مقالة منهجية

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

DOI:

10.3791/54265

⸱

أغسطس 13, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences in Philadelphia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> بروتوكولات لثقافة الخلايا البطانية الوريدية السرية البشرية (HUVEC) ، والتعدي العابر للعلامات ذات العلامات الفلورية لنمو الأنابيب الدقيقة ، وتصوير الخلايا الحية والتحليل الآلي لديناميكيات نمو الأنابيب الدقيقة بين الأطوار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب العملية الفسيولوجية التي تتشكل بها الأوعية الدموية الجديدة من الأوعية الدموية الحالية أحداث إشارات محددة تؤدي إلى تغييرات مورفولوجية داخل الخلايا البطانية الفردية (ECs). هذه العمليات ضرورية للصيانة الاستتبابية مثل التئام الجروح ، كما أنها ضرورية في تعزيز نمو الورم ورم خبيث. يتم تعريف مورفولوجيا EC من خلال تنظيم الهيكل الخلوي ، وهو نظام منظم بإحكام لديناميكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة (MT) المعروف بالتحكم في تفرع EC والقطبية والهجرة الاتجاهية ، وهي مكونات أساسية لتكوين الأوعية. لدراسة ديناميكيات MT ، استخدمنا الفحص المجهري الفلوري عالي الدقة إلى جانب تحليل الصور الحسابية لنهايات MT الإضافية المسماة بالفلورسنت للتحقيق في ديناميكيات نمو MT وتنظيم مورفولوجيا تفرع EC والهجرة الاتجاهية. تم إجراء التصوير بفاصل زمني للخلايا البطانية للوريد السري البشري الحية (HUVECs) بعد التعدي باستخدام بروتين MT End Binding 3 المسمى بالفلورسنت (EB3) وتركيبات cDNA الخاصة ب Centromere Associated Kinesin (MCAK) لتقييم التأثيرات على ديناميكيات MT. تم استخدام برنامج PlusTipTracker لتتبع نهايات MT plus المسماة EB3 من أجل قياس سرعات نمو MT وعمر نمو MT في صور الفاصل الزمني. تسمح هذه المنهجية بدراسة ديناميكيات MT وتحديد كيف يساهم التنظيم الموضعي لديناميكيات MT داخل المناطق الخلوية الفرعية في عمليات تولد الأوعية الدموية لتفرع EC وهجرته.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تشغيل الأوعية الدموية عن طريق الاشارات إشارات الخلية التي تعزز الخلايا البطانية (ECS) إلى استقطاب، تهاجر مع خصوصية الاتجاه، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة في الأنسجة التي تحتاج إلى إمدادات الدم. العوامل المساهمة يعتقد أن تدفع الأوعية الدموية هي إشارات من المصفوفة خارج الخلية (ECM). في استجابة لمنبهات المادية، ECS تمديد فروع جديدة مع خصوصية الاتجاه لتوجيه حركة الاتجاه في تشكيل 1،2 شبكة الأوعية الدموية. يتم تعريف بنية مورفولوجية EC والمتفرعة من قبل تنظيم مترجم من الهيكل الخلوي أنيبيب (MT) في الطريقة التي يتم تنسيقها مع تنظيم ACTO-الميوسين انقباض 3. من أجل فروع المفوضية الأوروبية لتشكيل، الميوسين-II يجب downregulated محليا، مما أدى إلى نتوءات غشاء المترجمة 4. في نفس الوقت وفي نفس المكان داخل الخلية، تصبح ديناميات النمو MT تعديل مما أدى إلى بطء واستمرار النمو MT لتعزيز فرع ايلونgation والاستقرار 5. هذه اللائحة هيكل الخلية منسقة يسمح ECS لاستقطاب التشكل لتسهيل الهجرة الاتجاه.

تطوير مورفولوجيا الخلايا الاستقطاب تتطلب MT الاستقطاب التجمع 6. في هجرة الخلايا الظهارية، النظام التجاري المتعدد الأطراف تنمو ببطء وإصرار على وجه التحديد في طليعة من الخلية 7-9. بينما في الخلايا العصبية، وبدء واستطالة من المحاور أو التشعبات يتطلب أن النظام التجاري المتعدد الأطراف هي الحالية فحسب، بل أنهم يخضعون لعمليات التجميع والتفكيك 10-15 حيوي. وبهذه الطريقة، ومراقبة المترجمة من ديناميات النمو MT تحدد بنية الخلية، ويسمح لإعادة السريع للمورفولوجيا الخلايا كما ECS التنقل من خلال ECM بهم.

وينظم ديناميات النمو MT عائلات البروتينات المحركات الجزيئية والبروتينات غير الحركية، ووصف أنيبيب أسوشيتد البروتينات أو أنيبيب متبادلة البروتينات (refe من الآن فصاعداrred إلى شكل خرائط). يتلخص يمكن تفعيلها محليا أو المعطل، وعادة من خلال إشارات أجهزة الطرد المركزي التي بدأت في واجهة خلية ECM 16،17. وظيفة والخرائط مرة واحدة نشطة من قبل ملزما للطن متري، وتغيير حركية التجمع طن متري، والتفكيك. وبالتالي تعمل على تنظيم محليا ديناميات MT من أجل تعزيز شكل الخلية والاستقطاب 18-20. الإنقسامية السنترومير أسوشيتد كينيسين (MCAK) هو كينيسين-13 MAP الأسرة التي تربط لغايات طن متري، والأزواج المائي ATP إلى MT التفكيك 21-23. وتعرف هذه الدور الوظيفي للMCAK أن تكون حاسمة في الإنقسامية المغزل 24-28، وكذلك أثناء الطور البيني 29،30. ضمن البيني ECS، وينظم بوساطة MCAK التفكيك طن متري بحلول محلية أورورا-A الفسفرة الناجم من MCAK ردا على الجرح الحافة تفعيل الناجم من GTPase RAC1 صغير. نتائج هذا شلال يشير هو تثبيط MCAK في طليعة من ECS، مما أدى إلى نمو MT المستقطب نحو جنيهADING حافة والناجم عن MCAK MT التفكيك في الحافة الخلفية المهاجرة ECS 31.

وقد استخدمت المنهجيات التقليدية لقياس ديناميات النمو MT عادة تتبع يد إما تويولين fluorescently المسمى أو، في الآونة الأخيرة، fluorescently المسمى-MT نهاية ملزم البروتين 1 أو 3 (EB1 أو EB3، على التوالي). النهج تويولين الفلورسنت في الاستفادة من وصفها مجموعة MT بأكملها. ومع ذلك، لأن الغالبية العظمى من أنواع الخلايا الإنقسامية الحفاظ على مجموعة شعاعي من النظام التجاري المتعدد الأطراف أثناء الطور البيني 8،32،33، النظام التجاري المتعدد الأطراف بالقرب من الجسيم المركزي هي كثيفة جدا، ونتيجة لذلك، وتتبع نمو طن متري، والتفكيك مع تويولين الفلورسنت وعادة ما تقتصر على الطرفية مناطق الخلية. وبسبب هذه القيود، وقد تم استخدام البروتينات EB-fluorescently المسمى (EB1 أو EB3) النهج الأكثر شيوعا لقياس ديناميكية طن متري. لأن EBS تسمية فقط المتنامية زائد أقاصي النظام التجاري المتعدد الأطراف، فإنها تبدو وكأنها صغيرة (1-3 ميكرون)، فلوري الزاهية يأتيالخبر، وبالتالي توفير علامة ملحوظ بسهولة من MT البلمرة مع محدود جدا مضان الخلفية 34-37. في حين أن EBS التسمية فقط مجموعة فرعية من مجموعة MT تمثل القوة الرئيسية في منهجية EB، فإنه يسلط الضوء أيضا واحدة الحد المهم، لا يتم المسمى أن النظام التجاري المتعدد الأطراف غير متزايد من قبل نهج EB3. ومع ذلك، فإن القدرة على قياس وتتبع المذنبات EB3 مع مرور الوقت وتصور النمو MT داخل الأقاليم الفرعية الخلوية جعل هذا النهج المثالي للتطبيقات التي تتطلب تقييم الإقليمي لمنظمة طن متري.

وكان الحد الحرج آخر المنهجيات التقليدية لقياس ديناميات النمو MT مجموعات البيانات الكبيرة جدا والوقت اللازم لتحليل البيانات. وينبع هذا الحد من الحاجة إلى تتبع يد مئات من المذنبات EB في قرار الأوان. وعلاوة على ذلك، تحتاج هذه القياسات ينبغي القيام به في عدد كبير إحصائيا من الخلايا وأجريت في إطار مجموعة من الرقابة وexperime أيضاشروط ntal. في الآونة الأخيرة، وقد تم التغلب على هذه المعوقات من خلال تقنيات تحليل الحسابية موجهة تحديدا في المذنبات تتبع EB3 استخدام الوقت الفاصل بين المجهري في الخلايا الحية 35. عند استخدامها بشكل مناسب، وهذا النهج الحسابي يخدم على حد سواء تقييد إمكانية للخطأ البشري المرتبط ناحية تتبع بالإضافة إلى النص على طريقة والإنتاجية العالية لقياس MT البلمرة. التحليل الحسابي للديناميات MT باستخدام حزمة البرمجيات القائمة على ماتلاب، plusTipTracker، ويسمح لقياسات النمو MT عن طريق تتبع المذنبات EB3 fluorescently المسمى 5،31،35،38. بالإضافة إلى ذلك، البرنامج plusTipTracker يسمح للحسابات أحداث كارثة MT (ويعرف أيضا باسم التفكيك) استنادا إلى اختفاء المذنبات EB3 في تزايد المسار MT، ويسمح للتحليل دون الخلوي (الإقليمي ويعرف أيضا باسم) من ديناميات النمو MT داخل المناطق المعرفة من الفائدة . لدراستنا، وتمت مقارنة ديناميات النمو MT داخلمناطق متفرعة مقابل المناطق غير متفرعة، أو داخل الرائدة مقابل زائدة حواف الخلية. ويمكن أيضا إخراج البيانات من البرامج plusTipTracker أن تستخدم لتوليد مرمزة تراكب المسار الصحيح للخلايا فردية والمناطق الفرعية الخلوية.

نحن هنا وصف المنهجية المستخدمة للتحقيق في دور MCAK في تحوير ديناميات النمو طن متري، ومساهمة هذا depolymerase MT إلى تنظيم المفوضية الأوروبية المتفرعة التشكل والهجرة الاتجاه. تستخدم نهجنا خط أساسي البشري الخلايا، خلايا الحبل السري الإنسان الوريد غشائي (HUVECs)، والتي هي تربيتها بسهولة وقابلة للغاية لالناجم عن Electroporation لل، ترنسفكأيشن عابرة من كدنا] البلازميد. ثم استخدمنا عالية الدقة، والوقت الفاصل بين مضان المجهري HUVECs transfected مع MT نهاية ملزم بروتين 3 (EB3) والميتوزى السنترومير أسوشيتد كينيسين (MCAK) [كدنا -specific يبني لتقييم الآثار المترتبة على ديناميات MT transfected HUVECs. استنادا PlusTipTracker تحليل صورة الحسابية من EB3كان MT -labeled بالإضافة إلى الغايات لقياس سرعة نمو طن متري، وعمر النمو MT في الوقت الفاصل بين الصور، لقياس ومقارنة آثار التلاعب التجريبية على ديناميات النمو طن متري. هذه المنهجية تسمح لدراسة ديناميات طن متري، وتحديد كيفية تنظيم محلي ديناميات MT داخل المناطق الفرعية الخلوية يساهم في عمليات عائية من المفوضية الأوروبية المتفرعة والهجرة. هذه التقنيات قابلة للتطبيق على التحقيق في أي خطة التي يمكن fluorescently المسمى، وأعرب في الخلايا الحية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HUVEC الثقافة والصيانة

