مقالة منهجية

عزل بالسكان خلية حول الأوعية متعددة القدرات السلائف من قلب الإنسان الأنسجة

DOI:

10.3791/54252

⸱

أكتوبر 8, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Cardiovascular Science, Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh, 2Department of Bioengineering and Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Research Laboratory of Electronics and Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 5Stem Cell Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 6Department of Orthopaedic Surgery, University of Texas Health Science Center at Houston, 7Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنسجة القلبية الإنسان تؤوي متعددة القدرات ماحول الأوعية السكان الخلية السلائف التي قد تكون مناسبة لتجديد عضلة القلب. تقنية الموضحة هنا يسمح للعزلة في وقت واحد وتنقية اثنين متعددة القدرات سكان الخلية انسجة المرتبطة السفن الأم الدم، أي CD146 + CD34 - pericytes وCD34 + CD146 - خلايا الغلالة البرانية، من عضلة القلب البشري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم عزل الخلايا الجذعية / اللحمية متعددة القدرات (MSC) تقليديا ، من خلال التصاقها البلاستيكي ، من هضم الأنسجة الأولية بينما ظل موقع الأنسجة التشريحية غير واضح. أتاح الاكتشاف الأخير للتعبير المحدد عن علامات الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية والخلايا الجذعية الجذعية بواسطة الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية في أنسجة متعددة من قبل مجموعتنا وباحثين آخرين فرصة لعزل وتنقية مجموعات سكانية فرعية متجانسة محددة من الخلايا السليفة المحيطة بالأوعية الدموية متعددة القدرات. لقد أظهرنا سابقا استخدام فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) لتنقية الخلايا المحيطة CD146 + CD34 والخلايا الوعائية CD34 + CD146 من عضلات الهيكل العظمي البشري. نصف هنا طريقة لعزل هاتين المجموعتين الفرعيتين من الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية في وقت واحد عن عضلة القلب البشرية بواسطة FACS ، بناء على التعبير عن مجموعة محددة من علامات سطح الخلية للتحديدات الإيجابية والسلبية. وبالتالي ، تتيح هذه الطريقة مجموعتين فرعيتين محددتين من الخلايا السليفة متعددة القدرات الشبيهة بالخلايا الجذعية الجذعية القلبية لاستخدامها في البحوث الأساسية و / أو التحقيقات العلاجية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد اعتبر قلب لفترة طويلة جهاز بعد الإنقسامية. ومع ذلك، فقد أثبتت الدراسات الحديثة وجود دوران cardiomyocyte محدود في قلوب البشر الكبار 1. كما تم تحديد الأم الخلايا الجذعية / السلف مع cardiomyocyte التمايز المحتملة داخل عضلة القلب في القوارض الكبار وقلوب البشر، بما في ذلك هيئة السلع التموينية-1 +، ج طقم +، cardiosphere تشكيل، وكان آخرها، وخلايا السلائف المحيطة بالأوعية 2،3. وتمثل هذه الخلايا المرشحين جذابا للالعلاجات التي تهدف إلى تعزيز القلب إصلاح / تجديد من خلال زرع الخلايا أو التحفيز من الانتشار في الموقع.

وقد تم عزل الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة (MSC) من كل الأنسجة البشرية تقريبا أجريت 4،5 التجارب السريرية من التطبيقات العلاجية للجنة السلامة البحرية خارج عن الحالات المرضية متعددة مثل إصلاح القلب والأوعية الدموية 6، الطعم ضد المضيف المرض 7 ، وتليف الكبد 8. وقد نسبت آثار مفيدة لقدرة اللجان الدائمة ل: منزل لمواقع التهاب 9؛ التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا 10؛ تفرز جزيئات الموالية للتعويضية 11؛ وتعدل المضيف الاستجابات المناعية 12. عزل اللجان الدائمة وتعتمد تقليديا على الالتزام تفضيلية لركائز بلاستيكية. ومع ذلك، فإن السكان الناتجة من الخلايا عادة غير متجانسة بشكل ملحوظ (13). باستخدام الفلورسنت خلية تنشيط الفرز (FACS) مع مجموعة من العلامات الرئيسية الخلايا المحيطة بالأوعية، وكنا قادرين على عزل وتنقية تشبه MSC متعددة القدرات السلائف السكان (CD146 + / CD31 - / CD34 - / CD45 - / CD56 -) من الأنسجة البشرية متعددة بما في ذلك الكبار العضلات والهيكل العظمي والأبيض الدهون 14.

