مقالة منهجية

بروتوكول التحويل المباشر من الفئران الجنينية الخلايا الليفية إلى الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية

DOI:

10.3791/54277

⸱

يوليو 25, 2016

 , 
1Department of Developmental Pathology, Institute of Pathology, University of Bonn Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا للتحويل المباشر للأرومات الليفية الجنينية الفئران إلى خلايا جذعية للأرومة الغاذية تعمل بكامل طاقتها ومستقرة عن طريق الإفراط في التعبير لمدة عشرة أيام عن Tfap2c و Gata3 و Eomes و Ets2.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا الأرومة الغاذية الجذعية (TSCS) النافذة تنشأ نتيجة للأول قرار مصير خلية في التنمية الثدييات. أنها يمكن تربيتها في المختبر، والإبقاء على القدرة على وعلى التمايز إلى جميع أنواع فرعية من سلالة الأرومة الغاذية، أي ما يعادل في الجسم الحي الجذعية السكان الخلية مما أدى إلى الجزء الجنين من المشيمة تجديد الذات. لذلك، TSCs تقدم نموذجا فريدا لدراسة تطور المشيمة والجنينية مقابل خارج الجنينية قرار مصير الخلايا في المختبر. من مرحلة الكيسة الأريمية فصاعدا، حاجز جينية مميزة تتكون من الحامض النووي وهيستون التعديلات يفصل بإحكام على حد سواء الأنساب. هنا، نحن تصف بروتوكول للتغلب على هذا الحاجز بشكل كامل النسب التي كتبها عابر الإفراط في التعبير من الأرومة الغاذية المنظمين الرئيسيين Tfap2c، Gata3، Eomes وEts2 في الخلايا الليفية الجنينية في الفئران. الخلايا الجذعية المستحثة الأرومة الغاذية قادرة على تجديد الذات وتكاد تكون متطابقة إلى الكيسة المستمدة خلايا الأرومة الغاذية الجذعية طحيث ن من التشكل، التعبير الجيني علامة ونمط مثيلة. وظيفية في المختبر، وفي المقايسات فيفو تأكيد أن هذه الخلايا قادرة على التفريق على طول نسب الأرومة الغاذية توليد الخلايا العملاقة الأرومة الغاذية المتعددة الصبغيات وchimerizing المشيمة عند حقنه في الكيسات الأريمية. تحريض خلايا الأرومة الغاذية الجذعية من الأنسجة الجسمية يفتح آفاقا جديدة لدراسة الخصائص الجينية وجينية من هذه النسب من خارج الجنينية وتوفر إمكانية لتوليد خطوط الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية دون تدمير الجنين منها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الآونة الأخيرة، فقد كشفت دراسة مقارنة عدة طرق من الفأرة الخلايا الجذعية الجنينية إلى الأرومة الغاذية تحويل الخلايا الجذعية التي في جميع الأنظمة تحليلها، ظل تحويل النسب غير مكتملة. بدلا من خلايا الأرومة الغاذية الجذعية المستحثة (iTSCs) يسمى الأرومة الغاذية الجذعية تم إنشاء خلايا تشبه الخلايا الإبقاء على ذكرى مصير خلية من أصل 1. هنا، نحن اتباع نهج مختلف من جيل ITSC. على غرار تحريض مباشر من الخلايا الجذعية المحفزة من الخلايا الليفية الجنينية الفئران (MEFS) 2، iTSCs تم تحويلها مباشرة من الأنسجة الجسمية متباينة. أولا، حددنا 12 عاملا مرشح حمل TSC مصير عندما overexpressed في MEFS. في وقت لاحق، وقد تم تحديد العوامل Tfap2c، Gata3، Eomes وEts2 ضرورية وكافية لتحريض ITSC 3. في وقت واحد، ومجموعة أخرى وجدت بشكل مستقل Tfap2c، Gata3 وEomes أن تكون كافية لتحويل MEFS إلى iTSCs. ومع ذلك، في هذاالدراسة، والوقت المطلوب للتعبير التحوير وقتا أطول بكثير مقارنة دراستنا، مشيرا إلى حركية تحويل مختلفة، عندما Ets2 غائبة عن transdifferentiation كوكتيل 4.