  1. إعداد الكامل المتوسطة القاعدية البطانية بإضافة محتويات نمو الخلايا حزمة متوسطة ملحق البطانية و 5٪ البنسلين / الستربتومايسين خليط المضادات الحيوية لالفينول الحرة أحمر وسائل الاعلام القاعدية البطانية (انظر المواد / قائمة المعدات لمزيد من التفاصيل). دافئ كامل المتوسطة القاعدية البطانية إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. إزالة أحد cryovial HUVEC من تخزين النتروجين السائل وذوبان الجليد بسرعة في 37 ° C حمام الماء لمدة 2 دقيقة. عندما ~ 80-90٪ إذابة، إضافة 500 ميكرولتر من درجة حرارة الكامل المتوسط ​​القاعدية البطانية إلى cryovial، مزيج من قبل pipetting، والاستغناء عن خلايا بالتساوي إلى 100 ملم صحن زراعة الأنسجة بلاستيكية تحتوي على 15 مل من درجة حرارة الكامل المتوسط ​​القاعدية البطانية.
  3. مكان الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. السماح للخلايا الالتزام بين عشية وضحاها. لا تقم بإزالة أو تغيير مستنبت الخلية.
  4. عندما طبق 100 ملم هو> 90٪ متموجة، ونقل HUVECs طn ل75 سم 2 زراعة الأنسجة المعالجة قارورة والحفاظ على التقاء في> 60٪ في جميع الأوقات (راجع الخطوة 1.5).
    ملاحظة: عندما حافظت على كثافة> 60٪، HUVEC مضاعفة الوقت هو على الدوام 18-20 ساعة.
    1. في الحالات التي الركض الخلايا ليس من الضروري (أي كثافة <90٪)، ونضح المتوسطة واستبدالها مع جديدة كاملة المتوسطة القاعدية البطانية كل 48 ساعة.
  5. عندما تصل HUVECs> 90٪ التقاء، وشطف 2 مرات مع 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X، ثم قم بإزالة الخلايا من صحن زراعة الأنسجة من خلال معاملتهم 1.5 مل من 0.25٪ التربسين لمدة 1-2 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: قابلية HUVECs وتقلص إلى حد كبير من خلال توسيع طول التعرض التربسين.
  6. خلايا الإنقاذ بإضافة 8.5 مل كامل المتوسطة القاعدية البطانية إلى التربسين / HUVEC الخليط في نسبة 4: 1 البطانية القاعدية وسائل الإعلام كاملة: التربسين (الحد الأدنى من النسبة)، وجمع في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 1400 x ج لمدة 4 دقائق. نضحطاف.
  8. Resuspend وبيليه في 2 مل من اكتمال المتوسطة القاعدية البطانية وإضافة الخلايا إلى 225 سم 2 الأنسجة قارورة ثقافة جديدة تحتوي على 25 مل من اكتمال المتوسطة القاعدية البطانية.

2. إعداد ساترة قبل HUVEC الثقافة

  1. Coverslips طلاء مع [فيبرونكتين ركائز.
    1. إعداد حاد-نظيفة 22 ملم رقم 1.5 coverslips 39 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT) في الإيثانول بنسبة 100٪.
    2. استخدام موقد بنسن للهب ساترة ووضعه في طبق بتري 35 ملم باستخدام الملقط.
    3. إعداد فبرونيكتين / PBS الخليط عن طريق خلط 10 ميكرولتر من الأسهم فبرونيكتين (1 ملغ / مل) مع 990 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    4. ماصة 250 ميكرولتر من فبرونيكتين / PBS الخليط على ساترة في صحن 35 ملم. موزعة بالتساوي لتغطية سطح ساترة.
    5. احتضان الطبق مدة لا تقل عن 3 ساعة على 37 درجة مئوية، وشطف 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X قبل الاستخدام.
  2. Coverslips طلاء مع بولي أكريلاميد (PA) ركائز.
    1. تفعيل ساترة
      1. وضع 22 ملم رقم 1.5 ساترة في 50٪ 3-aminopropyltrimethyloxysilane لمدة 10 دقيقة على طبق من ضجة. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل 10 مرات لمدة 2 دقيقة لكل منهما في المقطر انقر نقرا مزدوجا H 2 O ([ده 2 O).
      2. احتضان ساترة في 0.5٪ غلوتارالدهيد لمدة 30 دقيقة على طبق من ضجة. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل 10 مرات لمدة 2 دقيقة في ده 2 O.
    2. إعداد بولي أكريلاميد
      1. إعداد هلام السلطة الفلسطينية مع امتثال 0.7 kilopascal (باسكال) وذلك بإضافة 3.75 مل من 40٪ مادة الأكريلاميد، 0.3 مل من 2٪ مكرر الأكريلاميد، و0.95 مل من ده 2 O.
      2. يعد حل العاملة 10٪ من فوق كبريتات الأمونيوم (APS) وتخزينها على الجليد حتى الاستخدام.
      3. لإعداد حل السلطة الفلسطينية ل1 ساترة (إجمالي حجم = 166.7 ميكرولتر)، إضافة 0.83 ميكرولتر من ده 2 O، 41.7 ميكرولتر من الحل مكرر الأكريلاميد (صنع في خطوة 2.2.2.1)، و 124 ميكرولتر من 10٪ وكالة الأنباء الجزائرية، و 0.25 ميكرولتر من TEMED.
      4. على الفور الماصة 15 ميكرولتر من حل السلطة الفلسطينية على شريحة زجاجية مسعور (انظر قائمة الكواشف)، وتغطي مع المنشط 22 ملم رقم 1.5 ساترة. السماح للسلطة الفلسطينية لبلمرة لمدة 20 دقيقة في RT.
      5. إزالة ساترة ونقل إلى صحن 35 ملم. يغسل 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X. تخزين ل<2 أسابيع في 4 درجات مئوية.
      6. لربط فبرونيكتين إلى هلام بولي أكريلاميد، كشف لل coverslips المغلفة بولي أكريلاميد إلى 2 مم سلفو SANPAH مع 7500 J من الأشعة فوق البنفسجية (254nm). شطف مرة واحدة مع ده 2 O.
      7. إعداد فبرونيكتين / PBS الخليط عن طريق خلط 10 ميكرولتر من الأسهم فبرونيكتين (1 ملغ / مل) مع 990 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
      8. ماصة 250 ميكرولتر من فبرونيكتين / PBS الخليط على ساترة (ق) في طبق بتري 35 مم. موزعة بالتساوي لتغطية سطح ساترة.
      9. احتضان الطبق مدة لا تقل عن 3 ساعة على 37 درجة مئوية، وشطف 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X قبل الاستخدام.

الطبقة = "jove_title"> 3. [كدنا ترنسفكأيشن وHUVEC الثقافة على ساترة

  1. أكمل الخطوات 1،5-1،6.
  2. باستخدام عدادة الكريات، عد عدد الخلايا وجمع مجلدا يحتوي 100000 خلية / ساترة (لتجارب غير الهجرة) أو 500000 خلية / ساترة (لتجارب الهجرة). بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1400 x ج لمدة 4 دقائق.
    ملاحظة: يتم وصف بروتوكول الهجرة في القسم 9 أدناه.
  3. Resuspend الخلايا لتكون transfected مع 100 العازلة Electroporation للميكرولتر. تتحد مع 1 ميكروغرام [كدنا ومكان في كوفيت Electroporation لل. خلايا Electroporate: خليط الحمض النووي باستخدام البرنامج المخصصة لHUVEC Electroporation لل(على سبيل المثال برنامج #: A-034).
  4. إنقاذ transfected الخلايا مع 500 ميكرولتر الخلايا المتوسطة ولوحة القاعدية البطانية كاملة على 22 ملم رقم 1.5 ساترة المغلفة فبرونيكتين (انظر بروتوكول 2.1 أعلاه). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة لإتاحة الوقت للتعبير عن بنيات كدنا].
لو "> 4. إعداد العينات للتصوير

  1. قطع الشريط على الوجهين إلى 2.5 سم × 0.65 سم شرائط.
  2. الحصول على شريحة زجاجية نظيفة. خذ قطعتين من الشريط على الوجهين وتأمينها أفقيا على طول الحافة العلوية والسفلية من الشريحة. ملاحظة: من المهم السماح لكمية صغيرة من الفضاء بين الشريط وحافة الانزلاق لاغلاق الغرفة كما هو موضح في الخطوة 4.5).
  3. جبل ساترة (من الخطوة 3.4، الجانب الخلية أسفل) بحيث 2 حواف بقية ساترة على الشريط. استخدام الملقط في الضغط برفق لتأمين ساترة.
  4. باستخدام micropipette، إضافة 40 ميكرولتر من المتوسطة التصوير (كاملة المتوسطة القاعدية البطانية تستكمل مع 25 ميكرومتر HEPES) بين ساترة والشريحة. تأكد من أن المسافة بين ساترة والشريحة شغل تماما مع متوسط ​​التصوير. نضح المتوسطة التصوير الزائد (إذا لزم الأمر).
  5. ختم جميع الحواف مع VALAP الدافئة (1: 1: 1 الفازلين: اللانولين: البارافين). تحقق من وجود تسرب عن طريق دفع gently على ساترة الزجاج.
  6. مكان شنت ومختومة ساترة قبل تحسنت (37 ° C) المرحلة المجهر.

5. المجهري

  1. باستخدام المجهر الغزل القرص مبائر مجهزة 60X، 1.40 العددية فتحة (NA) التفاضلي التدخل التباين (DIC) الغمر النفط العدسة الشيئية، نظام رصد التركيز الآلي (PFS)، مصراع الإلكترونية للإضاءة المنقولة، motored العاشر و-Y المرحلة، والفرقة مرشحات تمرير يضم في عجلة تصفية الإلكترونية، ووحدة الموحد ليزر أحادية، والتركيز المجهر في واجهة الخلية / ساترة واستخدام عصا التحكم مرحلة المجهر لتحديد خلية واحدة.
  2. انقر على لوحة "إعدادات الكاميرا" في البرنامج صورة. ضمن "وقت التعرض" نافذة المنسدلة من لوحة إعدادات الكاميرا، حدد 400 ميللي ثانية.
    ملاحظة: قد تتغير مدة التعرض، وينبغي أن تحدد تجريبيا.
  3. انقر على لوحة "ND اكتساب" فيبرنامج حاسوبي الصورة. ضمن علامة التبويب امدا (λ) من لوحة ND شراء، انقر على خانات الاختيار لتحديد 488 و 561 نانومتر أشعة الليزر. ضمن "الوقت" علامة التبويب لوحة ND شراء، ضبط الوقت اقتناء إلى 2 ثانية والوقت الإجمالي لمدة 2 دقيقة.
  4. انقر على زر "تشغيل الآن" في لوحة ND شراء للاستحواذ على 2 دقيقة الوقت الفاصل بين تسلسل الصور في 2 فترات اكتساب ثانية باستخدام 400 زمن التعرض مللي ثانية لكل من الإضاءة 488- و 561 نانومتر.
  5. في لوحة "تكوين بصري" من البرنامج صورة وباستخدام إعدادات الكاميرا هو موضح في الخطوة 5.2، انقر على زر ليزر 405 نانومتر ومن ثم انقر فوق "الحصول" لالتقاط صورة واحدة من البروتين الفلوري الأزرق (حزب الحرية) البروتينات -labeled .
    ملاحظة: ينصح عادة للحد من التعرض الخلية (تردد من التقاط الصور و / أو وقت التعرض) لإضاءة ليزر 405 نانومتر لأن هذا الطول الموجي يمكن أن تتلف الخلايا مع مرور الوقت.
    1. للدراسات MCAK-shRNA، لcquire صورة واحدة 405 نانومتر للتحقق من التعبير عن shRNA المسمى حزب الحرية.
  6. في لوحة "تكوين بصري" من البرنامج صورة وباستخدام إعدادات الكاميرا هو موضح في الخطوة 5.2، انقر على زر مدينة دبي للإنترنت ومن ثم انقر فوق "الحصول" لالتقاط صورة مدينة دبي للإنترنت واحد من الخلية لالمتفرعة تحليل مورفولوجيا (انظر القسم 10 ، أدناه).
  7. وبعد الحصول على الصور، واستخدام "/ النقيض سطوع" وظيفة في البرنامج صورة لزيادة رقميا إشارة الصورة.
  8. تصدير السطوع والصور المعدلة لالنقيض. انقر فوق "ملف" ثم انقر فوق "حفظ باسم"، ثم انقر لتحديد ". TIF" لنوع ملف الصورة.
    ملاحظة: هذه عادة يولد 61 ملفات .tif صورة من 2 دقيقة اكتساب الوقت الفاصل بين واحد عندما استولت كما هو موضح في الخطوة 5.4.