وقد تبين أن أعداد الخلايا المحيطة بالأوعية في مختلف الأنسجة غير القلب أن لها خصائص الجذعية / خلية سلفية لالثانية يجري التحقيق للاستخدام السريري في الإعداد القلب والأوعية الدموية. Pericytes، واحدة من مجموعات فرعية الخلايا المحيطة بالأوعية الأكثر شهرة، هي مجموعة متغايرة التي تلعب العديد من الأدوار المرضية بما في ذلك تطوير السفن الجديدة 15، وتنظيم ضغط الدم 16، والحفاظ على سلامة الأوعية الدموية 17،18. كما هو مبين في أنسجة متعددة، مجموعات فرعية محددة من pericytes التعبير أصلا المستضدات لجنة السلامة البحرية والحفاظ الظواهر مثل لجنة السلامة البحرية في الثقافة الابتدائية بعد تنقية FACS 14. وعلاوة على ذلك، وهذه الخلايا مستقر الحفاظ على الظواهر على المدى الطويل في الثقافة ويحمل متعددة النسب إمكانية التمايز، على غرار اللجان الدائمة 19،20. وتشير هذه النتائج إلى أن pericytes هي واحدة من أصل MSC بعيد المنال 14. وقد تجلى الإمكانات العلاجية من pericytes مع انخفاض في تندب عضلة القلب وتعزيز وظيفة القلب بعد زرع إلى إصابة ischemicallyقلوب 21. في الآونة الأخيرة، ونحن تنقيته بنجاح pericytes من عضلة القلب البشري وأظهرت الظواهر الخاصة مثل لجنة السلامة البحرية وmultipotency (تكون الشحم، تكون الغضروف وتكون العظم) مع غياب تكون العضل الهيكل العظمي 3. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت pericytes عضلة القلب فارق القدرات المحتملة وعائية cardiomyogenic بالمقارنة مع نظرائهم تنقيته من الأجهزة الأخرى.

عدد سكانها الثاني من الخلايا المحيطة بالأوعية متعددة القدرات الجذعية / السلف، الخلية الغلالة البرانية، تم عزل من الأوردة الصافن الإنسان على أساس CD34 إيجابي التعبير 22. وقد تبين أن خلايا الغلالة البرانية الوريدية لديها إمكانات مولد الرمع، والقدرة على التمايز أرومية متوسطة وإمكانات proangiogenic في المختبر. أدى زرع هذه الخلايا في قلوب الجرحى ischemically من الفئران في الحد من التليف الخلالي، وزيادة في الأوعية الدموية وتدفق الدم عضلة القلب، وانخفاض البطين ديلأوجه، وزيادة طرد القلب جزء 23. ومن المثير للاهتمام، وقد ثبت أن الخلايا الدهنية الغلالة البرانية لانقاص التعبير CD34 وupregulate التعبير CD146 في الثقافة في الاستجابة للعلاج angiopoietin الثاني، مما يشير إلى اعتماد النمط الظاهري خلية حوطية مع التحفيز 24. داخل القلب، ومع ذلك، فإن سكان الخلية البرانية لم يتم تنقيته مستقبلي من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية و / أو تتميز بشكل جيد. الاستفادة من إجراءات العزل خلية وصفها في الأقسام التالية، نحن تميز حاليا خلايا عضلة القلب الغلالة البرانية والتحقيق في قدرتها على التجدد التطبيقات.

هنا نحن تصف طريقة لعزل وتنقية اثنين من القطعان من الخلايا الجذعية / السلف المحيطة بالأوعية من البشر عضلة القلب الجنين أو الكبار. وهذا المحتملين طريقة العزلة خلية تمكين الباحثين من الحصول على إسوي المحيطة بالأوعية مجموعات فرعية من الخلايا الجذعية / السلف من الخزعات قلب الإنسان للدراسات المقارنة وابعد من ذلكص استكشاف الإمكانات العلاجية في مختلف الحالات المرضية القلبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تجهيز قلب الإنسان عينة

