نقدم هنا بروتوكولا للتحويل المباشر للأرومات الليفية الجنينية الفئران إلى خلايا جذعية للأرومة الغاذية تعمل بكامل طاقتها ومستقرة عن طريق الإفراط في التعبير لمدة عشرة أيام عن Tfap2c و Gata3 و Eomes و Ets2.
مقالة منهجية
نقدم هنا بروتوكولا للتحويل المباشر للأرومات الليفية الجنينية الفئران إلى خلايا جذعية للأرومة الغاذية تعمل بكامل طاقتها ومستقرة عن طريق الإفراط في التعبير لمدة عشرة أيام عن Tfap2c و Gata3 و Eomes و Ets2.
خلايا الأرومة الغاذية الجذعية (TSCS) النافذة تنشأ نتيجة للأول قرار مصير خلية في التنمية الثدييات. أنها يمكن تربيتها في المختبر، والإبقاء على القدرة على وعلى التمايز إلى جميع أنواع فرعية من سلالة الأرومة الغاذية، أي ما يعادل في الجسم الحي الجذعية السكان الخلية مما أدى إلى الجزء الجنين من المشيمة تجديد الذات. لذلك، TSCs تقدم نموذجا فريدا لدراسة تطور المشيمة والجنينية مقابل خارج الجنينية قرار مصير الخلايا في المختبر. من مرحلة الكيسة الأريمية فصاعدا، حاجز جينية مميزة تتكون من الحامض النووي وهيستون التعديلات يفصل بإحكام على حد سواء الأنساب. هنا، نحن تصف بروتوكول للتغلب على هذا الحاجز بشكل كامل النسب التي كتبها عابر الإفراط في التعبير من الأرومة الغاذية المنظمين الرئيسيين Tfap2c، Gata3، Eomes وEts2 في الخلايا الليفية الجنينية في الفئران. الخلايا الجذعية المستحثة الأرومة الغاذية قادرة على تجديد الذات وتكاد تكون متطابقة إلى الكيسة المستمدة خلايا الأرومة الغاذية الجذعية طحيث ن من التشكل، التعبير الجيني علامة ونمط مثيلة. وظيفية في المختبر، وفي المقايسات فيفو تأكيد أن هذه الخلايا قادرة على التفريق على طول نسب الأرومة الغاذية توليد الخلايا العملاقة الأرومة الغاذية المتعددة الصبغيات وchimerizing المشيمة عند حقنه في الكيسات الأريمية. تحريض خلايا الأرومة الغاذية الجذعية من الأنسجة الجسمية يفتح آفاقا جديدة لدراسة الخصائص الجينية وجينية من هذه النسب من خارج الجنينية وتوفر إمكانية لتوليد خطوط الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية دون تدمير الجنين منها.
في الآونة الأخيرة، فقد كشفت دراسة مقارنة عدة طرق من الفأرة الخلايا الجذعية الجنينية إلى الأرومة الغاذية تحويل الخلايا الجذعية التي في جميع الأنظمة تحليلها، ظل تحويل النسب غير مكتملة. بدلا من خلايا الأرومة الغاذية الجذعية المستحثة (iTSCs) يسمى الأرومة الغاذية الجذعية تم إنشاء خلايا تشبه الخلايا الإبقاء على ذكرى مصير خلية من أصل 1. هنا، نحن اتباع نهج مختلف من جيل ITSC. على غرار تحريض مباشر من الخلايا الجذعية المحفزة من الخلايا الليفية الجنينية الفئران (MEFS) 2، iTSCs تم تحويلها مباشرة من الأنسجة الجسمية متباينة. أولا، حددنا 12 عاملا مرشح حمل TSC مصير عندما overexpressed في MEFS. في وقت لاحق، وقد تم تحديد الع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وأجريت التجارب على الماوس وفقا للقانون الألماني لحماية الحيوان وبالاتفاق مع موافقة من لجان رعاية الحيوان المؤسسي المحلي (Landesamt الامناء الناطور، UMWELT اوند Verbraucherschutz، شمال الراين وستفاليا [رقم الموافقة: AZ 84-02.04.2013 .A428]).
1. إعداد وسائل الإعلام
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
على الطبق حيث يتم تنشيط التعبير التحوير من 4F، والخلايا بسرعة تغيير مورفولوجيا (قارن الشكل 2A وباء). حول يوم 14 - تنشأ 21 منطقة transdifferentiated مميزة (يتم إعطاء مثالين في الشكل 2B و C). هذه المستعمرات الأولية تفتقر TSC مورفولوجيا نموذجية. ولكن مرة واحدة هم دون مثقف، مورفولوجيا مميزة الظهارية مع حواف ضيقة وحدود مشرقة تذكرنا إلى حد كبير من TSCs الحسنة النية يظهر (الشكل 2D). 4F-iTSCs وصمة عار إيجا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
4 عامل (Tfap2c، Gata3، Eomes، Ets2) بروتوكول transdifferentiation مقرها المقدمة هنا يوفر طريقة يمكن الاعتماد عليها لتوليد بأمانة تحويلها iTSCs من الخلايا الليفية الماوس الجنينية. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة أيضا ينطبق على الخلايا الليفية الذيل بعد الولادة، على الرغم من انخفاض في كفاءة بالمقارنة مع الخلايا الليفية الجنينية 3. بشكل عام، ونوعية الخلايا الليفية الأساسية هي عامل حاسم في النتيجة transdifferentiation وينبغي الحرص على استخدام الخلايا مرور وقت مبكر (مرور 2-3.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| دوكسيسيكلين هيكلات | سيجما-ألدريتش | D9891-10G | يذوب في PBS معقم ، وقم بإعداد محلول مخزون 2 مجم / مل. تخزين الكميات عند -20 درجة ؛ ج |
| ملح ثنائي فوسفات الكلوروكين | Sigma-Aldrich | C6628-25G | قم بإعداد محلول مخزون 25 ملي مولار في ماء معقم لزراعة الخلايا. تخزين الكميات عند -20 درجة ؛ C |
| بوليبرين (سداسي ديميثرين بروميد) | سيجما ألدريتش | 107689-10 جم | تحضير محلول مخزون 8 مجم / مل في ماء معقم لزراعة الخلايا. تخزين الكميات عند -20 درجة ؛ C |
| عامل نمو الخلايا الليفية المؤتلف البشري 4 | ReliaTech | 300-131L | يذوب في معقم 0.1٪ BSA في PBS ، وإعداد 25 & micro ؛ جم / مل محلول الأسهم. تخزين الحصص عند -80 درجة ؛ C |
| ملح الصوديوم الهيبارين | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | تحضير محلول مخزون 1 مجم / مل عن طريق الذوبان في PBS معقم. تخزين الحصص عند -80 درجة ؛ C |
| نظام تعداء الثدييات | ProFection Promega | E1200 | |
| PBS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيوم | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640 ، بدون جلوتامين | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمر | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Hyclone | SH30071.03IR | |
| غشاء أسيتات السليلوز الخالي من الفاعل بالسطح | Corning | 431220 | |
| الأحماض | الأمينية غير الأساسيةThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| البنسلين ستربتومايسين | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| بيروفات الصوديوم | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine ؛ | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، درجة ثقافة الخلايا | Panreac AppliChem GmbH | A3672،0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| الفئران B6. CG-GT (ROSA) 26Sortm1 (rtTA * M2)Jae / J 7< / sup> | JAX الفئران | 6965 | |
| 129S2SV | نهر تشارلز | 129 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن