تم وصف والتحقق من صحة طريقة لإنشاء نموذج في المختبر للحاجز الدموي الدماغي بناء على ثقافة مشتركة للخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في دماغ الفئران والخلايا النجمية. أثبت هذا النظام أنه أداة صالحة لدراسة تأثير التركيبة النانوية على النفاذية عبر الحاجز لجزيئات الفلورسنت.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في المختبر تخلل من Ferritins تحميل FITC-عبر الفأر حاجز الدم في الدماغ: نموذج لدراسة تسليم Nanoformulated الجزيئات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ ، المدعومة بالخلايا الحضاقية والخلايا النجمية ، هي المسؤولة عن انخفاض النفاذية للأدوية الكبيرة القابلة للذوبان في الماء من خلال الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ، مما يسبب صعوبات في العلاجات الدوائية الفعالة. في السنوات الأخيرة ، تهدف الاستراتيجيات المختلفة لتعزيز استهداف الدماغ إلى تحسين توصيل الأدوية ونشاطها في هذا الموقع ، بما في ذلك الأنظمة النانوية المبتكرة لإيصال الأدوية عبر BBB. في هذا السياق ، يوفر النهج المختبري القائم على نموذج خلوي مبسط ل BBB أداة مفيدة للتحقيق في تأثير التركيبات النانوية على تغلغل الجزيئات عبر BBB. تصف هذه الدراسة تطوير BBB مزدوج الطبقة ، يتكون من الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في دماغ الفئران والخلايا النجمية المزروعة التجارية المتوفرة تجاريا. كما تم وصف نهج متعدد العوامل للتحقق من صحة النموذج ، بناء على قياس المقاومة الكهربائية عبر البطانة والنفاذية الظاهرة لديكستران عالي الوزن الجزيئي. كدليل على مفهوم استخدام نموذج BBB هذا لدراسة تأثير التركيبات النانوية المختلفة على انتقال جزيئات الفلورسنت عبر الحاجز ، نصف استخدام إيزوثيوسيانات الفلوريسين (FITC) ، المحملة في جزيئات الفيريتين النانوية. تم إثبات قدرة الفيريتين على تحسين النفاذية عبر BBB ل FITC من خلال قياسات التدفق وتحليلات الفحص المجهري متحد البؤر. تشير النتائج إلى أن هذا نظام مفيد للتحقق من صحة الأنظمة النانوية لتوصيل الأدوية عبر BBB.
المقدمة
المقاومة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) الأمراض (أي السرطان والصرع والاكتئاب وانفصام الشخصية وما يرتبط بها من فيروس نقص المناعة البشرية اضطراب عصبي) إلى العلاجات الدوائية ويرجع ذلك إلى آليات مختلفة مختلفة، بما في ذلك تخلل المخدرات شاقة عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) . بي بي بي هي الحدود التي تعزل أنسجة الدماغ من المواد في الدم. ضمن هذا الحاجز، وطبقة من خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البطانية (BMECs)، بدعم من pericytes وendfeet النجمية، هي المسؤولة عن الانتقائية العالية من BBB إلى تلك العقاقير ذواب بالماء ذات وزن جزيئي أعلى من 400 دا 1. يرتبط آلية أخرى مقاومة ذات الصلة بالمخدرات وجود على BMECs من الناقلين هروب رأس المال المخدرات (P-بروتين سكري والمقاومة للأدوية المتعددة البروتينات)، التي تتعاون للحد من انتشار المخدرات في الجهاز العصبي المركزي وتسهيل قذف بهم من الدماغ 2.
في العقد الماضيوقد تم وضع عدد كبير من نهج تقنية النانو لمواجهة التحدي السريرية والبيولوجية لإيصال المخدرات عبر BBB 3-6. في هذا السياق، nanospheres الفيرتين (FNN) تمثل حلا مبتكرا تماما واعد. FNN هي 12 نانومتر المجالات من 24 الفيريتين الذاتي تجميع (الجبهة الوطنية) أحادية، والتي يتم ترتيبها في هيكل كروي مجوف من 8 القطر الداخلي نانومتر. مفارز الفيرتين يمكن تفكيكها في درجة الحموضة الحمضية وتجميعها في شكل أزياء الذاكرة من خلال جلب الرقم الهيدروجيني إلى الحياد، والسماح مختلف الجزيئات العضوية إلى المغلفة. لذلك، FNN تمثل نموذجا للاهتمام لتطوير متعددة الوظائف تسليم المخدرات الأنظمة 7،8. وعلاوة على ذلك، قد FNN التفاعل مع BMECs بفضل الاعتراف معين من ترانسفيرين مستقبلات (معدل الخصوبة الاجمالي) 1، وهو ما يعبر عنه على الغشاء اللمعية من هذه الخلايا 9.