  1. التأكد من أن جميع السوائل والحاويات، والصكوك، ومنطقة العمليات مخصصة تكون عقيمة.
  2. ضع عينة أنسجة القلب (التي اشترتها بنك الأنسجة أو الفريق الجراحي) في وسائط تخزين تتألف من المتوسطة المبردة Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين ستربتومايسين (P / S) على الجليد لنقل 3.
  3. إزالة عينة القلب من وسيلة تخزين ويغسل مع وسيلة غسل تتكون من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل مع 2٪ FBS و 1٪ P / S. عند التعامل مع العينة، واستخدام الملقط يميل غرامة لفهم السفن الكبيرة أو التامور وتقليل سحق من عضلة القلب.
  4. غمر العينة في غسل المتوسطة في طبق بتري وإزالة التامور، البطانة والأوعية الدموية الكبيرة مع مقص القزحية تعقيمها وملقط يميل غرامة كما هو موضح 3.
  5. قطع myoca المتبقيةrdium إلى قطع صغيرة من حوالي 1 ملم 3 باستخدام شفرة حلاقة واحدة جانبية أو زوج من مقص القزحية الحاد. ملاحظة: سيتم الحصول على أعلى عائدات الخليوي إذا تتم معالجة عينات على الفور. إذا كان تأخير أمر لا مفر منه، وتخزين الأنسجة القلبية معالجتها في وسائط تخزين جديدة (> 5 مل لكل 1 سم 3 الأنسجة) في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة هو ممكن، ولكن من المفترض مع انخفاض المرتبطة بها في العائد الخلية.

2. الهضم من الأنسجة وعزل الخلايا

  1. جعل الطازجة حتى حل الهضم تضم 1.5 مل كل من كولاجيناز الأول، كولاجيناز الثاني، وكولاجيناز الرابع (في كل 0.5 ملغ / مل في DMEM) ودافئة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    ملاحظة: حجم وتركيز collagenases هي مناسبة لعينات من حوالي 1 سم 3.
  2. تصفية قطع الأنسجة مع وقف التنفيذ من خلال مصفاة ميكرون 100 ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. نقل قطع من الأنسجة إلى معقمة حاوية 30 مل معغطاء مغلقة بإحكام.
    ملاحظة: الأواني واسعة قصيرة بدلا من أنابيب ضيقة طويلة تعطي نتائج أفضل. بدلا من ذلك، وضع قطعة نسيج في أنبوب 50 مل العقيمة ووضع أفقيا إذا حاوية 30 مل غير متوفرة.
  3. إضافة كافة الحلول الهضم (4.5 مل الكل) ووضع الحاويات داخل كيس من البلاستيك مختوم في 37 درجة مئوية حمام ماء تهز مجموعة إلى 120 دورة في الدقيقة. بدلا من ذلك، وختم الحاويات مع فيلم البارافين ومكان في شاكر المداري ساخنة لتعيين 120 دورة في الدقيقة.
  4. بعد 15 دقيقة، وإزالة وعكس وعاء ثلاث مرات قبل استبدال لمدة 15 دقيقة أخرى. إزالة وإخماد collagenases مع 5 مل من DMEM تستكمل مع FBS 20٪ و 1٪ P / S.
  5. يسحن هضم من قبل pipetting بلطف عشرة إلى عشرين مرة مع ماصة 10 مل المصلية لتفريق أي كتل الأنسجة. تصفية بالتتابع تعليق من خلال 100 ميكرون، 70 ميكرون، وأخيرا 40 مصافى خلية ميكرون لإزالة المواد غير المهضومة والحصول على تعليق خلية واحدة.
    ملاحظة: لا شطف بين مصافى الخلية إلى خلية تجنب debrisgenerated من عملية الهضم الانزيم.
  6. الطرد المركزي تعليق خلية في 200 x ج لمدة 4 دقائق، صب بعناية طاف وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من الخلايا الحمراء الناشر عازلة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل تمييع مع 4 مل من غسل المتوسطة.
  7. كرر الخطوة الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من غسل المتوسطة. تخلط جيدا ويستغرق 10 ميكرولتر من تعليق خلية لمدة عد الخلايا.
  8. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من التريبان وصمة عار الزرقاء ووضع 10 ميكرولتر من الخليط على عدادة الكريات القياسية لعد الخلايا. حساب عدد الخلايا مشرق، جولة الحالي في الساحات الزاوية الأربعة (كل مقسمة إلى ستة عشر مربعات صغيرة) والقسمة على 4 للحصول على متوسط ​​لكل متر مربع الزاوية. مضاعفة متوسط بنسبة 2 إلى حساب لعامل وصمة عار التخفيف ثم بنسبة 10 4 للحصول على العدد الكلي للخلايا لكل 1 مل من العينة.

