يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الرطب الكيمياء والببتيد الشلل على تترافلوروإيثيلين لتحسين خلية التصاق

7.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54272

⸱

أغسطس 15, 2016

 ,  , 
1Sidra Cardiovascular Research, 2Department of Organic Chemistry, Johannes-Gutenberg University

في هذه المقالة

ملخص

التصاق الخلايا هو المفتاح للعديد من الأساليب في أبحاث المواد الحيوية وهندسة الأنسجة. يتم تقديم تقنية خطوة بخطوة باستخدام الكيمياء الرطبة لتعديل سطح البوليمر المهم PTFE مع الببتيدات.

الملخص

ومنح المواد السطحية مع خصائص الخلية لاصقة هو وضع استراتيجية مشتركة في مجال البحوث بيولوجية وهندسة الأنسجة. هذا مثير للاهتمام بشكل خاص للبوليمرات وافق بالفعل أن يكون لها استخدام طويلة في الطب لأن هذه المواد بشكل جيد القضايا السمات التي تميزت والقانونية المرتبطة بإدخال البوليمرات تصنيعه حديثا يمكن تجنبها. تترافلوروإيثيلين (PTFE) هي واحدة من أكثر المواد المستخدمة في كثير من الأحيان لتصنيع ترقيع الأوعية الدموية ولكن البوليمر يفتقر التصاق الخلية تعزيز الميزات. تبطنن، أي يعتبر تغطية كاملة من الطعوم السطح الداخلي مع طبقة متموجة من الخلايا البطانية المفتاح لتحقيق الأداء الأمثل، وذلك أساسا عن طريق خفض thrombogenicity واجهة الاصطناعية.

تبحث هذه الدراسة في نمو الخلايا البطانية على PTFE المعدلة الببتيد وتقارن هذه النتائج لتلك التي حصلت على الركيزة معدلة. اقتران معيتم تنفيذ البطانية خلية لاصقة الببتيد الارجنتين-غلو-ASP-فال (REDV) عن طريق تفعيل البوليمر تحتوي على الفلورين باستخدام naphthalenide كاشف الصوديوم، تليها خطوات اقتران اللاحقة. ويتم إنجاز ثقافة الخلية باستخدام خلايا الحبل السري الإنسان الوريد غشائي (HUVECs) ونمو الخلايا ممتاز على مواد يجمد الببتيد يتجلى على مدى أسبوعين.

المقدمة

البوليمرات المختلفة التي تستخدم في الطب التي تمت الموافقة عليها لبعض الوقت لا يحمل تعزيز توافق مع الحياة، أي عدم وجود خلية الإلتصاق، تحريض التغليف متليفة وthrombogenicity، على سبيل المثال لا الحصر. التفاعلات بين بيولوجية والنظام البيولوجي تجري بشكل رئيسي على سطح الغرسة. ونتيجة لذلك، ركزت البحوث على تعديل السطح من أجل خلق الخصائص الملائمة لتطبيق المطلوب مع ترك خصائص السائبة من المواد تتأثر. يستخدم تترافلوروإيثيلين (PTFE) كما البوليمر خاملة من الناحية الفسيولوجية في العديد من المجالات الطبية مثل فتق شبكة الجراحية 1، والموانئ الطبية (2) والأهم من ذلك، ترقيع الأوعية الدموية 3.

ولا سيما في حالات الدم الاتصال طبيعة مسعور من PTFE يسبب امتصاص غير محدد من مكونات البلازما ونتيجة لالتصاق الصفائح الدموية نتيجة، وغالبا ما يؤدي في thrombotiأحداث ج وانسداد الكسب غير المشروع (4). وعلاوة على ذلك، PTFE، مثل معظم البوليمرات، لا يدعم التصاق الخلايا والتغطية التي ستكون سمة مرغوب فيه للحث على تشكيل طبقة المفيدة لخلايا بطانة الأوعية الدموية (ECS) على (اللمعية) السطح الداخلي من الكسب غير المشروع الأوعية الدموية 5. ومن المتوقع ان ينجز العديد من المهام من المكافئ الطبيعي، لا سيما خصائص antithrombogenic 6 منه والبطانة الجزيئية الحيوية. ويستند الاستراتيجية العامة تعديل الجزيئية الحيوية على مفهوم ومنح حصرا المواد مع خلية الإلتصاق مع ترك خصائص المواد السائبة تتأثر. وبالإضافة إلى ذلك، قد يتم تخفيض التصاق الصفائح الدموية من خلال دمج مكافحة اللاصقة (المانعة للقاذورات) سمات 7. وقد وصفت تعزز بقوة خلية التصاق ملزمة لالمستقبلات الخلوية، التي تنتمي إلى فئة من integrins 8 - الببتيدات مختلف - مستمدة في معظمها من البروتينات المصفوفة خارج الخلية. ويكونالحادي والمعروفة سبيل المثال في هذا الصدد هو الببتيد الارجنتين-الغليسين-آسيا والمحيط الهادئ (RGD) التي تتفاعل مع معظم أنواع الخلايا. يتم التعرف على تسلسل الأحماض الأمينية الأخرى التي integrins أعرب حصرا على خلايا معينة. على سبيل المثال، تم العثور على الارجنتين-غلو-ASP-فال (REDV) وصور-إيل الغليسين-سر-الارجنتين (YIGSR) لربط ECS بطريقة محددة 9. وقد تم تنفيذ التساهمية تجميد هذه الببتيدات الخروج على مجموعة كبيرة من المواد بطبيعتها غير لاصقة بما في ذلك المعادن والبوليمرات 10،11.