6. MT تحليل ديناميات

  1. لتتبع EB3، استخدام البرمجيات plusTipTracker 35، مفتوح المصدر،استنادا ماتلاب حزمة البرمجيات الحاسوبية المصممة للكشف التلقائي، وتتبع وتحليل وتصور EBS fluorescently المسمى.
  2. plusTipGetTracks واجهة المستخدم الرسومية (GUI)
    1. للوصول إلى plusTipGetTracks واجهة المستخدم الرسومية، نوع plusTipGetTracks.
    2. للكشف عن EB3 المذنب، استخدم واجهة المستخدم الرسومية لتصفح وحدد الدليل الأم الذي يحتوي على الصور. TIF.
    3. في لوحة المعلمات تتبع للplusTipGetTracks واجهة المستخدم الرسومية، أدخل القيم التالية: نطاق البحث الشعاع = 5-10. الحد الأدنى طول الفرعية المسار = 3؛ ماكس الفجوة طول (لقطة) = 12؛ ماكس فاكتور انكماش = 1.0؛ أقصى زاوية الأمام = 25؛ أقصى زاوية الخلف = 10؛ تقلب الشعاع (بكسل) = 2. معدل الإطار (ثانية) = 2؛ بكسل الحجم (ميكرون) = 110.
      ملاحظة: أولا التحقق من المعلمات تتبع المثلى باستخدام plusTipParamSweepGUI على مجموعة تمثيلية من ملفات .tif صورة. القيمة التي تم إدخالها لحجم بكسل تقتصر على العدسة الشيئية استخدامها للحصول على صورة مرور الزمنالصورة (انظر خطوات 5،1-5،2 أعلاه).
    4. عن المنطقة من الفائدة (ROI) الاختيار، وخلق أقنعة الثنائية من خلية كاملة من خلال تتبع حافة الخلية باستخدام صورة مدينة دبي للإنترنت من الخلية لتشكيل مضلع يدويا.
    5. لشبه إقليم الفائدة (ROI الفرعي) الاختيار، وإنشاء قيادة وراء أقنعة حافة طريق رسم خط سميك 2 نقطة عبر الخلية الجرح حافة الفائدة يدويا باستخدام plusTipTracker شبه العائد على الاستثمار أداة التحديد المعدلة.
      ملاحظة: ينبغي وضع خط مواز لحافة الجرح في الموضع حيث خلية من الاهتمام تتجاوز الخلايا الجرح الحافة 31 المجاورة.
  3. plusTipSeeTracks واجهة المستخدم الرسومية
    1. التحقق والتفتيش بصريا تراكب المسار من الصور. TIF تخزينها في مجلد "العائد على الاستثمار" عن طريق النقر على "مؤامرة المسارات" الموجود في العمود المسار الأغطية. أكرر للجميع تراكب المسار.
    2. أداء تجمع البيانات عن طريق النقر على زر "إنشاء مجموعات" في العمود إعدادات الاختياري. حدد experimالبيانات ental التي تنتمي إلى نفس مجموعة البيانات عن طريق النقر على ملفات البيانات. حفظ التحديد عن طريق إعطاء "الجماعة" وهو الاسم الذي يمكن التعرف عليها بسهولة (على سبيل المثال، "مجموعة المراقبة").
    3. لMT قياسات العائد على الاستثمار الفرعية ديناميات النمو، أدخل الحد الأدنى لعدد من صورة إطارات التي EB3 واحد المذنب المسار يجب أن يتم الكشف داخل عائد الاستثمار الفرعية من أجل التأهل بوصفها "المسار"، واستخراج الرحلات النمو MT داخل الرئيسي وراء العائد على الاستثمار الحافة بالنقر على "اختيار اليدوية" في لوحة "الفرعية رويس" من واجهة المستخدم الرسومية.
      ملاحظة: على سبيل المثال، استخدام 3 إطارات (6 ثانية) كحد أدنى للطول الكشف ليتم استخراج بأنه "المسار". يتم تخزين المسارات المستخرجة من دون رويس داخل مجلد المشروع الفرعي ضمن مجلد العائد على الاستثمار الأصلي لكل خلية.
    4. نمو MT فرعية تتبع وتحليل حيوانية
      1. حساب سرعة النمو MT يعني ويعني MT مدى الحياة النمو لمجموعات البيانات "مجموعة" (راجع الخطوة 6.3.2)، لكل العائد على الاستثمار (انظر الظريفص 6.2.4)، ولكل الفرعي العائد على الاستثمار (راجع الخطوة 6.2.5).
    5. ضمن العمود المؤامرات مبعثر رباعي من وplusTipSeeTracks واجهة المستخدم الرسومية، انقر على "المجموعات حدد" وانقر على مجموعة (تم إنشاؤه في الخطوة 6.3.2) ليتم مقارنتها.
      1. حدد "سرعة النمو" لخيار محور س واكتب القيمة المتوسطة لسرعة النمو (من الخطوة 6.3.4) داخل منطقة الجزاء. حدد "عمر النمو" للخيار المحور الصادي واكتب القيمة المتوسطة لمدى الحياة النمو (من الخطوة 6.3.4) داخل منطقة الجزاء.
    6. ضع علامة في المربع المجاور لعبارة "إزالة المسارات في البداية / النهاية" وإلى جانب "عملية دفعة على المجموعات." انقر على "جعل مؤامرات" لإنشاء ملف تعريف التوزيع للمسارات النمو MT لخلية كاملة، الحواف الأمامية، وزائدة حواف شبه رويس.
      ملاحظة: للحصول على الدراسات الموصوفة هنا، يتم توزيع مسارات النمو MT إلى أربع مجموعات سكانية فرعية: بطيئة وقصيرة الأجل، بطيئة وطويلة الأمد وسريعة وقصيرة الأجل، وسريعة وطويلة الأمد.
      7. نسخ القيم المتوسطة من الخطوة 6.3.4 في برنامج برنامج جداول البيانات وحفظ الملف مع التمديد. XLS.
      1. انقر على "بيانات"، ثم انقر على "تحليل البيانات" من النافذة المنسدلة البيانات. حدد "اختبار t: اثنان عينة افتراض الفروق متساوية" لمقارنة يعني سرعة نمو طن متري، وعمر النمو طن متري. تسليط الضوء على خلايا البيانات في جدول البيانات حيث ينتج مقارنات اختبار t في القيمة الاحتمالية <0.001.

7. تحليل Colocalization

  1. لخلفية الطرح، وذلك باستخدام "أداة سطر" البرنامج برامج التصوير، رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) عن طريق النقر على الشاشة لإنشاء شكل مربع التي هي 10 ميكرون 2 على الأخضر صورة قناة (488 نانومتر الإثارة) في موقف حيث لا يوجد مضان الخلية (الخلفية). كرر هذا للصورة القناة الحمراء (561 نانومتر الإثارة) باستخدام صور من الخطوة 5.8.
  2. استخدام العلاقات العامة برامج التصويرogram، انقر بالزر الأيمن على العائد على الاستثمار من الخطوة 7.1 و اختار "أعد ROI الخلفية." انقر على "صورة"، ثم انقر على "خلفية طرح" من النافذة المنسدلة لطرح متوسط ​​القيم الأساسية (من الخطوة 7.1) من كامل صورة. أداء الطرح الخلفية للخلايا المشترك، معربا عن إم أورورا ألف وإما mCherry-MCAK، mApple-EB3، أو mApple تويولين.
  3. في الخلفية تطرح صورة القناة الحمراء فقط، انقر على الشريط ثنائي واختر "تحديد عتبة" ثم حدد "في قناة" وظيفة لاستبعاد علامة فلوري المعينة.
    ملاحظة: تم تنفيذ الخطوة العتبة سواء على mCherry-MCAK، mApple-EB3، أو صورة mApple تويولين للسماح رسم خطوط التي اتسمت على وجه التحديد الكائن thresholded لتحليل شارك في الترجمة (راجع الخطوة 7.4).
  4. باستخدام أداة سطر في البرنامج التصوير، ورسم خط سميك 2 نقطة فوق الكائنات استبعاد داخل الصورة thresholded.
  5. حدد الكائنات الخط الذي رسمته في الخطوة 7.4. نسخ ولصق الكائنات الخط من القناة الحمراء على قناة الخضراء (إم أورورا أ) صورة المقابلة.
  6. قياس القيم بكسل كثافة تدرج الرمادي تحت كائنات الخط إلى حساب المشترك توطين ومجموع القيم إم أورورا-A لكل خلية فردية عن طريق اختيار "القياس"، ثم "الملف كثافة" من النافذة المنسدلة ضمن برنامج برامج التصوير.
    1. تنظيم البيانات عن طريق العلاج التجريبية والمنطقة الفرعية الخلوية من خلال تصدير إلى برنامج برنامج جداول البيانات وحفظ الملف كنوع. XLS (على سبيل المثال، "control_grayscale_intensity.xls").
      ملاحظة: البيانات الواردة في هذا الطريق يمثل جزء شارك في توطين مجموع قياس إم أورورا-A في منطقة جنوب الخلوي.
  7. باستخدام القيم المقاسة من الخطوة 7.6، كرر الخطوة 6.3.7 لحساب إحصائيا باستخدام ف <0.05 باسم قطع للأهمية.
8. المناعي

  1. إصلاح الخلايا (انظر الخطوة 3.4) مع امتصاص العرق / غلوتارالدهيد شارك في استخراج / عازلة تثبيت (PGF-PHEM، 4٪ لامتصاص العرق، 0.15٪ غلوتارالدهيد، 0.2٪ المنظفات في 60 أنابيب مم، و 27.3 مم HEPES، 10 ملي EGTA، و 8.2 ملي MgSO 4، ودرجة الحموضة 7.0) لمدة 10 دقيقة في RT.
  2. شطف 3 مرات لمدة 5 دقائق مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
  3. علاج 2 مرات لمدة 15 دقيقة مع 0.01 جم / مل NaBH 4 في برنامج تلفزيوني 1X لإرواء الألدهيدات رد الفعل.
    ملاحظة: NaBH 4 أشكال الفقاعات التي يمكن أن تسبب لل coverslips لتعويم. ومن الأهمية بمكان أن لل coverslips تبقى مغمورة خلال هذه حضانات. إذا بدأت لل coverslips الى تعويم، واستخدام ملقط لرفع حافة واحدة من ساترة من أجل السماح للفقاعات من الفرار.
  4. شطف 2 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X قبل حجب مع الحليب الخالي من الدسم 5٪ في برنامج تلفزيوني 1X على منصة هزاز لمدة 1 ساعة على RT.
  5. احتضان خلايا في الأجسام المضادة الأولية (أرنب مكافحة pT288 أورورا ألف (1: 1000)) والفئران مكافحة α تويولين (1: 500) التي أعدت في حل برنامج تلفزيوني 1X. احتضان عند 4 درجات مئوية على هزاز بين عشية وضحاها منصة.
  6. إزالة الأجسام المضادة الأولية وشطف 3 مرات لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1X قبل احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (حمار المضادة للأرنب (1: 1000) والماعز المضادة للفأر (1: 1000)) التي أعدت في اللبن الخالي من الدهون 5٪ لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  7. جبل ساترة على شريحة زجاجية في المتوسطة المتزايدة الأمثل مضان. ختم حواف ساترة إلى الشريحة باستخدام طلاء الأظافر واضحة، وتخزينها في الظلام في 4 درجات مئوية.