= "jove_title"> 3. وسم الخلية والفرز

  1. إضافة 50 ميكرولتر من المصل الماوس إلى تعليق الخلية واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لمنع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة.
  2. الطرد المركزي تعليق خلية مع مصل الفأر في 200 x ج لمدة 4 دقائق، وإزالة طاف، وإعادة تعليق في غسل المتوسطة بتركيز 1 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر.
  3. قسامة 50 ميكرولتر كل من تعليق خلية لنمط إسوي والضوابط غير ملوثين إلى قسمين البوليسترين جولة القاع تدفق الخلوي أنابيب ثم ضع حجم المتبقية في أنبوب ثالث لتلطيخ متعددة الألوان.
  4. إضافة CD34-PE، CD45-APC-Cy7، CD56-PE-Cy7، CD144-PerCP-Cy5.5، والأجسام المضادة CD146-AF647 (كل 1: 100) إلى تعليق خلية واحدة لتلطيخ متعددة الألوان. لisotype السيطرة، إضافة وحدات يعادل PE-، APC-Cy7-، PE-Cy7-، PerCP-Cy5.5- والأجسام المضادة نمط إسوي AF647 مترافق. بلطف ماصة للمزيج الأجسام المضادة مع الخلايا واحتضان جميع الأنابيب عند 4 درجة مئوية لمدة 20دقيقة في الظلام.
  5. إعداد حبات تحكم التعويض عن طريق إضافة قطرة واحدة من حبات إيجابية إلى 100 ميكرولتر من غسل المتوسطة في خمس البوليسترين جولة القاع أنابيب التدفق الخلوي. إضافة CD34-PE، CD45-APC-Cy7، CD56-PE-Cy7، CD144-PerCP-Cy5.5، والأجسام المضادة CD146-AF647 (كل 1: 100) كل على حدة من 5 أنابيب. احتضان جميع الأنابيب عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام.
  6. أثناء الحضانة، وإعداد أنابيب جمع خلية كل منها 500 ميكرولتر من غشائي النمو المتوسطة 2 (EGM-2) ثقافة متوسطة ومكان في 4 درجات مئوية.
  7. وبعد الحضانة الضد، إضافة 5 مل من غسل المتوسطة لغسل الخلايا والخرز من أجل إزالة الأجسام المضادة غير منضم. الطرد المركزي جميع الأنابيب في 200 x ج لمدة 4 دقائق. كرر الخطوة غسل والطرد المركزي. بعناية صب وطاف ماصة بلطف عندما خلايا إعادة تعليق.
  8. إعادة تعليق في غسل المتوسطة بتركيز حوالي 1 × 10 6 خلايا في 250 ميكرولتر. إعادة تعليق الخرز في 100 ميكرولتر من غسل مedium.
  9. نقل عن تعليق خلية وحبة لفارز خلية على الجليد في الظلام. إضافة 1 قطرة من الخرز السلبية للأنابيب إيجابية تحكم تعويض حبة واستخدام هذه لتعيين تعويض مضان.
  10. تشغيل الخلايا السيطرة غير ملوثين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لتأسيس مضان الخلفية وتعيين الفولتية لما يلي: FSC 150V. SSC 290V. V450 / 50 350V. V710 / 50 620V. B530 / 30 400V. B710 / 50 530V. YG780 / 60 460. R670 / 30 480V. R780 / 60 460V. تشغيل عناصر تحكم isotypes وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لإنشاء العتبات خلفية مضان المتعلقة غير محددة وملزمة. تشغيل متعددة الألوان عينة الملون وجمع خلية حوطية والسكان الخلية البرانية في أنابيب جمع (الشكل 1).
    ملاحظة: الأمثل غلة خلية قابلة للحياة ما يقرب من 3٪ من إجمالي تفكك الخلايا الحية لpericytes و 4٪ للخلايا الغلالة البرانية.