التقليدية مصل بقري جنيني (FBS) التي تحتوي على ثقافة الكيسة الخلايا الجذعية المشتقة الأرومة الغاذية التي يسببها وتعتمد على وجود عوامل التي يفرزها MEFS المعطل نمو 5،6. خلال تحريض ITSC، يتم توفير هذه العوامل التي MEFS، التي تفتقر إلى مجموعة كاملة من الجينات المحورة ولا يخضعون transdifferentiation. ومع ذلك، المستعمرات ITSC مرة واحدة الفردية هي شبه مثقف، فإنها تتطلب وسائل الإعلام، والتي تم شروطا مسبقة قبل MEFS المعطل النمو. من هناك على، يمكن iTSCs يكون مثقف وتعامل مثل الكيسة المستمدة TSCs وفقا لبروتوكولات موحدة. وتجدر الإشارة، على النقيض من تاناكا وآخرون. 5، ونحن بشكل روتيني ثقافة TSCs وiTSCs دون الهيلمة أطباق زراعة الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت التجارب على الماوس وفقا للقانون الألماني لحماية الحيوان وبالاتفاق مع موافقة من لجان رعاية الحيوان المؤسسي المحلي (Landesamt الامناء الناطور، UMWELT اوند Verbraucherschutz، شمال الراين وستفاليا [رقم الموافقة: AZ 84-02.04.2013 .A428]).

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. إعداد 293T المتوسطة: Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM)، 10٪ (ت / ت) FBS، L-الجلوتامين (2 ملم)، البيروفات الصوديوم (1 ملم)، البنسلين / الستربتومايسين (1X).
  2. إعداد المتوسطة MEF: DMEM، و 10٪ (ت / ت) FBS، L-الجلوتامين (2 ملم)، والأحماض الأمينية غير الأساسية 1X والبنسلين / الستربتومايسين (1X).
  3. إعداد TS المتوسطة (ث / س FGF4 / الهيبارين): معهد الحديقة التذكارية روزويل المتوسطة (RPMI) 1640، 20٪ (ت / ت) FBS (الخلايا الجذعية الثقافة الصف)، البنسلين / الستربتومايسين (1X)، L-الجلوتامين (2 مم )، البيروفات الصوديوم (1 ملم)، 2-المركابتويثانول (0.1 ملم).
  4. إعداد TS المتوسطة مع FGF4 / الهيبارين (TS + F4H): RPMI 1640، 20٪ (ت / ت) FBS (الخلايا الجذعيةثقافة الصف)، البنسلين / الستربتومايسين (1X)، L-الجلوتامين (2 ملم)، البيروفات الصوديوم (1 ملم)، 2-المركابتويثانول (0.1 ملم)، 25 نانوغرام / مل FGF4، 1 ميكروغرام / مل الهيبارين.
    وأضاف FGF4 والهيبارين مباشرة إلى وسائل الإعلام مباشرة قبل الاستعمال: ملاحظة.
  5. إعداد TS-CM مع FGF4 / الهيبارين (TS-CM + F4H): 70٪ مكيفة MEF TS المتوسطة + 30٪ الطازجة TS المتوسطة + 25 نانوغرام / مل FGF4، 1 ميكروغرام / مل الهيبارين.
    وأضاف FGF4 والهيبارين مباشرة إلى وسائل الإعلام مباشرة قبل الاستعمال: ملاحظة.
  6. إعداد ترنسفكأيشن المتوسطة متقدم DMEM، 2٪ (ت / ت) FBS (الخلايا الجذعية الثقافة الصف)، L-الجلوتامين (2 ملم)، البنسلين / الستربتومايسين (1X).
  7. إعداد المتوسطة إنتاج الفيروسات: المتقدم DMEM، 5٪ (ت / ت) FBS (الخلايا الجذعية الثقافة الصف)، L-الجلوتامين (2 ملم)، البنسلين / الستربتومايسين (1X).