PTFE التي يسهل اختراقها، وسعت على نحو أدق PTFE (EPTFE) - جنبا إلى جنب مع البولي ايثيلين تيريفثاليت (PET) - هو المادة الأكثر أهمية لإنتاج الأوعية الدموية الطعوم 12. ما يعرقل تأسيس التقنيات المادية لعلاج المناسبة، مثل تعديل بلازما 13 أو عن طريق وسائل الضوئية 14، من حقيقة أن الهياكل التي يسهل اختراقها و / أو أنبوبي ليست قابلة للعلاج بسهولة داخل المسام أو لمعة على التوالي. الكيمياء الرطبةعلى PTFE مهمة صعبة بسبب الطبيعة الخاملة للغاية من البوليمر تحتوي على الفلورين الذي يقاوم معظم الهجمات الكيماوية 15.

في هذه الورقة نحن تصف طريقة سطحي نسبيا لاستراتيجية التساهمية تعديل. مقتبس من إجراء لتقديم PTFE bondable، تم إنشاء مجموعات وظيفية على سطح المواد التي تكون بمثابة نقاط الربط لمزيد من الاقتران من الجزيئات النشطة بيولوجيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الصوديوم Naphthalenide تفعيل الحل وتفعيل السطح

ملاحظة: إجراء ردود الفعل في غطاء الدخان جيد التهوية. اتبع القواعد العامة للتعامل مع المذيبات سريعة الاشتعال والمعادن للتآكل مثل الصوديوم المعدني. النفثالين له رائحة كريهة جدا (نفتلين)، حتى بكميات صغيرة جدا! إذا لم يذكر خلاف ذلك يتم تنفيذ ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة. أزيد الصوديوم شديدة السمية! THF (99.9٪، انظر قائمة من المواد) تم تخزينها على ما يقرب من 20٪ (من حيث الحجم) المنخل الجزيئي. استخلاص THF مع محتوى الماء ملحوظ على الصوديوم. لا تحدث تشكيل naphthalenide الصوديوم إذا كميات ضئيلة من المياه موجودة.

  1. في التوصل إلى حل من 1.4 غرام (10.9 ملمول) من النفثالين في 20 مل رباعي هيدرو الفوران (THF المجفف أكثر من 3 Å المنخل الجزيئي)، إضافة 0،25 غرام (10.9 ملمول) فلز الصوديوم في زجاجة 100 مل المغطاة المسمار مجهزة PTFE- المغلفة شريط التحريك المغناطيسي.
    ملاحظة: Dissoluنشوئها يمكن أن تتعزز بشكل كبير عن طريق خفض الصوديوم إلى قطع صغيرة والتدفئة متواضعة (35 - 40 درجة مئوية). الحل النهائي لديه مظلمة، اللون الأخضر قليلا، ويمكن تخزين تحت ظروف الجفاف بدقة.
  2. لكمة من أصل أقراص PTFE بقطر 12 مم من 0.5 مم المواد احباط سميكة. علامة جانب واحد (على سبيل المثال، باستخدام حرف ختم لكمة) ونظيفة مع ايزو بروبانول.
  3. احتضان السليكوون عينات بشكل فردي في حل تفعيل (الخطوة 1.1) 1 - 2 دقيقة باستخدام ملقط. ملاحظة: تغيير اللون من الأبيض إلى البني الداكن يشير إلى نجاح العلاج.
  4. شطف بعد ذلك مرتين مع THF ثم مع ايزو بروبانول.
    ملاحظة: تم استنفاد الحل naphthalenide عندما تتغير لونه إلى البني الفاتح المائي. حل naphthalenide غير المستخدمة (وربما تحتوي على الصوديوم المعدني) يجب أن تتحلل ببطء عن طريق إضافة ايزو بروبانول قبل التخلص منها.
  5. أكسدة عينات عولجوا في بيروكسيد الهيدروجين (30٪) تحتوي على 20٪ (ث / ت) وحامض الخليك ثلاثي الكلور لمدة 3 ساعة. غسلمع الماء وجافة. والسطح والآن ظهور اللون البني طفيف. ملاحظة: التنشيط ونتيجة الأكسدة في زيادة بشكل كبير بلل من السطح. تم فحص هذه النتيجة بالتفصيل سابقا 14.
  6. علاج أقراص تتأكسد مع 50٪ (ت / ت) hexamethylene الدي إيزوسيانات (HMDI) في THF الجاف لمدة 2 ساعة، وشطف مع THF وتترك لتجف.
  7. يتحلل عينات تحمل الايوسينيت في الماء لمدة 2-3 ساعة وجافة. ملاحظة: سطح السليكوون functionalized الأمينية النهائي هو أكثر استقرارا بكثير من العينات التي تحمل إسوسيانات ومتوافق مع العديد من crosslinkers معيار لمزيد من اقتران.