الثقافة 4. خلية

  1. اختيار لوحات ثقافة حجم المناسبة وفقا لنتائج الفرز FACS. إضافة 100 ميكرولتر من العقيمة 0.2٪ محلول الجيلاتين لكل سم 2 من مساحة النمو وتستنهض الهمم يدويا إلى معطف الآبار بأكملها. احتضان لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وإزالة حل الجيلاتين تماما. حفاظ على الخلايا التي تم جمعها على الجليد في حين إعداد لوحات ثقافة.
    ملاحظة: pericytes فرز طازجة وخلايا الغلالة البرانية تنمو جيدا عند المصنف في مناطق ذات كثافة من 30،000 إلى 40،000 خلية / سم 2 على سطح الثقافة المغلفة الجيلاتين.
  2. الطرد المركزي الخلايا التي جمعت حديثا في 200 x ج لمدة 4 دقائق وبلطف إعادة تعليق بيليه خلية في كمية مناسبة من الجمعية العامة غير العادية، 2.Seed الخلايا على لوحات الجيلاتين المغلفة.
    ملاحظة: العدد الفعلي للخلايا أن المصنف لكل بئر وكمية من الجمعية العامة غير العادية-2 التي يمكن ان تضاف تعتمد على اختيار اللوحة. على سبيل المثال، 0.5 مل و 1 مل EGM-2 هناك حاجة لكل بئر لوحات 48- و 24 جيدا على التوالي.
  3. صرف EGM-2 للأجل المتوسط ​​نمو الخلايا ماحول الأوعية (تستكمل DMEM مع FBS 20٪ و 1٪ P / S) لكلا pericytes وخلايا الغلالة البرانية مرة واحدة خلايا استقروا والالتزام بها لوحة (بعد لا يقل عن 72 ساعة). تغيير وسائل الاعلام كل 72 ساعة من الآن فصاعدا. تنفيذ حضانات لاحقة الأولية وكلها في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية.
  4. فصل الخلايا باستخدام 0.05٪ التربسين EDTA عندما pericytes وخلايا الغلالة البرانية تصل إلى 80-90٪ التقاء. إخماد مع 20٪ FBS في برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 4 دقائق، وإعادة تعليق في المحيط بالأوعية المتوسطة نمو الخلايا، ومن ثم تمرير الخلايا في نسبة 1: 3 على لوحات ثقافة البوليسترين غير المصقول. من الممر 2 فصاعدا، خلايا مرور في نسبة 1: 5 (أو على حوالي 7000 خلية / سم 2) لوحات ثقافة البوليسترين غير المصقول أو قوارير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتتميز الخلايا واحد من الحطام والحلل على أساس من الأمام والجانب مبعثر التوزيعات. وقد تم تحديد الخلايا الحية وبسبب إخفاقهم في تناول الصبغة دابي. وقد تم اختيار استراتيجية المحاصرة على أساس وضع العلامات isotype السيطرة على هذا الحي، كامل القلب تفكك خلية (الشكل 1). من الخلايا الحية، وبوابات CD45 + الخلايا لأول مرة، تليها CD56 + الخلايا. ثم تم إزالة CD144 + الخلايا البطانية من CD56 - الكسر. من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدلة متزايدة تدعم القدرة على التجدد محدودة من قلب الإنسان الكبار بعد تعافيه من الاصابة. تحديد وتوصيف الخلايا الطليعية الأم مسؤولة عن مثل هذه الردود التجدد في قلوب المصابة حاسمة لكلا فهم الآليات المرتبطة بها ومسارات إشارات ووضع نهج للاستفادة من هذه الخلايا علاجيا.