2. الفئران الجنينية الخلايا الليفية اشتقاق

  1. مجموعة التزاوج توقيت باستخدام وزن 129S2SV الإناث والذكور متماثل الفئران R26 :: rtTA (اسم السلالة، B6.Cg-GT (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA* M2) جاي / J 7). على الفئران التضحية E13.5 خلع عنق الرحم وعزل الخلايا الليفية الأولية الفئران الجنينية (MEFS) وفقا لبروتوكولات موحدة 8. بعد ذلك، وخلايا لوحة من جنين واحد على طبق 150 ملم في وسائل الإعلام MEF.
  2. مرة واحدة الثقافات MEF الأولية تصل confluency على أطباق 150 مم، وغسل خلايا مرتين مع 10 مل برنامج تلفزيوني وإضافة 4 مل 0.05٪ حل التربسين / EDTA. احتضان الأطباق ل3-4 دقيقة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  3. بعد دخول الحضانة إذا خلايا منفصلة من الطبق باستخدام مجهر مقلوب (باستخدام عدسة 10X). إضافة 5 مل من وسائل الاعلام MEF لوقف trypsinization وجمع تعليق خلية في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  4. تعليق خلية تجمع من عدة أطباق وجمع إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 x ج و 10 درجة مئوية.
  5. تجاهل طاف والخلايا بيليه resuspend في FBS تحتوي على 10٪ (ت / ت) سلفوكسيد ثنائي ميثيل. تجميد MEFS في قسامات لاستخدامها مرة أخرى.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم الطرق والجسور البريةMEFS الأساسي الإلكترونية؛ ومع ذلك، ناقلات lentiviral إضافي معربا عن rtTA يحتاج إلى transduced مع ناقلات lentiviral الأخرى (على سبيل المثال استخدام البلازميد FUdeltaGW-rtTA التي وصفها Maherali وآخرون. 9).
  6. إعداد المتوسطة TS MEF مكيفة
    ملاحظة: قبل التجارب التحويل، لابد من إعداد MEF مكيفة (CM) TS وسائل الإعلام، وهو مطلوب للثقافة فرعية من خطوط ITSC الفردية (كما هو موضح في القسم 6).
    1. لوحة 1 × 10 7 MEFS المعطل ميتوتيكلي في 150 طبق ملم في المتوسط ​​MEF على العدد المرغوب فيه من الأطباق. تعطيل MEFS التي كتبها جاما-التشعيع مع جرعة من 9 غراي.
      ملاحظة: العائد لكل 150 طبق مم حوالي 60 مل من CM.
    2. في اليوم التالي والطلاء، ونضح وتجاهل المتوسطة MEF وإضافة 20 مل الطازجة TS المتوسطة (بدون FGF4 / الهيبارين) على كل طبق من ميتوتيكلي MEFS وأطباق مكان المعطل العودة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
    3. بعد تفرخTS المتوسطة لمدة ثلاثة أيام على MEFS المعطل ميتوتيكلي، وجمع المتوسطة في أنابيب مخروطية 50 مل. تصفية المتوسطة من خلال مرشح 0.2 ميكرون، والمضي قدما 2.6.4. استبدال سم مع 20 مل من المتوسط ​​TS جديدة لإعداد دفعة إضافية من سم.
      ملاحظة: ميتوتيكلي يمكن استخدامها MEFS المعطل لإعداد CM تصل إلى ثلاثة أضعاف.
    4. قسامة 35 مل من CM تصفيتها إلى 50 مل أنابيب مخروطية ومخزن في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. بعد ذوبان الجليد، إضافة 15 مل من المتوسط ​​TS الطازجة من أجل الحصول على 70٪ TS-CM وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.

3. Lentiviral ناقلات الإنتاج في خلايا 293T

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات في الفضاء مختبر مرخص له السلامة الأحيائية المستوى 2.

