Method Article

طريقة سهلة لمحطة Polysome التنميط

DOI:

10.3791/54231

⸱

August 28th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Génétique et Biophysique des Plantes, Aix-Marseille Université, 2UMR 7265 Biologie Végétale & Microbiologie Environnementales, CNRS, 3BIAM, CEA, 4Department of Biology, Biocenter, University of Copenhagen, 5Laboratoire de Chimie Bactérienne, 6CNRS, LCB UMR 7283, Aix Marseille Université

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة سهلة لاستخراج وتجزئة النصوص من الأنسجة النباتية على أساس عدد الريبوسومات المقلدة. يسمح بتقدير عالمي لنشاط الترجمة وتحديد الحالة الانتقالية لأنواع mRNAs محددة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترجمة mRNA إلى بروتين هي عملية بيولوجية أساسية ومنظمة للغاية. يعتبر التنميط متعدد الجمرات معيارا ذهبيا لتحليل التنظيم الانتقالي. الطريقة الموضحة هنا هي طريقة سهلة واقتصادية لتجزئة البوليسومات من الأنسجة النباتية المختلفة. يتم عمل تدرج السكروز دون الحاجة إلى صانع التدرج عن طريق تجميد كل طبقة بالتتابع. ثم يتم تحضير المستخلصات العصارية الخلوية في مخزن مؤقت يحتوي على سيكلوهيكسيميد وكلورامفينيكول لتثبيت الريبوسومات العصارية الخلوية والكلوروبلاستيك إلى mRNA ويتم تحميلها على تدرج السكروز. بعد الطرد المركزي ، يتم جمع ستة كسور مباشرة من أسفل التدرج إلى أعلى التدرج ، دون اختراق أنبوب الطرد المركزي الفائق. أثناء التجميع ، تتم قراءة الامتصاص عند 260 نانومتر بشكل مستمر لإنشاء ملف تعريف متعدد الأشكال يعطي لمحة سريعة عن النشاط الانتقالي العالمي. ثم يتم تجميع الكسور لإعداد ثلاث مجموعات مختلفة من mRNA: polysomes ، mRNAs المرتبطة بعدة ريبوسومات. أحادي الجسيمات ، mRNAs المرتبطة بريبوسوم واحد ؛ و mRNAs غير المرتبطة بالريبوسومات. ثم يتم استخراج mRNAs. تم التحقق من صحة هذا البروتوكول للنباتات والأنسجة المختلفة بما في ذلك شتلات نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا والنباتات البالغة ، وأوراق نيكوتيانا بنثاميانا ، وأوراق Solanum lycopersicum ، و Oryza sativa.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخليق البروتين هو عملية أساسية ومكلفة بقوة في جميع الخلايا 1. أولا وقبل كل شيء، يجب أن الخلايا استثمار الطاقة في إنتاج الآلات الترجمة، والريبوسومات. على سبيل المثال خلية الخميرة تقسيم بنشاط تنتج ما يصل الى 2000 الريبوسومات في الدقيقة الواحدة. ويتطلب هذا الإنتاج إلى 60٪ من إجمالي النشاط النسخي، وتصل إلى 90٪ من النشاط الربط الكلي للخلية 2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطاقة اللازمة لتركيب الأحماض الأمينية، أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال والسندات الببتيد. في النباتات، إضافة حمض أميني واحد إلى تكاليف سلسلة ببتيد 4،5-5،9 جزيئات ATP 3. ولذلك، فإنه ليس من المستغرب أن الترجمة من مرنا إلى البروتين هو موقع كبير من التنظيم، لا سيما عندما يتعلق الأمر بالتعامل مع الظروف البيئية المتغيرة.

الخطوة الشروع في الترجمة، وهذا هو جمعية مرنا مع الريبوسوم، هو الهدف الرئيسي من تنظيمترجمة 4. ونتيجة لذلك من اللائحة الترجمة فضلا عن غيرها من الخطوات التنظيمية بعد النسخي، 40٪ فقط من التغيرات في تركيز البروتين يمكن تفسير مرنا وفرة 5،6. وهكذا، فإن الدراسة من إجمالي مرنا تعطي معلومات فقيرة نسبيا عن وفرة البروتين. من ناحية أخرى، فإن جمعية مرنا مع الريبوسومات يعطي نظرة أفضل إلى وفرة البروتين مما يتيح الوصول إلى تلك من mRNAs المشاركة في الترجمة. وترتبط من mRNAs تترجم بنشاط مع العديد من الريبوسومات في هياكل ودعا polysomes. على العكس من ذلك، سوف تكون مرتبطة من mRNAs سوء ترجمة مع الريبوسوم واحدة فقط (صبغي جنسي أحادي). ونتيجة لذلك، ووضع متعدية من مرنا يمكن تقييمها من خلال رصد ارتباطه الريبوسومات 7.

يصف هذا البروتوكول عزلة polysomes من ستة أيام القديمة الشتلات نبات الأرابيدوبسيس thaliana، والعزلة لاحقة من الحمض النووي الريبي، وتحليل النتائج. بويتم فصل lysomes وmonosomes من خلال التدرج الكثافة السكروز. يتم جمع التدرجات إلى ستة أجزاء. يتم تجميع بعض الكسور للحصول على ثلاثة أجزاء يفصل جيدا: polysomes، monosomes والأجزاء الخفيفة (ويشار إليها طاف)، الذي يحتوي على حرة 60S و 40S مفارز الريباسي ومن mRNAs التي لا ترتبط مع الريبوسومات. ويمكن تقدير حركة الترجمة العالمي من خلال توليد polysome / نسبة صبغي جنسي أحادي، والتي يتم تحديدها من قبل الاندماج في المنطقة تحت المنحنى، وبمقارنة ملامح polysomes. ثم يتم استخراج من mRNAs والبروتينات من كسور مختلفة وتستخدم للتحليل RT-PCR، QRT-PCR، لطخة الشمالية، ميكروأري، لطخة غربية أو البروتينات. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول للنباتات والأنسجة الأخرى.

تم العثور على المعدات اللازمة لتنفيذ هذا البروتوكول عادة في معظم المختبرات: ليست هناك حاجة لصانع التدرج. تجميد كل طبقة قبل إضافة واحدة المقبل منعالصورة من أي مزيج أو اضطراب في طبقات. لا يتم استخدام ثاقبة أنبوب لجمع الانحدار الذي لا يمكن أن يتحقق عن طريق الغمر من أنبوب زجاجي الشعرية في الانحدار. لذلك، لا تزال أنابيب نابذة مكلفة التالفة ويمكن إعادة استخدامها مرات عديدة. بشكل جماعي، وهذا يجعل هذا البروتوكول وسيلة سهلة ورخيصة لتحديد ملامح polysome.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد 20 إلى 50٪ (ث / ت) السكروز التدرجات

ملاحظة: مصنوعة من التدرجات من 4 طبقات من السكروز (50٪، 35٪ و 2 طبقات من 20٪) في 13.2 مل أنبوب نابذة فائقة السرعة. في تجربتنا، وسكب السكروز 20٪ في طبقتين منفصلتين يحسن إلى حد كبير نوعية الاستعدادات polysome.

  1. إعداد الحلول الأسهم. التأكد من أن جميع الحلول ريبونوكلياز والدناز الحرة.
    1. إعداد 10X محلول الملح: 400 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.4، 200 ملي بوكل و 100 ملي MgCl 2.
    2. إعداد 2 M السكروز الحل: للحصول على 200 مل، حل 137 غرام من السكروز في 1X محلول الملح.
  2. تمييع الحل السكروز في محلول الملح، كما هو موضح في الجدول رقم 1، لإعداد التدرجات. أحجام معينة لمدة ستة التدرجات.
تركيز السكروز النهائي السكروز 2M (مل) الملح حل 1X (مل) المجلد النهائي. (مل)
50٪ 8.8 3.2 12
35٪ 12.9 12.1 25
20٪ 7.4 17.6 25
20٪ 5.8 14.2 20

الجدول 1. التخفيفات من الحل السكروز لإعداد ستة التدرجات.