9. خلية الهجرة الفحص

  1. أداء ثقافة HUVEC لفحوصات الهجرة كما هو موضح أعلاه (بروتوكول 3: [كدنا ترنسفكأيشن وHUVEC الثقافة على ساترة، الخطوات 3،2-3،3).
  2. بعد ترنسفكأيشن الخلية والإنقاذ transfected الخلايا مع 80 ميكرولتر كامل المتوسطة القاعدية البطانية. ماصة عينة 80 ميكرولتر بمثابة قطرة واحدة على مركز المجففة المغلفة فبرونيكتين 22 ملم الجولة رقم 1.5 ساترة. لا نشر درو 80 ميكرولترص. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة لإتاحة الوقت للانضمام إلى خلية أحادي الطبقة متموجة.
    ملاحظة: تجفيف ساترة ضروري لمنع انخفاض 80 ميكرولتر من الانتشار على اتصال ساترة. يسمح هذا النهج لHUVECs إلى أن تتركز في منطقة صغيرة من ساترة، وبالتالي يشجع على الإسراع في تشكيل أحادي الطبقة متموجة من الخلايا.
  3. شطف 2 مرات في كامل المتوسطة القاعدية البطانية لإزالة الخلايا تعلق الامم المتحدة.
  4. لإنشاء "حافة الجرح،" تتخلص من ساترة بشفرة حلاقة معقمة عن طريق سحب بلطف شفرة حلاقة نظيفة عبر أحادي الطبقة HUVEC (من الخطوة 9.2). عقد ساترة بلطف في مكان مع ملقط لمنع انزلاق شفرة الحلاقة خلال كشط.
  5. السماح للخلايا لاسترداد في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعة. تجميع وجبل ساترة (ق) للتصوير (انظر بروتوكول 4).
  6. الحصول على النقيض من المرحلة والصور 488 نانومتر في 10 دقيقة فترات لمدة 12 ساعة على المجهر باستخدام10X 0.45 NA مرحلة موضوعية و0.52 المكثف NA LWD باستخدام "ND شراء" لوحة من البرنامج الحصول على الصور (كما هو موضح في الخطوة 5.3).

10. الكمي لHUVEC التشعب والهجرة

  1. لالمتفرعة تحليل والسماح لحتى إضاءة خلية وتقدير غير متحيز، والحصول على صورة مجهرية من HUVEC transfected (راجع الخطوة 3.3) والتعبير عن mApple-C1 كدنا] بناء، علامة حجم الخلية.
  2. باستخدام برنامج حاسوبي التصوير، فتح الصورة mApple-C1 وتسمية الموقف على جانبي الفرع الذي يعرض غشاء أعظم زاوية انحناء. ربط هاتين النقطتين مع خط مستقيم. هذا الخط هو "فرع المنشأ."
  3. باستخدام أداة سطر من برامج التصوير، بصريا تحديد الفروع التي تقيس> 10 ميكرون في الطول من "الأصل فرع" تحدد في الخطوة 10.2. حساب طول فرع عن طريق قياس المسافة من عشره "فرع الأصل" إلى النقطة الأكثر القاصية من طرف فرع (انظر الشكل 4).
  4. حساب عدد من نتوءات تشعبت التي تقيس> 10 ميكرون في الطول للحصول على "رقم الفرع الخلية."
  5. لتحليل الهجرة، وذلك باستخدام الصور التي تم جمعها في الخطوة 9.6، وتحديد بصريا HUVEC الجرح الحافة على أساس الموقع الجغرافي (أي خلايا جسديا على حافة الجرح) و ملفه الشخصي التعبير (أي تحديد خلية الجرح حافة خضراء إذا ينطوي على تجربة التعبير عن GFP).
  6. استخدام الصور على النقيض من المرحلة الخلية، وتحديد بصريا النواة (هيكل كروي شبه شفافة بالقرب من مركز الخلية)، ومن ثم التعرف بصريا نوية (أ، هيكل كروي صغير، داكنة اللون داخل النواة) في نقطة لأول مرة من الوقت الفاصل بين الصور. انقر على موقف نوية لتسمية X و Y إحداثيات نوية.
  7. باستخدام برامج التصوير، ومن ناحية تتبعنوية في الوقت الفاصل بين الصور المتعاقبة من خلال النقر على موقف نوية لتسمية X و Y إحداثيات نوية في كل إطار من الفيلم الوقت الفاصل بين (الشكل 4).
  8. باستخدام برامج التصوير، انقر على "ملف" ثم انقر على حفظ باسم "ثم انقر لتحديد نوع ملف الصورة". XLS ".
  9. فتح ملف البيانات ناحية تتبع (من الخطوة 10.8) باستخدام برنامج برنامج جداول البيانات. حساب الهجرة سرعة يعني ويعني بعد الهجرة إلى الأصل.
  10. باستخدام برنامج برنامج جداول البيانات، انقر على "بيانات"، ثم انقر على "تحليل البيانات" من النافذة المنسدلة البيانات. حدد تصحيح بونفيروني، وتحليل في اتجاه واحد من اختبار التباين مع الثقة> 95٪ حيث قطع للدلالة إحصائية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ثقافة HUVEC للفحص المجهري الخلية الحية
التصوير الخلية الحية من HUVECs التعبير عن البروتينات الفلورية يتطلب أن يتم الاحتفاظ HUVECs في بيئة غير مناسبة للنمو الطبيعي الخلية والصيانة، وكذلك التعبير البروتين العادي وظيفة. ويبين الشكل 1 تصوير تخطيطي للبروتوكول يستخدم لإعداد مخزنة والنظام المغلق الذي يحافظ الأمثل الخصائص البصرية لجمع الصور الوقت الفاصل بين الخلايا الحية. توضع شرائح رقيقة من الشريط على الوجهين على شريحة زجاجية (الشكل 1A) ثم ساترة تحتوي على HUVECs مثقف هو مقلوب فوق الشريط بحيث الخلايا تواجه الشريحة (الشكل 1B). وبهذه الطريقة، يوفر الشريط وجود فجوة صغيرة بين الواجهات الزجاجية اثنين، ويخلق مساحة في الخلايا التي يمكن أن استحم في مناسبة وسائل الإعلام ثقافة الخلية (الشكل 1C، وانظر بروتوكول 4 أعلاه). أناغ الخطوة النهائية، وختم ساترة الزجاج إلى الشريحة الزجاجية باستخدام الفازلين: شمع البارافين: اللانولين (1: 1: 1 خليط، VALAP، 1D الشكل) لتأسيس نظام مغلق. وقد استخدم هذا النهج ثقافة خلية لكل من أقصر وقت تتابع تصوير المذنبات EB3 ولأطول وقت تسلسل المتفرعة والتجارب الهجرة. بالإضافة إلى ذلك، مثل الاتساق الشمع من VALAP يسمح لسهولة إزالة من شريحة زجاجية وساترة في نهاية من التصوير تجربة مثل هذا النهج إضافية بما في ذلك تثبيت وimmunolabelling (انظر بروتوكول 8)، لا يمكن أن يؤديها على نفس ساترة وعينة الخلية التي كانت تصور باستخدام نهج التصوير الخلية الحية.

figure-results-1
الشكل 1: منهجية ثقافة HUVEC للخلية الحية التصوير المجهري (A) قص 2 قطعة من الشريط على الوجهين إلى 0.65 سم × 2.50 سم شرائح مستطيلة وتأمين قطعة واحدة من الشريط على الوجهين أفقيا على طول الحافة العلوية من الشريحة، وغيرها من قطعة، وعلى طول الحافة السفلية للشريحة. من المهم السماح لكمية صغيرة من الفضاء بين الشريط وحافة الانزلاق لاغلاق الغرفة كما هو موضح في (D). (ب) باستخدام ملقط إزالة ساترة تحتوي على HUVECs وعكس ساترة (الجانب الخلية أسفل) على أعلى من قطعة من الشريط. (C) باستخدام micropipette، إضافة 40 ميكرولتر من وسائل الإعلام التصوير (كاملة المتوسطة القاعدية البطانية تستكمل مع 25 ميكرومتر HEPES) بين ساترة والشريحة الزجاجية. تأكد من أن المسافة بين ساترة والشريحة شغل تماما مع وسائل الإعلام التصوير وتجنب الفقاعات. استخدام الشافطة على طول حافة ساترة لإزالة وسائل الاعلام الزائد، إذا لزم الأمر. (د) استخدام VALAP الدافئة (1: 1: 1 الفازلين: اللانولين: البارافين) لختم حول حواف ساترة. تحقق من وجود تسرب سائل الإعلام التصويرالصورة عن طريق دفع حوالي بلطف على ساترة. استخدام VALAP إضافية لمعالجة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

تتبع الآلي من EB3 fluorescently المسمى يسمح للتحليل شامل للخلية كاملة وديناميات النمو MT الإقليمية. مجموعة من الصور المجهرية واضحة، واضحة، ووقت للغاية وحلها الفضاء من البروتين EB3 ضروري لتحليل الحركات EB3 داخل الخلية. HUVEC تعبير عن EB3 fluorescently المسمى يختلف على نطاق واسع من خلية إلى أخرى وكثافة مضان يزيد عادة داخل الخلية نفسها على مدى فترة من ساعة. وبالتالي، فمن المهم النظر ومراقبة هذه التغييرات في التشكيل التعبير من أجل تحديد الآثار المحتملة لزيادة التعبير EB على ديناميات النمو طن متري. هذا هو أفضل إنجاز من خلال تقييم كثافه مضان الرمادية النطاقلمحات ذ لكل خلية المصورة، ومن ثم تقييد تحليل البيانات لتلك الخلايا التي تعرض مجموعة محددة من ملامح التعبير مقياس الرمادية. تقييم أولي لمجموعات البيانات الشخصية التعبير أمر بالغ الأهمية، ويجب مقارنة مع MT بيانات حركة النمو التي يتم الحصول عليها من قبل البرامج plusTipTracker لكل خلية. ملامح التعبير يمكن رسم ضد MT سرعة النمو وMT عمر النمو لكل خلية داخل المجموعة التجريبية، من أجل تحديد نطاق المطلوب من التعبير على نطاق والرمادي وتحديد القيم المتطرفة المحتملة.

الشكل 2 يبرز مثقف وHUVEC على ركيزة فبرونيكتين (انظر بروتوكول 2.1 أعلاه) والتعبير عن قرب المستويات المثلى من EB3 المسمى mApple. وترد المذنبات EB3 الفلورية في سلسلة الوقت الفاصل بين الصور على مدى فترة من 12 ثانية (الشكل 2A). تحليل المذنبات EB3 باستخدام برنامج plusTipTracker ينطوي على الآلية، والإطار حسب الإطار EB3 المذنب DETEction (النقاط الخضراء والصفراء، الشكل 2B). المذنبات الكشف داخل كل إطار ثم ترتبط، تعتمد على تغيير في الموقف من الإطار إلى الإطار، لتوليد مسارات EB3 والبصرية تراكب EB3 المسار (الشكل 2C-F). تراكب المسار هي والفروق اللون يمكن تحديد المعلمات المدخلة من قبل المستخدم مرمزة. عادة، هذه الفروق استخدام المتوسط ​​العالمي للMT سرعة النمو وMT عمر نمو 5،31، وبالتالي تقسيم البيانات إلى أربع مجموعات: بطيئة وقصيرة الأجل (الحمراء)، بطيئة وطويلة الأمد (الصفراء) وسريعة وقصيرة عاش (الأخضر)، وسريع وطويل الأمد النمو MT (الأزرق، الشكل 2G). تتبع بوساطة PlusTipTracker من ديناميات النمو MT-وصفت EB3 يمكن أيضا المناطق المعرفة من الفائدة (رويس). PlusTipTracker استخراج البيانات مسار النمو MT من داخل العائد على الاستثمار المعرفة من قبل المستخدم (الشكل 2A، B و F)، مما يسمح للمقارنات MT الديناميت النموICS في مناطق مختلفة من نفس الخلية.

figure-results-2
الشكل 2: EB3 الكشف عن المذنب، وتتبع، وإخراج البيانات plusTipTracker (A) فيلم الوقت الفاصل بين لHUVEC معربا عن mApple EB3. وتظهر اللوحة اليسرى وجهة نظر خلية كاملة وقناع خلية كاملة (الخط الأبيض) demarking حدود الخلية. يمثل مربع أحمر المنطقة مكبرة هو مبين في الوقت الفاصل بين الصور (لوحات اليمين). لوحات اليمين تظهر الوقت الفاصل بين الصور الرمادية النطاق الخام من المذنبات EB3 في إطارات التصوير المتعاقبة (ر = 0 ثانية - ر = 12 ثانية). (ب) كشف plusTipTracker المذنبات EB3 من الصور المبينة في الفقرة (أ). وتظهر اللوحة اليسرى وجهة نظر خلية كاملة من المذنبات الكشف عن (النقاط الصفراء). يمثل مربع أحمر المنطقة مكبرة هو مبين في الوقت الفاصل بين الصور (لوحات اليمين). لوحات اليمين تبرز خمسة المذنبات EB3 الكشف عن (الأسهم الحمراء)، وتتبع تلك المذنبات خمسة خلال فترة التصوير 12 ثانية. أخضر النقاط تمثل الكشف عن المذنبات EB3 التي لم تكن موجودة (أو لم تكتشف) في الفترة الزمنية السابقة. (ج) الحد الأقصى لإسقاط كثافة من 61 الإطارات (2 دقيقة الفيلم) من المذنبات EB3 هو مبين في (A). (D) plusTipTracker MT مسار تراكب من نفس 61 إطارات (فيلم 2 دقيقة) هو مبين في (C). (E) التكبير الأقصى الإسقاط كثافة (المربع الأحمر في C). (F) تكبير من plusTipTracker MT مسار تراكب من أقصى الإسقاط كثافة (المربع الأحمر في D). أسطورة لتراكب المسار هو مبين في (D) و (F) (G) مرمزة. ويستند هذا التعيين بطيئة كما وسريعة وقصيرة الأجل أو طويلة عاش على القيمة المتوسطة لجميع مسارات النمو قياس في مجموعة من عشرة mApple-EB3 HUVECs التعبير. لتسهيل التصور، يتم إنشاء تراكب المسار في (D) و (F) باستخدام كثافة بكسل مقلوب للصورة الخلية هو مبين في (A). الحانات النطاق = 20 ميكرون./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

HUVEC المتفرعة وأنماط الهجرة حساسة للوالميكانيكية المادية إشارات من ECM.

