13.2 ملBeckman Coulter331372
أنبوب الطرد المركزي الفائق ، thinwall ، polyallomer - 38.5 ملBeckman Coulter326823
أنبوب شعري زجاجيDrummond Scientific1-000-1000
Ultra Centrifuge  ؛بيكمان كولترأوبتيما سلسلة
الطرد المركزي الفائق الدوار SW41بيكمان كولتر331362
الفائق الطرد المركزي SW32بيكمان كولتر369650
مضخة تمغجيةأي
أنابيب Tygon R3607 البولي فينيل كلوريد  فيشر Scientific070534-22أنابيب البولي فينيل كلوريد ، 2.29 مم   ؛
جامع الكسور موديل 2110Bio-Rad731-8120
كوفيت الأشعة فوق البنفسجيةهيلما170.700-QSكوفيتز تدفق الكوفيت
مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجيةVarianCary50اقرأ كل 0.0125 ثانية
جميع المواد الكيميائيةأياستخدام فقط خليط الملح القاعدي من درجة البيولوجيا الجزيئية
Murashige و Skoog (MS)Sigma-AldrichM5524
ماء خال من رناسأي
أطباق بتريفيشر Scientific10083251 
أوكتيل فينوكسي بولي (إيثيلين أوكسي) إيثانول ، متفرع (Nonidet P40)EuromedexUN3500
أكريلاميد خطي (حامل أكريل)ThermoFischer العلميAM9520ناقل ترسيب الحمض النووي الريبي
OriginPro 8برنامج تحليلOriginLab
الدوار

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, C. J., Millar, A. H. Protein turnover in plant biology. Nat Plants. 1 (3), 15017(2015).
  2. Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
  3. Amthor, J. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polysome ProfilingPlant TissuesSucrose GradientRNA ExtractionUltracentrifugationCytosolic ExtractFraction CollectionOD MeasurementArabidopsis ThalianaNicotiana Benthamiana

Related Articles