  1. صب طبقات كما في الجدول 2.
طبقة السكروز 50٪ 35٪ 20٪ 20٪
المجلد. (مل) 1.85 3.65 3.65 1.35

الجدول 2. حجم محلول السكروز لكل طبقة.

  1. بعد صب كل طبقة، والحفاظ على الأنابيب في -40 درجة مئوية أو الفريزر -80 درجة مئوية حتى التجميد الكامل قبل إضافة طبقة السكروز المقبلة. وحققت تجميد عادة بعد 2 ساعة عند -40 درجة مئوية، ولكن الانتظار حوالي 6 ساعات قبل صب الطبقة التالية ينصح. ومشاركة 20٪ طبقة يمكن تجميد أو إضافتها حديثا في يوم التجربة.
    ملاحظة: تجميد كل طبقة قبل إضافة واحدة المقبل يمنع من أي خلط أو اضطراب في طبقات. التدرجات يمكن الاحتفاظ بها في -40 درجة مئوية أو الفريزر -80 درجة مئوية لمدة ستة أشهر على الأقل.
  2. إذا لم يكن قد تم القيام به، إضافة مشاركة 20٪ طبقة إلى التدرجات في يوم التجربة. ثم، والسماح للالتدرجات ذوبان الجليد في غرفة باردة أو الثلاجة.

2. إعداد عصاري خلوي مقتطفات

ملاحظة: نحن موصىينتهي باستخدام اثنين من التدرجات في عينة بيولوجية. 300 ملغ هو المبلغ الأمثل من المواد النباتية لإعداد اثنين من التدرجات عند العمل مع 6 أيام القديمة الشتلات نبات الأرابيدوبسيس thaliana. عند العمل مع أقل الأنسجة النشطة translationally، كمية من المواد النباتية يمكن زيادة تصل إلى 600 ملغ.

  1. حصاد ستة أيام العمر الشتلات المزروعة في نصف Murashige وسكوغ 8 متوسطة تستكمل مع 1٪ سكروز أو وسائل الإعلام ما يعادلها من تجميد سريعة في النيتروجين السائل
  2. المواد النباتية طحن في بمدافع الهاون precooled ومدقة مع النيتروجين السائل.
  3. تزن 300 ملغ من مادة البودرة في صحن وزنها precooled. تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتجنب ذوبان العينة.
    ملاحظة: حافظ على العينات المجمدة لمدة لا تزيد على أسبوع في الثلاجة -80 درجة مئوية.
  4. إضافة 2.4 مل من العازلة polysome precooled (محلول الملح 4X، 5.26 ملي EGTA، 0.5٪ (ت / ت) Octylphenoxy بولي (ethyleneoxy) الإيثانول، تشعبت، 50 ميكروغرام.ملليلتر -1 سيكلوهيكسيميد، 50 ميكروغرام.ملليلتر 1الكلورامفينيكول) والتجانس عن طريق خلط مع طرف ماصة. نقل إلى قسمين أنابيب 1.5 مل. العمل بسرعة لمنع عينات من ارتفاع درجات الحرارة.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية في microcentrifuge لتكوير الحطام.
    ملاحظة: لمنع تدهور الحمض النووي الريبي، ودائما الحفاظ على العينات عند 4 درجات مئوية، واستخدام ريبونوكلياز / الدناز الحلول الحرة والعمل في ظروف خالية ريبونوكلياز / الدناز. الهيبارين يمكن أن تضاف إلى المخزن المؤقت polysome، إلى التركيز النهائي من 300 ميكروغرام.ملليلتر -1، لتعزيز حماية الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، منذ الهيبارين يمكن أن تتداخل مع تحليل المصب، فإنه سيتعين إزالتها أثناء الخطوة هطول RNA عن طريق أداء هطول الأمطار كلوريد الليثيوم بدلا من هطول الأمطار الإيثانول (راجع المذكرة 4.7).