2. الببتيد الشلل

  1. يعد حل 20٪ (ت / ت) الأثير diethyleneglycol diglycidyl (diepoxide) في 50 ملي العازلة كربونات، ودرجة الحموضة 9.
  2. وضع أقراص aminated مع الجانب ملحوظ بشكل فردي في 24 لوحة جيدا وإضافة 1.5 مل من محلول الايبوكسيد. ضمان التغطية الكاملة للعينات. احتضان لمدة 2 ساعة ويغسل اثنينمرات بالماء ومرة ​​واحدة مع العازلة كربونات.
  3. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 ملغ / الببتيد مل (على سبيل المثال، REDV) في 50 ملي العازلة كربونات، ودرجة الحموضة 9 تحتوي على 0.01٪ نان 3، إلى الجزء السفلي من الآبار الفردية من 24 لوحة جيدا الطازجة ووضع بعناية-functionalized الايبوكسي أقراص رأسا على عقب بعد أن كانوا يشكلون (أي تميز الجانب السلبي) على قطرة من الحل الببتيد. تأكد من أن المسافة بين قاع البئر والقرص PTFE والمبللة تماما بسبب العمل الشعري.
  4. احتضان في غرفة رطبة (على سبيل المثال، أي مربع من البلاستيك قابل للغلق مع غطاء إغلاق محكم) مع جو مرطب (عن طريق وضع المناديل الورقية المبللة على الجزء السفلي) لمدة 3 على الأقل ساعة أو بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: ولو يمكن اعتبار عزر REDV كما تتميز بشكل جيد وتسلسل الأحماض الأمينية المجمعة أو عكس قد يتم تضمين كعنصر تحكم سلبية إضافية.
  5. يغسل ثلاث مرات بالماء وتعقيم في 50٪ ايزو بروبانول / الماء لمدة 30 دقيقة على الأقل. قبل الخلية البذر، rinsالبريد العينات في العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).