ووصف البروتوكولات السابقة عزل مجموعات فرعية خلية السلائف المحيطة بالأوعية من العضلات والهيكل العظمي الإنسان 25. ومع ذلك، فإن التطبيق المباشر ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تعارض للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرغب المؤلفون في شكر شونا جونستون وكلير كراير وفيونا روسي وويل رامزي في جامعة إدنبرة وأليسون لوغار وميغان بلانشارد في جامعة بيتسبرغ على مساعدتهم الخبيرة في قياس التدفق الخلوي. نود أيضا أن نشكر آن سوندرسون وليندسي موك على مساعدتهما في الحصول على الأنسجة البشرية. تم شراء عينات من أنسجة قلب البالغين والجنين بإذن أخلاقي كامل من لجنة NHS Scotland Tayside لأخلاقيات البحث الطبي ولجنة أخلاقيات البحث في NHS Lothian (REC08 / S1101 / 1) على التوالي. تم دعم هذا العمل من خلال منح من مجلس البحوث الطبية (BP) ، ومؤسسة القلب البريطانية (BP) ، وكومنولث بنسلفانيا (BP) ، ومستشفى الأطفال في بيتسبرغ (BP) ، والمعهد الوطني للصحة R01AR49684 (JH) و R21HL083057 (BP) ، وكرسي Henry J. Mankin Endowed في جامعة بيتسبرغ (JH). تم دعم JEB من قبل جائزة تدريب الدكتوراه من مركز التميز البحثي لمؤسسة القلب البريطانية (RE / 08/001/23904). تم دعم WC جزئيا من خلال زمالة ما قبل الدكتوراه من جمعية القلب الأمريكية (11PRE7490001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة حبة ABC المضادة للفأرالمجسات الجزيئيةA-10344
Collagenase IGibco17100-017إعادة تكوين المسحوق كما هو مطلوب وتصفية التعقيم
Collagenase IIGibco17101-015
Collagenase IVGibco17104-019
CD34-PEBD Pharmingen555822الحفاظ على العقم
مكافحة البشر CD45-APC-Cy7BD Pharmingen557833الحفاظ على معقم
مضاد للإنسان CD56-PE-Cy7BD Pharmingen557747الحفاظ على معقم
مضاد للإنسان CD144-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566الحفاظ على معقم
مضاد للإنسان CD146-AF647AbD SerotecMCA2141A647الحفاظ على معقم
EGM2-BulletKitLonzaCC-3162لجمع الخلايا والثقافة حتى التصاق
ب DMEM ، ارتفاع الجلوكوز ، GlutaMAX بدون بيروفات الصوديومThermoFischer Scientific10566-016
مصل الأبقار الجنينيThermoFischer Scientific10500-064تجميد في الكميات والحفاظ على
الجيلاتينSigma AldrichG1393تمييع بالماء المعقم
IgG1k-PEBD Pharmingen559320حافظ على معقم
IgG1k-APC-Cy7BD Pharmingen557873حافظ على معقم
IgG1k-PE-Cy7BD Pharmingen557872حافظ على معقم
IgG1k-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566حافظ على معقم
IgG1k-647AbD SerotecMCA1209A647حافظ على
مصل الفأرSigma AldrichM5905Keep
فيلم البارافين المعقم - Parafilm MSigma AldrichP7793
Penicillin-StreptomycinGibco15979-063تجميد في الحصص والحفاظ على معقم
الفوسفات المخزن محلول الرقم الهيدروجيني 7.4ThermoFischer Scientific10010-023حافظ على معقم
محلول خلايا الدم الحمراء عازلة Hybri-MaxSigma AldrichR7757حافظ على
التريبان المعقم الحل الأزرقسيجما ألدريتشT8154
التربسين-EDTA 0.5٪ (10x)Invitrogen15400-054
  ؛ فاساريا فيوجنBD فارمينجنفارز الخلايا المنشطة
المعقم المعقم مضان

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33 (2), 557-573 (2015).
  4. Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98 (8), 2396-2402 (2001).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  6. Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94 (1), 92-95 (2004).
  7. Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81 (10), 1390-1397 (2006).
  8. Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21 (10), 1199-1205 (2009).
  9. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15 (10), 730-738 (2008).
  10. Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35 (9), 1466-1475 (2007).
  11. Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (5), 1634-1643 (2008).
  12. Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20 (1-2), 55-60 (2008).
  13. Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31 (2), 312-317 (2013).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  15. Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6 (3), 241-249 (2003).
  16. Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51 (5), 363-369 (2000).
  17. Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15 (4), 215-228 (2004).
  18. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314 (1), 15-23 (2003).
  19. Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
  20. Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67 (3), 711-720 (2010).
  21. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31 (2), 305-316 (2013).
  22. Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121 (15), 1735-1745 (2010).
  23. Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109 (8), 894-906 (2011).
  24. Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21 (8), 1299-1308 (2012).
  25. Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Perivascular Precursor CellsCardiac Tissue IsolationFluorescent Activated Cell SortingCD146 CD34 MarkersTissue Digestion ProtocolCell Strainer FiltrationFlow Cytometry AnalysisCell Viability AssessmentMyocardial Progenitor CellsCell Surface Markers

مقالات ذات صلة