  1. قبل التجارب التحويل، إعداد ناقلات lentiviral لالدوكسيسيكلين (دوكس) التي تعتمد على أكثر من التعبير عن Tfap2c، Gata3، Eomes، Ets2 وmCherry. لكل الفيروسة البطيئة، وخلايا 293T شارك في transfect باستخداممنها ناقلات نقل lentiviral جنبا إلى جنب مع البلازميد التعبئة والتغليف وVSV-G تعبير عن الظرف البلازميد (للعلم البلازميد الرجوع إلى الجدول المواد).
    ملاحظة: للحصول على معلومات مفيدة حول إنتاج فيروس الرجوع إلى غافريلسكو وآخرون 10. على الرغم من أنه يصف إنتاج الفيروس الارتجاعي، التعليقات العامة بشأن نوعية الخلايا 293T وDNA البلازميد صحيحة لإنتاج الفيروسة البطيئة كذلك.
    تنبيه: يجب أن تؤخذ تدابير السلامة المناسبة عند التعامل مع ناقلات lentiviral والعمل لابد من القيام بها في منشأة السلامة الأحيائية المستوى 2.
  2. معطف خمسة 100 أطباق ملم مع بولي-L-ليسين (100 ميكروغرام / مل) حل من خلال تغطية الأطباق مع 5 مل من محلول وبلطف هزاز لتوزيعها بالتساوي حل الطلاء. وضع الأطباق مرة أخرى في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة الحل نضح الطلاء وشطف الأطباق مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  3. لوحة 7 × 10 6 293T خلايا في طبق في 10 مل سائل الإعلام 293T خلية، قأطباق wirl لتوزيع بالتساوي الخلايا وأطباق مكان مرة أخرى في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  4. في صباح اليوم التالي، تحل محل متوسط ​​النمو مع 5 مل من المتوسط ​​ترنسفكأيشن. إضافة 6 ميكرولتر من الأسهم 1،000x من حل الكلوروكين (25 ملم) وأطباق مكان مرة أخرى في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  5. وفي الوقت نفسه، وإعداد خليط ترنسفكأيشن:
    1. لكل ناقلات lentiviral إعداد اثنين من 5 مل أنابيب رد فعل، وصفت A و B.
    2. إضافة 600 ميكرولتر من 2X HEPES مخزنة المالحة (HBS) لأنبوب أ.
    3. في مزيج أنبوب ب 61.5 ميكرولتر CaCl 2 الحل (2 م)، مع 18.5 ميكروغرام الحمض النووي lentivector و9.25 ميكروغرام psPAX2 و9.25 ميكروغرام من pMD2.G. ضبط مستوى الصوت إلى 600 ميكرولتر مع ثقافة عقيمة الصف H 2 O.
    4. إضافة حل من أنبوب B قطرة من الحكمة لأنبوب وبينما vortexing ل. احتضان خليط ترنسفكأيشن لمدة 15 دقيقة في RT.
  6. إضافة خليط ترنسفكأيشن بعناية فائقة قطرة من الحكمة أن الخلايا 293T مستعدة على طبق 100 ملم. اfter 5-6 ساعة إزالة المتوسطة واستبدالها مع 10 مل من متوسطة إنتاج الفيروس. وضع الأطباق مرة أخرى في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: كن حذرا عند إزالة واستبدال المتوسطة منذ خلايا 293T تنفصل بسهولة من الطبق. متوسط ​​التغير 5-6 ساعة بعد ترنسفكأيشن أمر بالغ الأهمية، لأن التعرض لفترات طويلة للالكلوروكين غير سامة للخلايا.
  7. في صباح اليوم التالي، وإزالة بعناية وتجاهل المتوسطة واستبدالها مع 7 مل من متوسطة إنتاج الفيروس.
  8. في صباح اليوم التالي حصاد الدفعة الأولى من المتوسطة التي تحتوي على الفيروس. نضح المتوسط ​​وجمع في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. مرة أخرى، إضافة 7 مل من متوسطة إنتاج الفيروس في الخلايا. مخزن الفيروس تحتوي على المتوسط ​​في الثلاجة حتى يتم حصاد الدفعة الثانية في اليوم التالي.
  9. في صباح اليوم التالي نضح الدفعة الثانية من متوسطة تحتوي على فيروس إضافته إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على الدفعة الأولى. ويمكن الآن خلايا 293T يتم التخلص منها. تصفية الفيروسات التي تحتوي على المتوسطة من خلال سور 0.45 ميكرونخالية من factant خلات السليلوز فلتر -membrane. قسامة تصفيتها والمتوسطة ومخزن في -80 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى تحتوي على الفيروس.
    ملاحظة: يمكن أيضا إنتاج الفيروسات أن يؤديها في أطباق 6 جيدا. تقليص كميات وأعداد الخلايا وفقا لذلك.