3. Polysome التنميط

  1. ماصة بعناية طاف دون الإخلال بيليه. إذا تم pipetted شظايا مصنع، كرر الخطوة 2.5. تحميل طاف على رأس التدرج pipettin بلطفز على جدار الأنبوب في دفق مستمر. استخدام التدرج واحد لكل أنبوب 1.5 مل.
  2. نقل إلى precooled الدلاء وأجهزة الطرد المركزي في 175000 x ج لمدة 2 ساعة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية، في نابذة فائقة السرعة (على سبيل المثال 32،000 دورة في الدقيقة عند استخدام الدوار SW41).
  3. إعداد نظام لجمع التدرج كما هو موضح في الشكل 1. كفيت الأشعة فوق البنفسجية لها طول المسار 1 مم.

figure-protocol-1
الشكل 1. نظام جمع التدرج. يتم توصيل كفيت الأشعة فوق البنفسجية من أنابيب البولي فينيل كلورايد لأنبوب الزجاج الشعرية التي ينحدر إلى أسفل التدرج. التدرج تقدم من خلال ذلك بفضل نظام لمضخة تحوي. OD 260 قراءة بشكل مستمر ويتم جمع 2 مل الكسور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر منهذا الرقم.

  1. ضبط جامع جزء لRT، وتعيين دائري بسرعة من شأنها أن تسمح جمع 2 مل الكسور. استخدام أنابيب تبريد قبل المجموعة.
  2. جمع الكسور من أسفل إلى أعلى باستخدام أنبوب زجاجي الشعرية متصلة بواسطة أنابيب البولي فينيل كلوريد إلى نظام جمع الانحدار. استخدام فيلم البارافين البلاستيك لتأمين الاتصال بين أنابيب البولي فينيل كلورايد وأنبوب زجاجي الشعرية.
  3. قراءة الامتصاصية في 260 نانومتر من أسفل إلى أعلى التدرج. عندما يتم جمع التدرج بأكمله، ووضع أنابيب جمع على الجليد قبل استخراج الحمض النووي الريبي.

4. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. تجميع الكسور التي تم جمعها من اثنين من التدرجات، في 50 مل توج أنابيب الطرد المركزي، على النحو التالي:
    Polysomes: كسور 1-3 (12 مل)
    Monosomes: جزء 4 (4 مل)
    طاف: كسور 5 و 6 (8 مل)
  2. إلى كل جزء، إضافة 1 المجلد. 8M هيدروكلوريد جوانيداين،50 ميكروغرام الاكريليك الناقل و 1.5 المجلد. الأيسوبروبانول.
    ملاحظة: الاكريليك الناقل الأكريلاميد خطية، كما تستخدم لcoprecipitant لتحسين الانتعاش من الأحماض النووية أثناء هطول الأمطار الكحول.
  3. مزيج من قبل قلب الأنابيب ويعجل O / N في -20 درجة مئوية.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 175000 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية، في نابذة (32،000 دورة في الدقيقة في الدوار SW32). إذا تم تنفيذ الخطوة هطول الأمطار في أنبوب وهو غير متوافق مع تنبيذ فائق، ونقل إلى أنبوب مناسبة.
  5. تجاهل وطاف حل بيليه في 200 ميكرولتر TE العازلة خالية من ريبونوكلياز (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7،5-1 ملم EDTA). نقل إلى أنبوب 1.5 مل الطازجة.
  6. استخراج الحمض النووي الريبي بإضافة 1 المجلد. الفينول المياه المشبعة (درجة الحموضة 6.6) و 1 المجلد. الكلوروفورم: الكحول أيزو أميلي (24: 1). مزيج بقوة. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. نقل المرحلة المائية لأنبوب 1.5 مل جديد.
    ملاحظة: الفينول حمض (4.5 درجة الحموضة) يمكن استخدامها من أجل تقليل التلوث الحمض النووي.
  7. ترسيب الحمض النووي الريبي بإضافة 1/10 المجلد. 3 M خلات الصوديوم و 3 المجلد. الإيثانول بنسبة 100٪. السماح هطول الأمطار في -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أو O / N في -20 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: في حالة استخدام الهيبارين في المخزن المؤقت polysome (راجع المذكرة 2.5)، إجراء كلوريد الليثيوم (LiCl) هطول الأمطار بدلا من الإيثانول لإزالة أي أثر للالهيبارين التي يمكن أن تتداخل مع تحليل المصب 9 بشكل صحيح. بعد الاستخراج، إضافة LiCl إلى تركيز النهائي من 2.5 م السماح هطول الأمطار لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو O / N عند 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  8. غسل بيليه مع 500 ميكرولتر 75٪ من الإيثانول. الهواء الجاف وبيليه وتذوب في المخزن TE 30 ميكرولتر. تقييم نوعية الحمض النووي الريبي الكهربائي على ريبونوكلياز مجانا 1.2٪ agarose هلام (100V، 15 دقيقة) أو عن طريق الأساليب الشعرية الكهربائي.