ومن المعروف HUVECs جيدا للرد على أنواع مختلفة من الإشارات الإشارات و، في القيام بذلك، للخضوع التعديلات الشكلية التي تملي استجابة الخلوية المناسبة لجديلة إشارات معينة (ق) 36،40-42. مثقف HUVECs على فبرونيكتين المغلفة ركائز الزجاج (الشكل 3A)، أو على تصلب موبينيل بولي أكريلاميد 2-الأبعاد (55 كيلو باسكال) عادة عرض مستديرة أو التشكل ممدود مع قليل من نتوءات متفرعة مميزة (الشكل 3B). ومع ذلك، عند المثقف على لينة جدا موبينيل بولي أكريلاميد 2-الأبعاد (0.7 كيلو باسكال)، HUVECs عرض التشكل متفرعة جدا أن يعرف أن تنجم عن الامتثال التي يسببها أسفلتنظيم الميوسين-II انقباض 4،5،31 (الشكل 3C). وهكذا، HUVECs تنظيم التشكل الخلوي من خلال mechanosensing ECM، ويتم ذلك من خلال تعديل المترجمة من ديناميات طن متري، وانقباض ACTO-الميوسين.

لأن HUVECs عرض مجموعة واسعة من الصفات المورفولوجية، وذلك لقياس HUVEC المتفرعة فمن الأهمية بمكان أن تحدد أولا ما هو نتوء متفرعة، وبعد ذلك إلى تحديد الكيفية التي سيتم قياسها نتوء متفرعة بشكل موضوعي. يستخدم أسلوب واحد نهج من أربع خطوات التي يتم إنشاؤها في حدود الخلية أو "قناع" من جهة تتبع حواف الخلية باستخدام صورة لخلية معربا عن علامة حجم الفلورسنت لتحديد حواف الخلية (الشكل 3D). بعد جيل قناع، وتعرف أصول فرع طريق تحديد موقع أكبر زاوية انحناء بين نتوء متفرعة وخلايا الجسم. يتم رسم خط إلى demaر في "فرع المنشأ" (خطوط الزاوية الأرجواني، الشكل 3E). يتم قياس رقم الفرع ببساطة عن طريق حساب عدد من الفروع التي قد يكون مصدرها فرع محددة (الشكل 3F). يتم قياس طول فرع والمسافة من أصل فرع إلى فرع الطرف البعيد (الشكل 3G). لتجنب إدراج التوقعات lamellipodial صغيرة من تحليل البيانات، ومعيار إضافي يتطلب أن الفروع يجب أن تكون أطول ( "طول فرع") مما هي واسعة (في "الأصل فرع")، وأن فروع يجب أن يكون لا يقل عن عشرة ميكرون في الطول 5 ، 31.

figure-results-3
. الشكل 3: تحليل HUVEC المتفرعة التشكل (A - C) أمثلة صورة مدينة دبي للإنترنت من HUVECs مثقف على فبرونيكتين المغلفة موبينيل الزجاج (A) شديدة (55 كيلو باسكال) موبينيل بولي أكريلاميد (ب) والناعمة (0.7كيلو باسكال) موبينيل بولي أكريلاميد (C). المتفرعة وزيادة كبيرة في HUVECs مثقف على 0.7 موبينيل بولي أكريلاميد كيلو باسكال (C) بالمقارنة مع موبينيل أكثر صرامة (A، B). (D). مدينة دبي للإنترنت صورة مجهرية (صورة اليسار) من HUVEC transfected تعبر عن mApple-C1 كدنا] بناء (علامة حجم الخلية؛ الصورة الصحيحة). (E) تحديد الأصل فرع من تحديد مكان وجود أكبر زاوية انحناء (أي الموضع الذي يعرض غشاء أكبر انحناء، خطوط الأرجواني اللون) على جانبي الفرع ومن ثم ربط الزوايا مع خط مستقيم (خطوط زرقاء) . (F) تحديد واختيار نتوءات متفرعة التي تمتد> 10 ميكرون من "الأصل فرع" (المعرفة في E). حساب عدد من نتوءات تشعبت للحصول على "رقم الفرع". (G) قياس المسافة من مركز "الأصل فرع" لموالحادي نقطة البعيدة للفرع باستخدام أداة سطر في تطبيق الشروح والقياسات من عناصر شيكل البرامج للحصول على "طول فرع". الحانات النطاق = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالإضافة إلى الامتثال ECM الاستشعار، HUVECs أيضا الإحساس والاستجابة للقضاء على الاتصالات الخلوية المجاورة كما الناجم عن جرح الصفر. في فحص الهجرة، مثقف HUVECs في أحادي الطبقة يتعرضون لجرح الصفر ويتم قياس خصائص الهجرة (انظر بروتوكول 9 أعلاه). بعد تحريض الجرح عن طريق خدش أحادي الطبقة، HUVECs الجرح الحافة استقطاب عن طريق تطوير الرائدة تبارزي الذي يمتد إلى الجرح (الشكل 4A، ر = 0 ساعة). على مدار الساعة من 10-12 ساعة، الاستقطاب HUVECs الجرح الحافة تهاجر إلى منطقة الجرح وملءالجرح، إقامة أحادي الطبقة متموجة جديدة (الشكل 4A، ر = 11 ساعة). كما هو الحال مع HUVEC المتفرعة، وتشير الأدلة الحالية التي الاستقطاب والهجرة اعتمادا كبيرا على إعادة تنظيم منسقة للطن متري، وcytoskeletons أكتين 43-49. ويتحقق ذلك، في جزء منه، من خلال تثبيط المترجمة من التي يسببها MCAK MT التفكيك في طليعة، ولكن ليس على حافة زائدة من الجرح الحافة HUVECs 31. حساسية ديناميات MT إلى الجرح الناجم عن الاستقطاب والتي بدأها RAC1 GTPase، الذي يستهدف العديد من البروتينات منظم المصب، بما في ذلك أورورا-A كيناز أن phosphorylates ويمنع MCAK في طليعة، وتحركات أخرى قادرة على تثبيط أو تفعيل يتلخص لمحليا تعدل نمو طن متري، وانكماش 18،31،36،48،50-53. يدعم الأدلة التجريبية واسعة النطاق فكرة أن التنسيق بين الحافة الأمامية نتوء وراء انكماش حافة يحكم من خلال دورات تفعيل RAC1لتعزيز التجمع MT في طليعة وتفعيل RhoA إلى انقباض ACTO-الميوسين على حافة زائدة، وبالتالي قيادة الحركة توجه 9،41،51،52،54-58.

حتى الآن، ليس هناك منهجية المتبعة لأداء تتبع الآلي للهجرة الخلايا. هذا هو نتيجة لصعوبة في تحليل حسابيا حدود خلية ECM التي تتغير باستمرار كما استقطاب خلايا الجرح الحافة وتهاجر. بينما العديد من البرامج قادرة على تتبع خلايا fluorescently المسمى 59-64، سكان fluorescently المسمى HUVECs في تجارب الهجرة الجرح حافة ما يقرب من 30-40٪ من مجموع السكان HUVEC، وبالتالي فإن الغالبية العظمى من الخلايا الجرح الحافة يجب يمكن تصور من قبل على النقيض من المرحلة أو التصوير مدينة دبي للإنترنت. بالإضافة إلى ذلك، من المهم عند قياس الهجرة الجرح الحافة لتقييم الخلايا الفلورسنت وغير الفلورسنت داخل نفس الجرح من أجل تحديد محددةآثار التعبير يبني داخل مجموعات الدراسة التجريبية وبين مجموعات الدراسة التجريبية. حاليا، فإن أفضل طريقة لقياس الهجرة HUVEC هو استخدام نهج تتبع جهة التي يتم التعرف على خلية الجرح الحافة أولا ثم نواة ونوية يتم تحديدها (الشكل 4B). يتم استخدام نوية كمحدد موقف لتتبع الخلية نظرا لكثافة تشتت الضوء عالية وحجم صغير نسبيا. هذه الميزات اثنين من نوية تسهل تحديد وتقليل خطأ القياس عن طريق الحد من المنطقة التي يمكن للمستخدم وضع مواقف المسار الفردية. ثم يتم إنشاؤها HUVEC مسارات الهجرة عن طريق النقر على نوية في المتعاقبة إطارات الصور الوقت الفاصل. وأخيرا، يتم قياس سرعة الهجرة وبعد الهجرة إلى أصل وتحليلها من أجل السيطرة والجماعات خلية التجريبية (الشكل 4B).

figure-results-4 الشكل 4: تحليل HUVECs الجرح الحافة وتتبع هجرة الصور (A) 20X على النقيض من المرحلة من 11 ساعة الوقت الفاصل بين التصوير سلسلة من الصفر الجرح الحافة HUVECs (ويعرف أيضا باسم "هجرة الفحص"). يشار إلى الجرح واتجاه الهجرة في لوحة ر = 0 ساعة. وتظهر HUVECs لعبور الجرح المتطورة والتقدم في الجرح حتى يتم تشكيل أحادي الطبقة من الخلايا (ر = 3.5 ساعة - T = 11 ساعة). (ب) تحليل للهجرة فحص التصوير الفاصل الزمني (كما هو موضح في أ) يتطلب أولا تحديد من تتبعها HUVEC الجرح الحافة بناءا على الموقع الخلية (أي خلايا جسديا على حافة الجرح) و ملفه الشخصي التعبير (ط .ه- ، حدد خلية حافة الجرح الخضراء إذا كانت تجربة تنطوي على التعبير عن GFP). استخدام صورة النقيض مرحلة، وتحديد نواة ونوية. تتبع ناحية نوية في الوقت الفاصل بين الصور المتعاقبة باستخدام لالملاحظات والقياسات التطبيق في برنامج عناصر شيكل لتحديد سرعة الهجرة والمسافة إلى الأصل. على نطاق والحانات = 100 ميكرون (A)، و 20 ميكرون (B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام HUVECs في علم الصرف والهجرة التجارب.
التصوير الخلية الحية من ديناميات النمو MT-وصفت EB3 داخل HUVECs يتطلب شروطا ثقافة الخلية المناسبة وقابلة للتكرار من أجل قياس وتقييم التغيرات في نمو طن متري، وHUVEC التشكل، بحيث يمكنهم بعد ذلك أن تسند إلى جديلة ECM الإشارة. HUVECs تمثل نموذجا ممتازا لدراسة شكل الخلية والحركة. وهي قابلة للغاية لترنسفكأيشن مع cDNAs fluorescently المسمى، فإنها تظهر الأشكال التضاريسية دراماتيكية ردا على كل من العظة إشارات قابلة للذوبان والجسدية، وأنها تحافظ على القدرة على تنظيم أنفسهم في أنابيب الأوعية الدموية عندما هيأ ظروفا ثقافة الخلية المناسبة 65-70. مزارع الخلايا الأولية، مثل HUVECs، تتطلب معالجة متأنية ورصد عدد الخلايا مرور من أجل ضمان الخلايا السليمة، وأنها سوف تتصرف عادة خلال التجريب. على سبيل المثال، عند إجراء التجارب التحقيق في cytoskeleطن و / أو مورفولوجيا الخلايا، HUVECs لا ينبغي أن تستخدم للتجارب ما بعد العاشر مرور ثقافة الخلية، كما HUVECs عادة تبدأ في عرض الأشكال التضاريسية غير موحدة حول مرور 12-15.