4. الخلايا الليفية تنبيغ مع 4 العوامل وmCherry مكافحة ناقلات الأمراض

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات في منشأة السلامة الأحيائية المستوى 2.

  1. للحصول على تمثيل التخطيطي للمخطط تجريبي الرجوع إلى الشكل 1. أذاب قسامة واحدة من الأساسي rtTA-MEFS ولوحة 3.33 × 10 5 خلايا لكل بئر من صحن 6-جيدا في إجمالي حجم 2 مل من وسائل الاعلام MEF. إعداد لا يقل عن 3 آبار وتسمية لهم مع 4 عوامل (4F)، mCherry والسيطرة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، MEFS النوع البري يمكن استخدامها، وعندما يضاف إلى rtTA معربا عن ناقلات lentiviral إلى كوكتيل lentivector خلال خطوة 4.2.
  2. في اليوم التالي بعد خلايا تعافى تماما من cryopreservation، تحل محل وسائل الإعلام MEF في ثلاثة 6 آبار مع 0.6 مل (4F)، 0.9 مل (mCherry) و 1 مل (السيطرة) من وسائل الإعلام تنبيغ، على التوالي. ذوبان الجليد قسامة واحدة من PLV-تيتو-Tfap2c، -Gata3، -Eomes، -Ets وفيروس -mCherry في RT وإضافة 100 ميكرولتر من كل طاف التي تحتوي على فيروس (Tfap2c، Gata3، Eomes، Ets2) في 4F جيدا.
    ملاحظة: في حالة MEFS النوع البري، والحد من حجم وسائل الاعلام preplated 100 ميكرولتر وبالإضافة إلى إضافة 100 ميكرولتر من فيروس FUdeltaGW-rtTA تحتوي على طاف لمزيج 4F.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من mCherry وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس إلى وصفت بشكل جيد مع mCherry. إضافة polybrene إلى تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / مل في كل بئر. وضع الطبق مرة أخرى في حاضنة عند 37 درجة مئوية، واحتضان MEFS O / N مع طاف التي تحتوي على الفيروس.
    ملاحظة: في حالة MEFS النوع البري، والحد من حجم وسائل الاعلام preplated 100 ميكرولتر وبالإضافة إلى إضافة 100 ميكرولتر من FUdeltaGW-rtTA طاف التي تحتوي على الفيروس.
  4. في صباح اليوم التالي، وإزالة بعنايةوسائل الإعلام التي تحتوي على فيروسات وغسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. أخيرا، إضافة 2 مل من وسائل الاعلام TS (بدون FGF4 / الهيبارين).
    ملاحظة: MEFS Transduced يمكن أن تستخدم إما مباشرة للتجارب الحث ITSC أو تجميدها لاستخدامها مرة أخرى.

5. الخلايا الليفية إلى تحويل ITSC

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات في الفضاء مختبر مرخص له السلامة الأحيائية المستوى 2.

