Method Article

بروتوكول التحويل المباشر من الفئران الجنينية الخلايا الليفية إلى الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية

DOI:

10.3791/54277

⸱

July 25th, 2016

 , 
1Department of Developmental Pathology, Institute of Pathology, University of Bonn Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا للتحويل المباشر للأرومات الليفية الجنينية الفئران إلى خلايا جذعية للأرومة الغاذية تعمل بكامل طاقتها ومستقرة عن طريق الإفراط في التعبير لمدة عشرة أيام عن Tfap2c و Gata3 و Eomes و Ets2.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا الأرومة الغاذية الجذعية (TSCS) النافذة تنشأ نتيجة للأول قرار مصير خلية في التنمية الثدييات. أنها يمكن تربيتها في المختبر، والإبقاء على القدرة على وعلى التمايز إلى جميع أنواع فرعية من سلالة الأرومة الغاذية، أي ما يعادل في الجسم الحي الجذعية السكان الخلية مما أدى إلى الجزء الجنين من المشيمة تجديد الذات. لذلك، TSCs تقدم نموذجا فريدا لدراسة تطور المشيمة والجنينية مقابل خارج الجنينية قرار مصير الخلايا في المختبر. من مرحلة الكيسة الأريمية فصاعدا، حاجز جينية مميزة تتكون من الحامض النووي وهيستون التعديلات يفصل بإحكام على حد سواء الأنساب. هنا، نحن تصف بروتوكول للتغلب على هذا الحاجز بشكل كامل النسب التي كتبها عابر الإفراط في التعبير من الأرومة الغاذية المنظمين الرئيسيين Tfap2c، Gata3، Eomes وEts2 في الخلايا الليفية الجنينية في الفئران. الخلايا الجذعية المستحثة الأرومة الغاذية قادرة على تجديد الذات وتكاد تكون متطابقة إلى الكيسة المستمدة خلايا الأرومة الغاذية الجذعية طحيث ن من التشكل، التعبير الجيني علامة ونمط مثيلة. وظيفية في المختبر، وفي المقايسات فيفو تأكيد أن هذه الخلايا قادرة على التفريق على طول نسب الأرومة الغاذية توليد الخلايا العملاقة الأرومة الغاذية المتعددة الصبغيات وchimerizing المشيمة عند حقنه في الكيسات الأريمية. تحريض خلايا الأرومة الغاذية الجذعية من الأنسجة الجسمية يفتح آفاقا جديدة لدراسة الخصائص الجينية وجينية من هذه النسب من خارج الجنينية وتوفر إمكانية لتوليد خطوط الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية دون تدمير الجنين منها.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الآونة الأخيرة، فقد كشفت دراسة مقارنة عدة طرق من الفأرة الخلايا الجذعية الجنينية إلى الأرومة الغاذية تحويل الخلايا الجذعية التي في جميع الأنظمة تحليلها، ظل تحويل النسب غير مكتملة. بدلا من خلايا الأرومة الغاذية الجذعية المستحثة (iTSCs) يسمى الأرومة الغاذية الجذعية تم إنشاء خلايا تشبه الخلايا الإبقاء على ذكرى مصير خلية من أصل 1. هنا، نحن اتباع نهج مختلف من جيل ITSC. على غرار تحريض مباشر من الخلايا الجذعية المحفزة من الخلايا الليفية الجنينية الفئران (MEFS) 2، iTSCs تم تحويلها مباشرة من الأنسجة الجسمية متباينة. أولا، حددنا 12 عاملا مرشح حمل TSC مصير عندما overexpressed في MEFS. في وقت لاحق، وقد تم تحديد الع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت التجارب على الماوس وفقا للقانون الألماني لحماية الحيوان وبالاتفاق مع موافقة من لجان رعاية الحيوان المؤسسي المحلي (Landesamt الامناء الناطور، UMWELT اوند Verbraucherschutz، شمال الراين وستفاليا [رقم الموافقة: AZ 84-02.04.2013 .A428]).