كثافة الخلية هي أيضا منظم ينتقد HUVEC الصحة والانتشار. HUVEC التحقيقات المتفرعة (انظر بروتوكول 10،1-10،4 أعلاه) تستخدم منخفضة نسبيا الثقافات كثافة الخلايا من أجل توفير الخلايا المساحة الفعلية للتفاعل مع ECM وتمديد نتوءات متفرعة. في المقابل، في دراسات الهجرة الجرح الحافة (انظر بروتوكول 10،5-10،8)، HUVECs هي الثقافة في أحادي الطبقة قبل إصابة. كما عرض من هذا القبيل، HUVECs الجرح الحافة التشكل نسبيا برنامج الأمم المتحدة للأفرع، تمديد الرائدة نتوءات الحافة، وتظهر التفاعلات خلية خلية مع جيرانها المباشرين حيث يهاجرون إلى الجرح.

المحاذير ومزايا تتبع MT حيوية في المعيشة HUVECs.
الغزل المجهر القرص هو طريقة ممتازة لاختبار الفرضيات التجريبية التي تتطلب وضوح الصورة متحد البؤر مع ارتفاع الوقت القرار. مع الكاميرا والليزر وحدة مناسبة، فإن هذا النهج المجهر حساس لمضان الانبعاثات المنخفضة ويمكن أن تساعد في خفض photobleaching من مقارنة مع أنواع أخرى من مضان المجهري. الأهم من ذلك، هذا النهج هو أيضا مناسبة تماما لمتوسطة إلى عالية وقت التصوير القرار كما هو مطلوب لتوليد قياسات شاملة من ديناميات النمو MT باستخدام نهج وضع العلامات EB3، في مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا.

في حين أن منهجية EB3 من العلامات تنمو MT بالإضافة إلى الغايات لديها مزايا واضحة على وسائل أخرى للوضع العلامات fluorescently النظام التجاري المتعدد الأطراف، كما أن لديها عيوب فريدة من نوعها. على سبيل المثال، هناك نسبة من مجموعة MT الذي لا ينمو بنشاط في أي وقت من الأوقات، بما في ذلك السكان من النظام التجاري المتعدد الأطراف تفكيك وسكان مستقر، النظام التجاري المتعدد الأطراف غير ديناميكية 71-74. سوف EB3 لا تسمية هذين الشعبين من النظام التجاري المتعدد الأطراف ووبالتالي فإن مساهمة هذين الشعبين لن تدرج في تحليل البيانات التجريبية. وقد ركزت منهجيات بديلة لتقييم مجموعة MT بأكملها على التعبير عن تويولين-fluorescently المسمى، الذي يدمج جميع السكان من النظام التجاري المتعدد الأطراف، ويسمح لتحديد المتنامية، وتقلص ومستقر النظام التجاري المتعدد الأطراف. ومع ذلك، ونظرا للكثافة عالية نسبيا من مجموعة MT بالقرب من مركز الخلية والمتاخمة للأنيبيب تنظيم المركز (MTOC)، واصفة مجموعة MT كامل يخلق وضع غير مؤات في تحليل الصور الغايات MT التي ليست بالقرب من خلية محيط 75-77. وقد كشفت التجارب باستخدام اللونين شارك في وضع العلامات على النظام التجاري المتعدد الأطراف مع تويولين الفلورسنت وEB3 فلوري في الخلايا الحية، نوعيا، أن الغالبية العظمى من النظام التجاري المتعدد الأطراف المسمى تويولين هي أيضا 78 وصفت EB3. بالإضافة إلى ذلك، لم يكن هناك وسيلة فعالة لتتبع الآلي من النظام التجاري المتعدد الأطراف المسمى مع تويولين الفلورسنت. وهذا يعني أن جامعي البياناتنشوئها وقياسات ديناميات MT في الخلايا معربا عن تويولين الفلورسنت تتطلب تتبع يد النظام التجاري المتعدد الأطراف الفردية، وهي عملية عرضة للخطأ ومملة. ونتيجة لذلك، أصبح التحليل الحسابي الآلي من EB3 المسمى النظام التجاري المتعدد الأطراف منهجية المفضلة لقياس ديناميكية MT كما يمكن تطبيقها على MT ديناميات التجارب عبر العديد من أنواع الخلايا وضمن مجموعة متنوعة من الأنظمة التجريبية 35،79.

ربط MT النمو حيوية لHUVEC الصرف والهجرة.
من وجهة نظر محقق هيكل الخلية، واحد التكيف مفيد للغاية من plusTipTracker الآلي تحليل تتبع هو القدرة على قياس وتقييم كل خلية والإقليمية تغييرات كاملة في ديناميات النمو طن متري. اشتراط وجود خلية لتصبح الاستقطاب هو شرط مسبق ضروري لهجرة الخلايا الاتجاه. كما معروف منذ فترة طويلة مثل هذه، العظة مما يشير الاستقطاب إلى العوامل الدافعة الرئيسية لاتجاهي خلية الهجرة 30،31،51،54،56،80،81 . على سبيل المثال، يشير جزيئات قابلة للذوبان مثل عامل نمو بطانة الاوعية لحث بلمرة الأكتين والنمو MT نحو جديلة VEGF في أنواع الخلايا البطانية 2،82-87. بالإضافة إلى ذلك، ردا على التفاعلات المادية مع إدارة المحتوى في المؤسسة (على سبيل المثال، والامتثال وmechanosensing الأبعاد)، HUVECs تعدل ديناميات MT عن طريق تنظيم محليا الخرائط لتعزيز النمو MT داخل التمطيط نتوءات متفرعة، وهذا يعمل على توجيه الهجرة HUVEC في اتجاه جديلة 5،31،88. وهكذا، والاستقطاب في استجابة لمنبهات إشارات الخلية يسلط الضوء على الحاجة إلى تقييم تجريبي التغيرات المحلية في ديناميات هيكل الخلية.

في وقت واحد التصوير الخلية الحية من ديناميات MT النمو (باستخدام نهج EB3) وهجرة الخلايا HUVEC من الصعب للغاية على أداء لالنظام التجاري المتعدد الأطراف تنمو على نطاق ومرة ​​ثانية، في حين تحدث تغييرات في شكل الخلية والهجرة الاتجاه على نطاق والوقت من ساعة. إلا أن كلا من العمليات لينكه وثيقد. وعلاوة على ذلك، المستمر، والتصوير السريع لEB3-fluorescently المسمى على نطاق والمرة الثانية يؤدي إلى photobleaching من الإشارة EB3. محاولات للتغلب على هذه المشكلة عن طريق إجراء سلسلة التصوير قصيرة من EB3 (1-2 دقيقة سلسلة الاستحواذ) وكانت كل 30 دقيقة ناجحة، ولكن يمكن أن يتحقق إلا في عدد قليل من ECS التي كان التعبير الأمثل للEB3 والتي لم تظهر سلبي آثار لتكرار إضاءة ليزر 5.

نهج بديل يسمح للتفسيرات كيفية مساهمة ديناميات النمو MT إلى تغييرات في شكل الخلية والهجرة هي منطقة plusTipTracker الاهتمام (ROI) أداة 35 (انظر بروتوكول 6.6). هذه المنهجية تسمح كله نمو الخلايا MT المسارات لتكون مقسمة إلى مناطق المعرفة من قبل المستخدم، والتي من مسارات النمو MT ومن ثم يمكن استخراج وتحليلها. على سبيل المثال، قد كشفت مقارنات "تشعبت" مقابل مناطق "غير متفرعة" الخلية التي النظام التجاري المتعدد الأطراف زراعة المزيد من الصورةالمتواضع وأكثر من ذلك باستمرار داخل المناطق تشعبت بالمقارنة مع خلية محيط غير متفرعة 5. في الاستقطاب الجرح الحافة HUVECs، كشفت مقارنات بين الحافة الأمامية وراء ديناميات النمو حافة MT التي يسببها MCAK MT التفكيك هو تحول دون تحديدا داخل الحافة الأمامية، ولكن ليس على حافة زائدة. وكشف تقييم الإقليمي الرئيسي وراء ديناميات النمو حافة MT في HUVECs معربا عن RAC1 و / أو المسوخ الفسفرة من MCAK كذلك أن تفعيل يسببها RAC1 لأورورا-A كيناز على وجه التحديد ومحليا يمنع النشاط MCAK داخل الحافة الأمامية لقيادة HUVEC الاستقطاب والهجرة اتجاهي 31. وهكذا، سمح مزيج من تتبع الآلي من ديناميات النمو MT والتقييم الإقليمي للديناميات النمو MT داخل نتوءات متفرعة و / أو الحافة الأمامية من الجرح الحافة HUVECs لنا لربط ديناميات النمو MT إلى HUVEC التشكل والهجرة.

والبروتوكولات المذكورة هي المصممد لتوفير منهجية واضحة عموما وقابلة للتكرار للغاية للثقافة HUVEC والتحقيق التجريبي. ومع ذلك، فإن العديد من تفاصيل بروتوكول معقدة وتستغرق وقتا طويلا، والتي، بدورها، توفر فرصة للأخطاء أو صعوبات في إجراء المنهجية التجريبية. في حين جرت محاولة لمعالجة المشاكل المحتملة في جميع أنحاء بروتوكول، وهنا يتم توفير إضافي، استكشاف الأخطاء وإصلاحها مفصل من المشاكل المحتملة التي هي أقل شيوعا أو يختصر على خلاف ذلك كما يلاحظ في بروتوكولات المنهجية.

تتعلق coverslips طلاء مع ركائز بولي أكريلاميد (بروتوكول 2.2)، وهي مشكلة شائعة الذي يطرح نفسه هو الطبيعة المعقدة لتفعيل coverslips الزجاج، اقتران بولي أكريلاميد على الزجاج، وتفعيل بولي أكريلاميد، ثم اقتران ECM للبولي أكريلاميد. خطوة صعبة للغاية، وربما الإشكالية والتثقيف HUVECs على فبرونيكتين / هلام بولي أكريلاميد بعد التعرض للبولياcoverslips المغلفة crylamide إلى 2 ملم سلفو SANPAH (الخطوة 2.2.2.6 أعلاه). فمن الأهمية بمكان لنجاح زراعة HUVECs على هذه الركائز التي سلفو SANPAH إزالتها تماما من النظام التجريبي التالية اقتران ECM. وهذا يمكن أن يكون أفضل إنجاز طريق الغسيل مع ده 2 O واحتضان لل coverslips في ده 2 O على شاكر بين عشية وضحاها. إذا الخلايا المستزرعة على موبينيل بولي أكريلاميد لا البقاء على قيد الحياة، أو إذا الجدوى أقل مما كان متوقعا، وزيادة وتكرار غسل سلفو SANPAH بعد الاقتران إلى فبرونيكتين (الخطوة 2.2.2.9) من المستحسن أن يحتمل تخفيف من حدة هذه المشكلة.

المتصلة بالبروتوكول 3 ([كدنا ترنسفكأيشن والثقافة HUVEC على ساترة)، له تأثير كبير على نجاح العملية Electroporation للهو التعامل مع HUVECs سواء أثناء trypsinization من الخلايا لإخراجها من القارورة البلاستيكية، وعقب اختتام وElectroporation لل(الخطوات 3،3-3،4 أعلاه). فمن الأهمية بمكان لرعايةرصد الكامل لHUVECs بينما في التربسين، وبحيث لا يتجاوز الوقت اللازم للخلايا أن "جولة المتابعة" على سطح القارورة (عادة 1-2 دقيقة). الوقت الزائد في التربسين هو سبب رئيسي للوفاة HUVEC، والتي عادة ما لم تتحقق حتى يتم مطلي الخلايا على coverslips المغلفة فبرونيكتين (الخطوة 3.4) ثم تفشل لنعلق على الركيزة.