البذر 3. خلية

  1. تنمو HUVECs باستخدام إجراءات الثقافة الخلية القياسية 17،18.
  2. وضع العينات الببتيد مترافق مع الجانب تعديل لتصل في 24 لوحات جيدة. استخدام أقراص PTFE غير المعالجة كمجموعة تحكم.
  3. البذور 5 × 10 4 HUVECs في 2 متوسطة مل لكل بئر واحتضان لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في حاضنة.
  4. إزالة الأقراص، وشطف بعناية لإزالة الخلايا غير مرتبط ونقل إلى 24 لوحة جيدا جديدة. إضافة 2 مل من متوسطة جديدة واحتضان للفترة المطلوبة (على سبيل المثال، 24 ساعة، 1 ث، وما إلى ذلك). تغيير المتوسطة كل يومين.
  5. إعداد محلول المخزون 1 ملغ / مل Calcein-AM في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]).
  6. بعد تزايد الخلايا إزالة المتوسطة، ويغسل مع برنامج تلفزيوني وإضافة برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ميكرولتر / مل Calcein-AM وصمة عار (على سبيل المثال، 1 ميكرولتر من محلول المخزون في مل PBS). تستنهض الهمم بلطف وincubatالبريد عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في الظلام.
  7. يغسل مع برنامج تلفزيوني وتتخذ على الفور الميكروسكوب على المجهر مضان مزودة بمرشحات FITC القياسية (تحويلة 488 نانومتر، إم 515 نانومتر). استخدام التكبير 100 أضعاف. أداء يثلث من معدلة وكذلك عينات المعالجة.
  8. باستخدام برنامج ImageJ تحديد منطقة مستعمرة من قبل الخلايا. بدلا من ذلك عد الخلايا يدويا أو استخدام يماغيج. وكلتا الطريقتين تعطي معلومات مماثلة عن المرفق ونمو الخلايا على أسطح المعنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم رصد نتائج الخطوات التفاعل الكيميائي الحيوي عن طريق التحليل الطيفي الأشعة تحت الحمراء (الشكل 1). تفعيل الأولي مع naphthalenide الصوديوم يولد روابط مزدوجة - وإلى حد بسيط - OH-وظائف. إشارة تشير C = C السندات تختفي على أكسدة، مما أسفر عن سطح تحمل على وجه الحصر تقريبا الهيدروكسيل الجماعات. لا تظهر تحليل مزيد من الخطوات اقتران القياسية هنا. التغييرات بسبب اللون إلى تفعيل والأكسدة هي في الاتفاق مع الكيمياء المتوقع أن يستخدم: من ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وصف مفصل للبروتوكول تعديل سطح PTFE يتكون من خطوات متتالية بدءا من القضاء على الفلور من العمود الفقري البوليمر كما هو مبين في الشكل (6). ونتيجة لذلك، يتم تشكيل الطبقة التي تحتوي على كمية وفيرة من روابط مزدوجة مترافق الكربون الكربون في وفقا للون البني الداكن الذي وضعت على العلاج naphthalenide. الأكسدة القياسية مع الحمضية بيروكسيد الهيدروجين ينتج سطح الهيدروكسيلية يرافقه اشراق إلى البني الفاتح، وهذا يعكس فقدان الروابط الثنائية. ومما يدل على هذه العملية بشكل واضح في ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشعروا بمساعدة والتر شولدي (معهد ماكس بلانك لأبحاث البوليمرات ، ماينز ، ألمانيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
رقائق PTFE 0.5 ممكاديلاك بلاستيك   ؛ن / أ
ببتيد REDVGenecustن / أتوليف مخصص >95٪ نقاء
iso-propanolSigma Aldrich34965
رباعي هيدروفوران (THF)سيجما ألدريتش401757
ميثيل سلفوكسيدSigma AldrichD8418
المنخل الجزيئي 3 & Aring ؛سيجما ألدريتش208574
معدن الصوديومسيجما ألدريتش483745
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)سيجما ألدريتشD8537
النفثالينسيجما ألدريتش147141
بيروكسيد الهيدروجين 30٪سيجما ألدريتش95321
حمض ثلاثي كلورو أسيتيكسيجما ألدريتشT6399   ؛
ثنائي إيثيلين جلايكول ثنائي جليسيديل الأثيرسيجما ألدريتش17741
هيكساميثيلين ثنائي أيزوسيانات (HMDI)سيجما ألدريتش52650
كالسين-AMسيجما ألدريتش56496
بيكربونات الصوديومسيجما ألدريتشS6014   ؛
أزيد الصوديومSigma Aldrich71290
24 لوحة بئرGreiner-Bio-One662 160
ATR-FTIR مقياس الطيف الضوئي Nicolet Magna-IR 850& nbsp ؛ نيكوليتن / أ
مجهر مضان أوليمبوس X-70أوليمبوسن / أ
الخلايا البطانية الوريدية المتواضعة (HUVECs)Lonzan / a
ePTFE الطعم الوعائيجورن / أ
ثنائي

المراجع

  1. Doctor, H. G. Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs. J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).
  2. Zaghal, A., et al. Update on totally implantable venous access devices. Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).
  3. Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S. Bioengineered blood vessels. Exp. Opin. Biol. Th. 14, 403-410 (2014).
  4. Wang, M. -J., Tsai, W. -B. Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , Nova Science Publishers. 1 ed (2010).
  5. de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review. Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).
  6. Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art. J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).
  7. Cleary, M. A., et al. Vascular tissue engineering: the next generation. Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).
  8. Ruoslahti, E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).
  9. Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration. J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).
  10. Gabriel, M., et al. Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).
  11. Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface. Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).
  12. Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
  13. Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S. Plasma-based biofunctionalization of vascular implants. Nanomedicine UK. 7, 1907-1916 (2012).
  14. Mikulikova, R., et al. Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene. Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).
  15. Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene. Biomed. Mater. 6, 035007(2011).
  16. Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).
  17. Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function. Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).
  18. Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).
  19. Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion. Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تنشيط سطح PTFEنفثالينيد الصوديومزراعة خلايا HUVECاقتران ببتيد REDVمطيافية الأشعة تحت الحمراءالمجهر الإلكتروني الماسحالتصاق الخلايا البطانيةتعديل بولي تيترا فلورو إيثيلينمعالجة الكيمياء الرطبة
الرطب الكيمياء والببتيد الشلل على تترافلوروإيثيلين لتحسين خلية التصاق
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.