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. إعداد 293T المتوسطة: Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM)، 10٪ (ت / ت) FBS، L-الجلوتامين (2 ملم)، البيروفات الصوديوم (1 ملم)، البنسلين / الستربتومايسين (1X).
  2. إعدا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الطبق حيث يتم تنشيط التعبير التحوير من 4F، والخلايا بسرعة تغيير مورفولوجيا (قارن الشكل 2A وباء). حول يوم 14 - تنشأ 21 منطقة transdifferentiated مميزة (يتم إعطاء مثالين في الشكل 2B و C). هذه المستعمرات الأولية تفتقر TSC مورفولوجيا نموذجية. ولكن مرة واحدة هم دون مثقف، مورفولوجيا مميزة الظهارية مع حواف ضيقة وحدود مشرقة تذكرنا إلى حد كبير من TSCs الحسنة النية يظهر (الشكل 2D). 4F-iTSCs وصمة عار إيجا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

4 عامل (Tfap2c، Gata3، Eomes، Ets2) بروتوكول transdifferentiation مقرها المقدمة هنا يوفر طريقة يمكن الاعتماد عليها لتوليد بأمانة تحويلها iTSCs من الخلايا الليفية الماوس الجنينية. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة أيضا ينطبق على الخلايا الليفية الذيل بعد الولادة، على الرغم من انخفاض في كفاءة بالمقارنة مع الخلايا الليفية الجنينية 3. بشكل عام، ونوعية الخلايا الليفية الأساسية هي عامل حاسم في النتيجة transdifferentiation وينبغي الحرص على استخدام الخلايا مرور وقت مبكر (مرور 2-3.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
دوكسيسيكلين هيكلاتسيجما-ألدريتشD9891-10Gيذوب في PBS معقم ، وقم بإعداد محلول مخزون 2 مجم / مل. تخزين الكميات عند -20 درجة ؛ ج
ملح ثنائي فوسفات الكلوروكين  Sigma-AldrichC6628-25Gقم بإعداد محلول مخزون 25 ملي مولار في ماء معقم لزراعة الخلايا. تخزين الكميات عند -20 درجة ؛ C
بوليبرين (سداسي ديميثرين بروميد)سيجما ألدريتش107689-10 جمتحضير محلول مخزون 8 مجم / مل في ماء معقم لزراعة الخلايا. تخزين الكميات عند -20 درجة ؛ C
عامل نمو الخلايا الليفية المؤتلف البشري 4ReliaTech300-131Lيذوب في معقم 0.1٪ BSA في PBS ، وإعداد 25 & micro ؛ جم / مل محلول الأسهم. تخزين الحصص عند -80 درجة ؛ C
ملح الصوديوم الهيبارينSigma-AldrichH3149-10KUتحضير محلول مخزون 1 مجم / مل عن طريق الذوبان في PBS معقم. تخزين الحصص عند -80 درجة ؛ C
نظام تعداء الثديياتProFection PromegaE1200
PBS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيومThermoFisher Scientific1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAXThermoFisher Scientific31966-021
RPMI 1640 ، بدون جلوتامينThermoFisher Scientific31870-025
Advanced DMEM (1x)ThermoFisher Scientific12491-015
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمرThermoFisher Scientific25300-054
Poly-L-lysineSigma-AldrichP4707
مصل الأبقار الجنينيHycloneSH30071.03IR
غشاء أسيتات السليلوز الخالي من الفاعل بالسطحCorning431220
الأحماضالأمينية غير الأساسيةThermoFisher Scientific11140-035
البنسلين ستربتومايسينThermoFisher Scientific15140-122
بيروفات الصوديوم  ThermoFisher Scientific11360-039
L-glutamine   ؛ThermoFisher Scientific25030-24
2-MercaptoethanolThermoFisher Scientific31350-010
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، درجة ثقافة الخلاياPanreac AppliChem GmbHA3672،0100
pLV-tetO-Tfap2cAddgene70269
pLV-tetO-Gata3Addgene70270
pLV-tetO-EomesAddgene70271
pLV-tetO-Ets2Addgene70272
pLV-tetO-mCherryAddgene70273
psPAX2Addgene12260
pMD2.GAddgene12259
FUdeltaGW-rtTA  Addgene19780
الفئران B6. CG-GT (ROSA) 26Sortm1 (rtTA * M2)Jae / J 7< / sup>JAX الفئران6965
129S2SVنهر تشارلز129
مرشح

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538(2014).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Trophoblast Stem CellsMurine Embryonic FibroblastsDirect Cell ConversionLentiviral Vector TransfectionTfap2c Gata3 Eomes Ets2Induced Trophoblast Stem CellsPoly L lysine Coating293 T Cell TransfectionVirus Harvesting ProtocolColony Picking Technique

Related Articles