نفس الدرجة من الأهمية، HUVECs (ومعظم أنواع الخلايا الأولية) لا تبلي بلاء حسنا عندما علقت لفترات طويلة في المخزن المؤقت Electroporation لل. خلال التجارب على نطاق أوسع، على سبيل المثال، حيث أن المستخدم لديه خمسة أو أكثر من الشروط التي تتطلب Electroporation لل، فمن الأفضل للحفاظ على الخلايا مكعبات في أنابيب الفردية (1 أنبوب في ترنسفكأيشن) ومزجها، واحد في واحد في وقت ، في المنطقة العازلة Electroporation للمباشرة قبل Electroporation لل. هذا النهج يقلل فترة حضانة في المخزن Electroporation للومكبر بقاء HUVEC. بالإضافة إلى ذلك، والإنقاذ الفوري في وسائل الإعلام ثقافة الكامل هو أيضا هيدروitical Electroporation للالتالية. تأخر الإنقاذ من دقيقة واحدة أو أكثر Electroporation للالتالية يمكن أن يؤدي إلى الموت القريب HUVEC كاملة وبالتالي ينبغي تجنبها.

المتعلقة فحص الهجرة الخلية (بروتوكول 9)، وتقنية زراعة HUVECs في كثافة عالية للغاية تعتمد على تعديل الحرج (كما هو موضح في الخطوة 9.2) من منهجية زراعة الخلايا HUVEC التقليدية (كما هو موضح في البروتوكول 3) يتطلب تجفيف فبرونيكتين المغلفة ساترة من أجل تمكين ثقافة HUVEC في منطقة صغيرة جدا من ساترة. في كثير من الأحيان، إذا كانت ساترة ليست جفت تماما أو إذا كان طلاء مسبق من ساترة مع فبرونيكتين (الخطوات 2.1 أو 2.2) لم يكن فعالا، والخلايا التي تحتوي على وسائل الإعلام التي يتم وضعها على ساترة سوف تفقد التوتر السطحي، وتوسيع ل حواف ساترة، مما يقلل من كثافة الخلايا على ساترة. أسلوب واحد لاستكشاف هذه المشكلة المحتملة هو نضح وسائل الإعلام من ساترة ثموضع ساترة (لا يزال في طبق 35MM به) في الجزء الخلفي من مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لمدة 5-10 دقائق. هذا التكيف يمكن أن تساعد على السماح لتدفق الهواء داخل مجلس الوزراء للمساعدة في تجفيف الطبق. إذا يبقى أي سائل مرئية على ساترة بعد تجفيف الهواء، ونضح البقع السائلة ومرة ​​أخرى تسمح للهواء الجاف لمدة 5-10 دقيقة إضافية في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. ومن المهم أن نلاحظ أنه لا يوجد طريقة لتجنب تماما هذه المشكلة المحتملة، ولكن لم أصبح أقل من قضية مع الممارسة المتكررة للبروتوكول. وإنما هو أيضا توصية استكشاف الأخطاء وإصلاحها عند إعداد coverslips لفحص الهجرة الخلية (أو أي فحص، بشكل عام)، لإعداد coverslips اضافية ويكون HUVECs إضافية جاهزة للذهاب في حالة حدوث مشاكل على طول الطريق.

مع هذه الاعتبارات استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الاعتبار، فمن المهم أيضا تسليط الضوء على فائدة من البروتوكولات مناقشتها وآثارها في مجال البحوث بيولوجيا الخلية في المستقبل. انطباق إلى polyacrنهج ylamide واسع النطاق، ويشمل ليس فقط دراسات ثنائية الأبعاد الاشتباك خلية ECM (المذكورة أعلاه)، ولكن أيضا تحقيقات ثلاثية الأبعاد 5. هذا التطبيق أمر بالغ الأهمية لزيادة فهمنا لكيفية تنظيم HUVECs شكل الخلية والهجرة في بيئات الفسيولوجية وينبغي أن توفر المحققين فهم أساسي لكيفية التغيرات المورفولوجية يتم التنسيق مع تغيرات هيكل الخلية. بينما البروتوكولات وصفها هنا يركز على قياسات ديناميات النمو MT، فإن الغالبية من البروتوكولات يمكن وينبغي تكييفها لقياس أي عدد من جوانب قابلة للقياس المجهر غيرها من التفاعلات خلية ECM. وفيما يتعلق ديناميات MT، هناك العديد من الخرائط، بما في ذلك 14 أسرة على الأقل من kinesins 89، ولكل منها دور محتمل في المساهمة في HUVEC الاستقطاب والهجرة الموجهة، وكلها يمكن أن يتم التحقيق باستخدام البروتوكولات المعروضة.