  1. غسل MEFS transduced مرتين مع 2 مل برنامج تلفزيوني وبعد إضافة محلول 0.5 مل التربسين / EDTA احتضان لهم في الحاضنة لمدة 3-4 دقيقة. الاختيار تحت المجهر المقلوب للانفصال السليم للخلايا.
    1. تعطيل التربسين بإضافة 1 مل TS المتوسطة. نقل تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 × ز. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 2 مل TS المتوسطة. استخدام نموذج السيطرة untransduced لحساب الخلايا.
    2. لوحة 4F-MEFS، mCherry-MEFS والسيطرة MEFS untransduced كل في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5خلية لكل 100 ملم صحن زراعة الخلايا في 10 مل TS تحتوي المتوسطة 2 ميكروغرام / مل دوكس (TS المتوسطة + FGF4 / الهيبارين + دوكس).
    3. بدلا من ذلك، نفذ transdifferentiation على أطباق أصغر. لوحة 3.6 × 10 3 خلايا لكل سم 2 على المطلوب حجم الطبق، وحجم حجم وفقا لذلك.
  2. في اليوم التالي، وذلك باستخدام المجهر epifluorescence (باستخدام عدسة 10X ومرشح مناسب لإثارة مضان الحمراء) مراقبة التعبير عن بروتين mCherry من أجل تقدير كفاءة ترنسدوكأيشن.
    ملاحظة: يجب أن تكون الكفاءة تنبيغ ما يقرب من 100٪. إذا زاد موت الخلايا غير واضح بعد تحريض التحوير وهذا يعني أن عيار الفيروس كان مرتفعا جدا. يجب أن تتكرر تنبيغ مع انخفاض كمية متوسطة تحتوي على الفيروس.
  3. من الآن على وسائل الإعلام التغيير على كافة الأطباق كل يوم حتى يوم 10 بعد الطلاء. بعد ذلك، تغذية الخلايا مع TS المتوسطة دون دوكس (TS المتوسطة + FGF4 / الهيبارين).
  4. باستخدام جهاز المجهر المقلوب لظهور "transdifferentiated المناطق" (راجع الشكل 2B و C) على طبق 4F لمدة تصل إلى 3 أسابيع. وينبغي لهذه المستعمرات لا تكون مرئية على أطباق السيطرة اثنين (mCherry-MEFS وMEFS untransduced).

6. عزل خطوط ITSC الفردية

ملاحظة: للحصول على خطوة 6.3 غير مطلوب نسيج الثقافة هود. فمن المستحسن أن يمسح أسفل المجهر المقلوب مع 70٪ من الإيثانول لتقليل فرص التلوث الجرثومي. المستعمرات ITSC الفردية يمكن أن تكون معزولة بين أيام 21 و 28 يوما من transdifferentiation.

  1. إضافة 40 ميكرولتر من 0.05٪ حل التربسين / EDTA إلى 12 بئرا من طبق بشكل جيد 96 U-القاع، ووضع الطبق على الجليد.
  2. قبل عزل مستعمرة والمتوسطة نضح على 4F-MEF طبق transdifferentiation. غسل خلايا مرة واحدة مع 10 مل برنامج تلفزيوني. مرة أخرى، إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني وطبق مكان تحت مجهر مقلوب.
  3. باستخدام ماصة 100 ميكرولتر المقرر ان 40 ميكرولتر تنقشع المستعمرات الفردية، التي جircling لهم مع طرف ماصة والشفط مستعمرة العائمة. نقل الخلايا من مستعمرة واحدة كل في جانب واحد من استعداد طبق 96-جيدا. بعد اختيار مكان 12 المستعمرات طبق 96-جيدا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. فصل الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات وتعليق خلية نقل إلى بئر واحدة من طبق 24-جيدا مع 500 ميكرولتر مستعدة للTS-CM المتوسطة (30٪ جديد TS المتوسطة + 70٪ سم + FGF4 / الهيبارين).
  5. في اليوم التالي محل المتوسطة مع الطازجة المتوسطة TS-CM لإزالة الخلايا الميتة. تغيير المتوسط ​​كل يوم.
  6. مراقبة لظهور مستعمرات الظهارية مع الحدود مشرق (انظر الشكل 2). بمجرد ظهور المستعمرات والثقافة حتى 70٪ متموجة أو لمدة تصل إلى واحد وتدريجيا التوسع في أطباق أكبر حجما. من الآن فصاعدا، وخلايا الثقافة باعتبارها حسن النية TSCs، وفقا لبروتوكولات موحدة في وسائل الإعلام المصل يحتوي أو في والإعلام خالية من المصل محددة 3،5،11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الطبق حيث يتم تنشيط التعبير التحوير من 4F، والخلايا بسرعة تغيير مورفولوجيا (قارن الشكل 2A وباء). حول يوم 14 - تنشأ 21 منطقة transdifferentiated مميزة (يتم إعطاء مثالين في الشكل 2B و C). هذه المستعمرات الأولية تفتقر TSC مورفولوجيا نموذجية. ولكن مرة واحدة هم دون مثقف، مورفولوجيا مميزة الظهارية مع حواف ضيقة وحدود مشرقة تذكرنا إلى حد كبير من TSCs الحسنة النية يظهر (الشكل 2D). 4F-iTSCs وصمة عار إيجا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