تحليل 5. البيانات

  1. البيانات الخام للتصدير لبرامج الرسم وتحليل البيانات.
    ملاحظة: كما هو مبين في الشكل 2A وباء، لمحات الخام تعطي المعلومات النوعية: عدد من القمم polysome التي يمكن أن ينظر إليها، في ذروة الذروة صبغي جنسي أحادي، وجود الكتف المقابلة لمفارز الريبوسوم الحرة.
  2. دمج التشكيلات للسماح للمقارنة بين الملفات الشخصية بين العينات. استخدام أداة قارئ الشاشة لتحديد قيمة X الذروة صبغي جنسي أحادي لكل عينة ومحاذاة القمم صبغي جنسي أحادي عن طريق إزالة نقاط بيانات إضافية في بداية المنحنيات. تحديد أدنى نقطة من منحنى وتحديد قيمة Y لها (باستخدام أداة قارئ الشاشة). تعيين أدنى قيمة Y أشر إلى 0 باستخدام وظيفة "قيمة تعيين الأعمدة".
  3. تحديد نسبة polysomes / monosomes من خلال دمج المنطقة تحت المنحنى من ملامح الخام (الشكل 3C). استخدام أداة محدد البيانات لتحديد حدود المنطقة لتكون متكاملة. ثم استخدم وظيفة دمج (التحليل الرياضيات).
  4. تطبيعمنحنيات إلى الذروة صبغي جنسي أحادي بقسمة جميع نقاط البيانات منحنى من قيمة Y من قمة الذروة صبغي جنسي أحادي (تحديد باستخدام أداة قارئ الشاشة). حدد العمود، ثم تحت التحليل الرياضيات، حدد تطبيع واختيار "مقسوما على قيمة محددة" الأساليب. هذه الخطوة تتيح المقارنة بين المستوى النسبي للpolysomes (الشكل 3D).