التحقيقات المستقبلية ينبغي ليسوتو أن تستهدف المشاركة خلية ECM في وضعها الطبيعي مقابل الدول المريضة. بروتوكولات HUVEC المقدمة هنا تنطبق على التحقيقات في عمليات التماثل الساكن الأوعية الدموية العادية، فضلا عن الحالات المرضية بما فيها أمراض القلب، واعتلال الشبكية، نمو الورم والانبثاث، على سبيل المثال لا الحصر. التصريف شفافة واضح موبينيل وبولي أكريلاميد ركائز الامتثال قابلة مع الدراسات المجهرية سيسمح للدراسات الجذب للخلية ECM مثل تلك الخلية البطانية الأوعية الدموية الأوعية الدموية يمكن رصدها مع القرار المكانية والزمانية عالية. وقد بدأت هذه الأنواع من المناهج التجريبية بالفعل للكشف عن اختلافات هامة في شكل الخلايا البطانية، والاستقطاب، والهجرة، والآثار المترتبة على البروتينات التي تنظم هذه العمليات 5،31،90. ينبغي أن تهدف الجهود في المستقبل لتحديد كيفية الجمع بين الامتثال ECM وmechanosensing الأبعاد يمكن أن تستخدم لمحليا البروتينات السيطرة التي تستهدف وتنظيم ديناميات هيكل الخلية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شكر خاص للدكتور كلير محمد الملاح للالإرشاد والمناقشات، ميشيل بيرد ومايك ديفيدسون لتوفير العديد من يبني [كدنا الفلورية المستخدمة في هذه الدراسات، وكاثرين آبلجيت واللاعب Gaudenz Danuser لتطوير plusTipTracker MT برامج التحليل. وأيد هذا العمل، في جزء منه، من خلال منحة لكام من القومي للقلب والرئة الدم المعهد (NHLBI) والمعاهد الوطنية للصحة (NIH). (المنحة: 4K22HL113069).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Aurora A Inhibitor ISelleck ChemicalsS1451
2٪ Bis solutionBio-Rad1610142
3-aminopropyltrimethyloxysilaneSigma-AldrichA3648
40٪ أكريلاميدBio-Rad1610140
405 ، 488 ، 561 ، 640 نانومتر وحدة تجميع ليزر MLC400 عالية الطاقةAgilent Technologies99462
بيرسلفات الأمونيومسيجما ألدريتشA3678
مضاد & ndash ؛ حبات الترسيب المناعي IgG الفأركواشف TrueBlot ؛ شركة روكلاند88-1688-31
مضاد & - - - حبات الأرانب IgG الحصر المناعيكواشف TrueBlot. شركة روكلاند88-7788-31
ET455 / 50 م ، مرشح انبعاث DAPI-ETChroma Technology Corp.ET455 / 50m
ET525 / 36m مرشح انبعاثChroma Technology Corp.ET525 / 36m
ET605 / 70m مرشح الانبعاثChroma Technology Corp.ET605 / 70m
ET700 / 75m مرشح الانبعاثChroma Technology Corp.ET700 / 75m
مصل الأبقار الألبومين الكسر Vمنتجات RPI منتجاتA30075-100.0
كاميرا الجهاز المبرد بالشحنAndor Technology77026010
Cy3 حمار مضاد للأرانبJackson ImmunoResearch711-165-152
DPBSThermo Fisher Scientific14190250
Dyelight 649 الماعز المضاد للفئرانJackson ImmunoResearch112-496-068
EGM-MV SingleQuot Supply & amp عوامل النمو (المحتويات الموضحة أدناه)LonzaCC-4143
مصل الأبقار الجنينية 25 مل
مستخلص دماغ البقر 2.0 مل
كبريتات الجنتاميسين 0.5 مل
عامل نمو البشرة 0.5 مل
هيدروكورتيزون 0.5 مل
البنسلين / الستربتومايسين (10,000 وحدة دولية قلم / مل ، 10,000 &# 181 ؛ ز البكتيريا العقدية / مل)   10.0 مل
EGTASigma-AldrichE3884-100G
أداة مصراع إلكتروني77016099
FibronectinEMD MilliporeFC010
GlutaraldehydeThermo Fisher ScientificS80026
HALT مثبط البروتيازالحراري فيشر العلميPI-78425
HEPESSigma-AldrichH4034
HRP الماعز المضاد للفأرJackson ImmunoResearch115-036-062
HRP الماعز المضاد للأرانبJackson ImmunoResearch111-036-045
غشاء PVDF Immuno-BlotBio-Rad162-0174
LanolinThermo Fisher Scientific8006-54-0
المغنيسيوم كبريتاتسيجما ألدريتشM2643-500G
مجهرنيكون TiEMEA53100
المرحلة الآليةتقنيات ASIMS-2000
تصاعد متوسطDakoCS70330-2
ماوس مضاد للشفق القطبي Abcamab130156
ماوس مضاد ل GAPDHAbcamab9484
ماوس أنتي-MCAKAbcamab50778
الفأر المضاد للتوبولين (DM1A)إشارات الخلية3873S
طلاء الأظافرعلوم المجهر الإلكتروني72180
NIS Elements SoftwareNikonMQS310000
Nucleofector Kit VLonzaVACA-1003يحتوي على المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي
البارافينثيرمو فيشر ScientificP31-500
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة دولية قلم / مل ، 10,000 &# 181 ؛ ز البكتيريا العقدية / مل)MP Biomedicals91670249
الفازلينداو كورنينج2021854-1113
الأنابيبسيجما ألدريتشP6757-100G
بالإضافة إلى TipTracker
أرنب مضاد ل GFPAbcamab290
أرنب مضاد &ndash ؛ pT288 &ndash ؛ أوروراأبكامab18318
الفئران المضادة – α-tubulinAbD SerotecMCA78G
بوروهيدريد الصوديومثيرمو فيشر Scientific678-10
قرص الغزل  أندور تكنولوجييوكاجاوا CSU-X1
Sulfo-SANPAHThermo Fisher ScientificPI-22589
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstrateThermo Fisher Scientific34080
Triton X-100Thermo Fisher ScientificBP151-500
TrypsinCorningMT25053CI
Tween-20Thermo فيشر العلميBP337
تقنية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerhardt, H., Betsholtz, C. How do endothelial cells orientate? EXS. 94, 3-15 (2005).
  2. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. J Cell Biol. 161, 1163-1177 (2003).
  3. Bayless, K. J., Johnson, G. A. Role of the cytoskeleton in formation and maintenance of angiogenic sprouts. J Vasc Res. 48, 369-385 (2011).
  4. Fischer, R. S., Gardel, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Waterman, C. M. Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching. Curr Biol. 19, 260-265 (2009).
  5. Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. J Cell Biol. 192, 321-334 (2011).
  6. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nat Cell Biol. 5, 599-609 (2003).
  7. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Actomyosin-based retrograde flow of microtubules in the lamella of migrating epithelial cells influences microtubule dynamic instability and turnover and is associated with microtubule breakage and treadmilling. J Cell Biol. 139, 417-434 (1997).
  8. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Microtubule dynamics: treadmilling comes around again. Curr Biol. 7, R369-R372 (1997).
  9. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of leading edge microtubule and actin dynamics downstream of Rac1. J Cell Biol. 161, 845-851 (2003).
  10. Ahmad, F. J., Pienkowski, T. P., Baas, P. W. Regional differences in microtubule dynamics in the axon. J Neurosci. 13, 856-866 (1993).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
  12. Dent, E. W., Kalil, K. Axon branching requires interactions between dynamic microtubules and actin filaments. J Neurosci. 21, 9757-9769 (2001).
  13. Dehmelt, L., Nalbant, P., Steffen, W., Halpain, S. A microtubule-based, dynein-dependent force induces local cell protrusions: Implications for neurite initiation. Brain Cell Biol. 35, 39-56 (2006).
  14. van Veen, M. P., van Pelt, J. Dynamic mechanisms of neuronal outgrowth. Prog Brain Res. 102, 95-108 (1994).
  15. Myers, K. A., He, Y., Hasaka, T. P., Baas, P. W. Microtubule transport in the axon: Re-thinking a potential role for the actin cytoskeleton. Neuroscientist. 12, 107-118 (2006).
  16. Stehbens, S., Wittmann, T. Targeting and transport: how microtubules control focal adhesion dynamics. J Cell Biol. 198, 481-489 (2012).
  17. Stehbens, S. J., et al. CLASPs link focal-adhesion-associated microtubule capture to localized exocytosis and adhesion site turnover. Nat Cell Biol. 16, 561-573 (2014).
  18. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Spatial regulation of CLASP affinity for microtubules by Rac1 and GSK3beta in migrating epithelial cells. J Cell Biol. 169, 929-939 (2005).
  19. Kumar, P., et al. GSK3beta phosphorylation modulates CLASP-microtubule association and lamella microtubule attachment. J Cell Biol. 184, 895-908 (2009).
  20. Al-Bassam, J., Chang, F. Regulation of microtubule dynamics by TOG-domain proteins XMAP215/Dis1 and CLASP. Trends Cell Biol. 21, 604-614 (2011).
  21. Desai, A., Verma, S., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes. Cell. 96, 69-78 (1999).
  22. Hunter, A. W., et al. The kinesin-related protein MCAK is a microtubule depolymerase that forms an ATP-hydrolyzing complex at microtubule ends. Mol Cell. 11, 445-457 (2003).
  23. Lee, T., Langford, K. J., Askham, J. M., Bruning-Richardson, A., Morrison, E. E. MCAK associates with EB1. Oncogene. 27, 2494-2500 (2008).
  24. Walczak, C. E., Mitchison, T. J., Desai, A. XKCM1: a Xenopus kinesin-related protein that regulates microtubule dynamics during mitotic spindle assembly. Cell. 84, 37-47 (1996).
  25. Maney, T., Hunter, A. W., Wagenbach, M., Wordeman, L. Mitotic centromere-associated kinesin is important for anaphase chromosome segregation. J Cell Biol. 142, 787-801 (1998).
  26. Lan, W., et al. Aurora B phosphorylates centromeric MCAK and regulates its localization and microtubule depolymerization activity. Curr Biol. 14, 273-286 (2004).
  27. Ganem, N. J., Upton, K., Compton, D. A. Efficient mitosis in human cells lacking poleward microtubule flux. Curr Biol. 15, 1827-1832 (2005).
  28. Wordeman, L., Wagenbach, M., von Dassow, G. MCAK facilitates chromosome movement by promoting kinetochore microtubule turnover. J Cell Biol. 179, 869-879 (2007).
  29. Kline-Smith, S. L., Walczak, C. E. The microtubule-destabilizing kinesin XKCM1 regulates microtubule dynamic instability in cells. Mol Biol Cell. 13, 2718-2731 (2002).
  30. Moore, A. T., et al. MCAK associates with the tips of polymerizing microtubules. J Cell Biol. 169, 391-397 (2005).
  31. Braun, A., et al. Rac1 and Aurora A regulate MCAK to polarize microtubule growth in migrating endothelial cells. J Cell Biol. 206, 97-112 (2014).
  32. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H., Akhmanova, A. Regulation of localization and activity of the microtubule depolymerase MCAK. Bioarchitecture. 1, 80-87 (2011).
  33. Kushner, E. J., et al. Excess centrosomes disrupt endothelial cell migration via centrosome scattering. J Cell Biol. 206, 257-272 (2014).
  34. Siekmann, A. F., Affolter, M., Belting, H. G. The tip cell concept 10 years after: new players tune in for a common theme. Exp Cell Res. 319, 1255-1263 (2013).
  35. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. J Struct Biol. 176, 168-184 (2011).
  36. Montenegro Gouveia, S., et al. In vitro reconstitution of the functional interplay between MCAK and EB3 at microtubule plus ends. Curr Biol. 20, 1717-1722 (2010).
  37. Honnappa, S., et al. An EB1-binding motif acts as a microtubule tip localization signal. Cell. 138, 366-376 (2009).
  38. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker software to measure microtubule dynamics in Xenopus laevis growth cones. J Vis Exp. , e52138(2014).
  39. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13(2001).
  40. Kutys, M. L., Yamada, K. M. An extracellular-matrix-specific GEF-GAP interaction regulates Rho GTPase crosstalk for 3D collagen migration. Nat Cell Biol. 16, 909-917 (2014).
  41. Friedl, P., Wolf, K., Zegers, M. M. Rho-directed forces in collective migration. Nat Cell Biol. 16, 208-210 (2014).
  42. Hellstrom, M., et al. Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis. Nature. 445, 776-780 (2007).
  43. Semina, E. V., et al. T-cadherin activates Rac1 and Cdc42 and changes endothelial permeability. Biochemistry (Mosc). 74, 362-370 (2009).
  44. Liang, Z. W., et al. Nestin-mediated cytoskeletal remodeling in endothelial cells: novel mechanistic insight into VEGF-induced cell migration in angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 308, C349-C358 (2015).
  45. Kamath, K., Smiyun, G., Wilson, L., Jordan, M. A. Mechanisms of inhibition of endothelial cell migration by taxanes. Cytoskeleton (Hoboken). 71, 46-60 (2014).
  46. Pasquier, E., et al. Antiangiogenic concentrations of paclitaxel induce an increase in microtubule dynamics in endothelial cells but not in cancer cells. Cancer Res. 65, 2433-2440 (2005).
  47. Sun, X., et al. Regulation of tumor angiogenesis by the microtubule-binding protein CLIP-170. Protein Cell. 4, 266-276 (2013).
  48. Lyle, K. S., Corleto, J. A., Wittmann, T. Microtubule dynamics regulation contributes to endothelial morphogenesis. Bioarchitecture. 2, 220-227 (2012).
  49. Ganguly, A., Yang, H., Zhang, H., Cabral, F., Patel, K. D. Microtubule dynamics control tail retraction in migrating vascular endothelial cells. Mol Cancer Ther. 12, 2837-2846 (2013).
  50. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of microtubule destabilizing activity of Op18/stathmin downstream of Rac1. J Biol Chem. 279, 6196-6203 (2004).
  51. Waterman-Storer, C. M., Worthylake, R. A., Liu, B. P., Burridge, K., Salmon, E. D. Microtubule growth activates Rac1 to promote lamellipodial protrusion in fibroblasts. Nat Cell Biol. 1, 45-50 (1999).
  52. Pasapera, A. M., et al. Rac1-dependent phosphorylation and focal adhesion recruitment of myosin IIA regulates migration and mechanosensing. Curr Biol. 25, 175-186 (2015).
  53. Cooper, J. R., Wagenbach, M., Asbury, C. L., Wordeman, L. Catalysis of the microtubule on-rate is the major parameter regulating the depolymerase activity of MCAK. Nat Struct Mol Biol. 17, 77-82 (2010).
  54. Hu, Y. L., et al. Roles of microtubule dynamics and small GTPase Rac in endothelial cell migration and lamellipodium formation under flow. J Vasc Res. 39, 465-476 (2002).
  55. Davis, G. E., Koh, W., Stratman, A. N. Mechanisms controlling human endothelial lumen formation and tube assembly in three-dimensional extracellular matrices. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 270-285 (2007).
  56. Spaargaren, M., Bos, J. L. Rab5 induces Rac-independent lamellipodia formation and cell migration. Mol Biol Cell. 10, 3239-3250 (1999).
  57. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125, 5917-5926 (2012).
  58. Westenskow, P. D., et al. Ras pathway inhibition prevents neovascularization by repressing endothelial cell sprouting. J Clin Invest. 123, 4900-4908 (2013).
  59. Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2008).
  60. Tarnawski, W., et al. A robust algorithm for segmenting and tracking clustered cells in time-lapse fluorescent microscopy. IEEE J Biomed Health Inform. 17, 862-869 (2013).
  61. Rambaldi, D., Pece, S., Di Fiore, P. P. flowFit: a Bioconductor package to estimate proliferation in cell-tracking dye studies. Bioinformatics. 30, 2060-2065 (2014).
  62. Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, e81266(2013).
  63. Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB(R) package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PLoS One. 8, e72636(2013).
  64. Klein, J., et al. TLM-Tracker: software for cell segmentation, tracking and lineage analysis in time-lapse microscopy movies. Bioinformatics. 28, 2276-2277 (2012).
  65. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell Tissue Res. 314, 15-23 (2003).
  66. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  67. Davis, G. E., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Koh, W. Molecular basis for endothelial lumen formation and tubulogenesis during vasculogenesis and angiogenic sprouting. Int Rev Cell Mol Biol. 288, 101-165 (2011).
  68. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a006601(2012).
  69. Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods Mol Biol. 1066, 17-28 (2013).
  70. Kim, D. J., Martinez-Lemus, L. A., Davis, G. E. EB1, p150Glued, and Clasp1 control endothelial tubulogenesis through microtubule assembly, acetylation, and apical polarization. Blood. 121, 3521-3530 (2013).
  71. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  72. Drechsel, D. N., Kirschner, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4, 1053-1061 (1994).
  73. Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104, 277-288 (1987).
  74. Kirschner, M., Mitchison, T. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell. 45, 329-342 (1986).
  75. Malikov, V., Cytrynbaum, E. N., Kashina, A., Mogilner, A., Rodionov, V. Centering of a radial microtubule array by translocation along microtubules spontaneously nucleated in the cytoplasm. Nat Cell Biol. 7, 1213-1218 (2005).
  76. Wieczorek, M., Bechstedt, S., Chaaban, S., Brouhard, G. J. Microtubule-associated proteins control the kinetics of microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 17, 907-916 (2015).
  77. Wiese, C., Zheng, Y. Microtubule nucleation: gamma-tubulin and beyond. J Cell Sci. 119, 4143-4153 (2006).
  78. Shin, W. D., Fischer, R. S., Kanchawong, P., Kim, Y., Lim, J., Myers, K. A., Nishimura, Y., Plotnikov, S. V., Thievessen, I., Yarar, D., Sabass, B., Waterman, C. M. Live cell imaging: A laboratory. , 2nd, 119-138 (2010).
  79. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  80. Gundersen, G. G., Bulinski, J. C. Selective stabilization of microtubules oriented toward the direction of cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5946-5950 (1988).
  81. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? J Cell Sci. 114, 3795-3803 (2001).
  82. Jakobsson, L., Bentley, K., Gerhardt, H. VEGFRs and Notch: a dynamic collaboration in vascular patterning. Biochem Soc Trans. 37, 1233-1236 (2009).
  83. Blanco, R., Gerhardt, H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a006569(2013).
  84. Gerhardt, H. VEGF and endothelial guidance in angiogenic sprouting. Organogenesis. 4, 241-246 (2008).
  85. Napione, L., et al. Unraveling the influence of endothelial cell density on VEGF-A signaling. Blood. 119, 5599-5607 (2012).
  86. Benedito, R., et al. Notch-dependent VEGFR3 upregulation allows angiogenesis without VEGF-VEGFR2 signalling. Nature. 484, 110-114 (2012).
  87. Czeisler, C., Mikawa, T. Microtubules coordinate VEGFR2 signaling and sorting. PLoS One. 8, e75833(2013).
  88. Howes, S. C., Alushin, G. M., Shida, T., Nachury, M. V., Nogales, E. Effects of tubulin acetylation and tubulin acetyltransferase binding on microtubule structure. Mol Biol Cell. 25, 257-266 (2014).
  89. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
  90. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nat Protoc. 7, 2056-2066 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HUVEC EB3 PlusTipTracker

مقالات ذات صلة