4 عامل (Tfap2c، Gata3، Eomes، Ets2) بروتوكول transdifferentiation مقرها المقدمة هنا يوفر طريقة يمكن الاعتماد عليها لتوليد بأمانة تحويلها iTSCs من الخلايا الليفية الماوس الجنينية. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة أيضا ينطبق على الخلايا الليفية الذيل بعد الولادة، على الرغم من انخفاض في كفاءة بالمقارنة مع الخلايا الليفية الجنينية 3. بشكل عام، ونوعية الخلايا الليفية الأساسية هي عامل حاسم في النتيجة transdifferentiation وينبغي الحرص على استخدام الخلايا مرور وقت مبكر (مرور 2-3...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دوكسيسيكلين هيكلاتسيجما-ألدريتشD9891-10Gيذوب في PBS معقم ، وقم بإعداد محلول مخزون 2 مجم / مل. تخزين الكميات عند -20 درجة ؛ ج
ملح ثنائي فوسفات الكلوروكين  Sigma-AldrichC6628-25Gقم بإعداد محلول مخزون 25 ملي مولار في ماء معقم لزراعة الخلايا. تخزين الكميات عند -20 درجة ؛ C
بوليبرين (سداسي ديميثرين بروميد)سيجما ألدريتش107689-10 جمتحضير محلول مخزون 8 مجم / مل في ماء معقم لزراعة الخلايا. تخزين الكميات عند -20 درجة ؛ C
عامل نمو الخلايا الليفية المؤتلف البشري 4ReliaTech300-131Lيذوب في معقم 0.1٪ BSA في PBS ، وإعداد 25 & micro ؛ جم / مل محلول الأسهم. تخزين الحصص عند -80 درجة ؛ C
ملح الصوديوم الهيبارينSigma-AldrichH3149-10KUتحضير محلول مخزون 1 مجم / مل عن طريق الذوبان في PBS معقم. تخزين الحصص عند -80 درجة ؛ C
نظام تعداء الثديياتProFection PromegaE1200
PBS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيومThermoFisher Scientific1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAXThermoFisher Scientific31966-021
RPMI 1640 ، بدون جلوتامينThermoFisher Scientific31870-025
Advanced DMEM (1x)ThermoFisher Scientific12491-015
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمرThermoFisher Scientific25300-054
Poly-L-lysineSigma-AldrichP4707
مصل الأبقار الجنينيHycloneSH30071.03IR
غشاء أسيتات السليلوز الخالي من الفاعل بالسطحCorning431220
الأحماضالأمينية غير الأساسيةThermoFisher Scientific11140-035
البنسلين ستربتومايسينThermoFisher Scientific15140-122
بيروفات الصوديوم  ThermoFisher Scientific11360-039
L-glutamine   ؛ThermoFisher Scientific25030-24
2-MercaptoethanolThermoFisher Scientific31350-010
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، درجة ثقافة الخلاياPanreac AppliChem GmbHA3672،0100
pLV-tetO-Tfap2cAddgene70269
pLV-tetO-Gata3Addgene70270
pLV-tetO-EomesAddgene70271
pLV-tetO-Ets2Addgene70272
pLV-tetO-mCherryAddgene70273
psPAX2Addgene12260
pMD2.GAddgene12259
FUdeltaGW-rtTA  Addgene19780
الفئران B6. CG-GT (ROSA) 26Sortm1 (rtTA * M2)Jae / J 7< / sup>JAX الفئران6965
129S2SVنهر تشارلز129
مرشح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538(2014).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
  4. Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
  5. Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
  6. Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
  7. Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
  8. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  9. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  10. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550(2007).
  11. Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Trophoblast Stem CellsMurine Embryonic FibroblastsDirect Cell ConversionLentiviral Vector TransfectionTfap2c Gata3 Eomes Ets2Induced Trophoblast Stem CellsPoly L lysine Coating293 T Cell TransfectionVirus Harvesting ProtocolColony Picking Technique

مقالات ذات صلة