figure-protocol-2
الشكل 2. ملامح polysome التمثيلية. نبات الأرابيدوبسيس thaliana البرية من نوع (بالوزن، نوع إيكولوجي العقيد-0) كانت تزرع الشتلات ومتحولة لمدة ستة أيام على ½ وسط موراشج وسكوج تحت الضوئية يوم طويل (ضوء 16 ساعة، 8 ساعات الظلام). ج: لمحات polysome الخام من الشتلات بالوزن. ب: لمحات polysome الخام من الشتلات متحولة. C: تحديد نسبة polysomes وmonosomes من التكامل في المنطقة تحت المنحنى D: بروفي Polysomeليه تطبيع إلى الذروة صبغي جنسي أحادي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الأدب، وغالبا ما تظهر ملامح polysome من الكسر الضوء على جزء الثقيل نتيجة الطريقة التي يتم جمعها التدرجات، أي من أعلى إلى أسفل. منذ ذلك الحين في بروتوكول صفها هنا يتم جمع التدرجات من الأسفل إلى الأعلى، لمحات نظهر تبدأ جزء الثقيل (وpolysomes) والذهاب إلى الأجزاء الخفيفة (مفارز الريبوسوم مجاني والرنا) (الشكل 2A). ثم نقوم بجمع كل التدرج في ستة 2 مل الكسور، ولكن أجزاء أصغر يمكن جمع ما إذا كان تحليل أكثر تفصيلا لمحتوى polysome لابد من...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول الذي نقدمه هنا هو طريقة سهلة ورخيصة لتوليد ملفات تعريف polysome وعزل mRNAs المرتبطة بpolysomes أو الريبوسومات المفردة أو خالية من الريبوسومات. تم وصف مجموعة واسعة من طرق تجزئة تعدد الجثوم المختلفة في الأدبيات. تم تحسين الطريقة التي وصفناها هنا للاحتفاظ بالمركبات الضرورية فقط وتم تكييفها مع المواد النباتية. على وجه الخصوص ، قمنا بتقليل كمية المنظف11 وأضفنا الكلورامفينيكول إلى المخزن المؤقت لتثبيت الريبوسومات البلاستيكية الكلورية في الرنا المرسال (كما يفعل سيكلوهيكسيمايد للريبوسومات العصارة الخلوية) <...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية (وكالة الاستخبارات الوطنية-14-CE02-0010). نشكر الدكتور بنيامين الميدان والدكتور إيلودي Lanet لقراءة نقدية للمخطوطة. نشكر السيد ميشيل تيريز لمساعدته مع تحرير الفيديو.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أنبوب الطرد المركزي الفائق ، thinwall ، polyallomer - 13.2 ملBeckman Coulter331372
أنبوب الطرد المركزي الفائق ، thinwall ، polyallomer - 38.5 ملBeckman Coulter326823
أنبوب شعري زجاجيDrummond Scientific1-000-1000
Ultra Centrifuge  ؛بيكمان كولترأوبتيما سلسلة
الطرد المركزي الفائق الدوار SW41بيكمان كولتر331362
الفائق الطرد المركزي SW32بيكمان كولتر369650
مضخة تمغجيةأي
أنابيب Tygon R3607 البولي فينيل كلوريد  فيشر Scientific070534-22أنابيب البولي فينيل كلوريد ، 2.29 مم   ؛
جامع الكسور موديل 2110Bio-Rad731-8120
كوفيت الأشعة فوق البنفسجيةهيلما170.700-QSكوفيتز تدفق الكوفيت
مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجيةVarianCary50اقرأ كل 0.0125 ثانية
جميع المواد الكيميائيةأياستخدام فقط خليط الملح القاعدي من درجة البيولوجيا الجزيئية
Murashige و Skoog (MS)Sigma-AldrichM5524
ماء خال من رناسأي
أطباق بتريفيشر Scientific10083251 
أوكتيل فينوكسي بولي (إيثيلين أوكسي) إيثانول ، متفرع (Nonidet P40)EuromedexUN3500
أكريلاميد خطي (حامل أكريل)ThermoFischer العلميAM9520ناقل ترسيب الحمض النووي الريبي
OriginPro 8برنامج تحليلOriginLab
الدوار

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, C. J., Millar, A. H. Protein turnover in plant biology. Nat Plants. 1 (3), 15017(2015).
  2. Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
  3. Amthor, J. S. The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later. Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).
  4. Preiss, T., W Hentze, M. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).
  5. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).
  6. Baerenfaller, K., et al. Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics. Science. 320 (5878), 938-941 (2008).
  7. Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression. Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).
  8. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  9. del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
  10. Arabidopsis protocols. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Methods in molecular biology; 323. Clifton, N.J. (2006).
  11. Piques, M., et al. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis. Mol syst biol. 5 (314), 314(2009).
  12. Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. Polysome Profiling Analysis. bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).
  13. Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS One. 8 (8), (2013).
  14. Sormani, R., et al. Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels. Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).
  15. Lanet, E., et al. Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs. Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).
  16. Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness. Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).
  17. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470 (10), Elsevier Inc. (2010).
  18. Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).
  19. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polysome ProfilingPlant TissuesSucrose GradientRNA ExtractionUltracentrifugationCytosolic ExtractFraction CollectionOD MeasurementArabidopsis ThalianaNicotiana Benthamiana

Related Articles