حتى الآن، وقد وضعت مختلف نماذج في المختبر من BBB في أورديr لتوضيح العابرة للBBB نفاذية لمختلف انواع المخدرات، سمية تجاه BBB، أو تفاعل الجزيئات مع الناقلين هروب رأس المال. في الواقع، تعتبر هذه النماذج صالحة في المختبر النهج لفحص السريع من الجزيئات النشطة قبل الشروع في الدراسات المجراة. وتتألف هذه النماذج من طبقة واحدة من البطانية BMECs أو المشارك مثقف BMECs والخلايا النجمية (أكثر نادرا pericytes)، تم الحصول عليها من الحيوانات (الجرذان والفئران والخنازير والأبقار) أو خطوط الخلايا البشرية 10،11،12. وTransEndothelial المقاومة الكهربائية (طير) والنفاذية واضحة (P التطبيق) من استشفاف مع الوزن الجزيئي محددة تمثل معلمتين الحرجة التي تستخدم لتحديد نوعية النموذج في المختبر. نحن هنا وصف العمل لفي المختبر نموذج BBB، استنادا إلى ثقافة مشتركة من الفئران BMECs (RBMECs) والفئران الخلايا النجمية القشرية (تقييمات النتائج والكفاءات) لدراسة تخلل العابر للBBB من قفص نانوي الفيرتين التغليف isothi فلوريسئينocyanate (FITC).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إنشاء نموذج BBB
ملاحظة: لإنشاء نموذج BBB نقترح استخدام RBMECs الأولية المتاحة تجاريا وتقييمات النتائج والكفاءات. يجب تنفيذ جميع الخطوات مع الكواشف والمستهلكات العقيمة، والتعامل معها في غطاء تدفق الصفحي.
- زراعة الخلايا
- معطف قوارير زراعة الخلايا مع بولي-L-ليسين 100 ميكروغرام / مل (1 ساعة على RT) أو فبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل (1 ساعة على 37 درجة مئوية) لتعزيز مرفق من تقييمات النتائج والكفاءات أو RBMECs، على التوالي. ثم، ذوبان الجليد 1 × 10 6 تقييمات النتائج والكفاءات و5 × 10 5 RBMECs في البطانية المتوسطة الخلية، على أن تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني، 1٪ تكملة نمو الخلايا البطانية و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (SECM). تقييمات النتائج والكفاءات البذور في قارورة T175 في 20 مل SECM وRBMECs في قارورة T75 في 10 مل SECM.
ملاحظة: يجب أن يتم تعديل ذوبان الجليد والممرات البذر من تقييمات النتائج والكفاءات وRBMECs، من حيث كثافة الخلايا والوقت في الثقافة، وفقا لعدد من الظروف التجريبية لفحصها مع النموذج BBB. قبل بدايةجي مع 1 قارورة من 1 × 10 6 تقييمات النتائج والكفاءات و1 قنينة من 5 × 10 5 RBMECs، فمن الممكن الحصول على ما يصل إلى 20 إدراج BBB الحاملة. - الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و CO 2 في الغلاف الجوي مرطب لحوالي 6 أيام 5٪ إلى حوالي 80٪ التقاء لتقييمات النتائج والكفاءات وأكثر من 90٪ التقاء لRBMECs. فصل الخلايا باستخدام حل التربسين-EDTA (التربسين 1: 250) لمدة 5 دقائق (1 مل التربسين لقوارير T75 و 2 مل لقوارير T175). وقف النشاط التربسين مع SECM (2: 1)، تعليق خلية الطرد المركزي في 750 × ز لمدة 5 دقائق و resuspend الكريات في 60 مل SECM.
- تقسيم RBMECs إلى 3 قوارير T175 والثقافة في SECM لمدة 3 أيام أخرى قبل البذر على إدراج. عد عدد من يعيشون تقييمات النتائج والكفاءات، من خلال مراقبة تعليق خلية المخفف 1: 1 مع الأزرق التريبان تحت المجهر الضوئي في غرفة Burker.
- معطف قوارير زراعة الخلايا مع بولي-L-ليسين 100 ميكروغرام / مل (1 ساعة على RT) أو فبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل (1 ساعة على 37 درجة مئوية) لتعزيز مرفق من تقييمات النتائج والكفاءات أو RBMECs، على التوالي. ثم، ذوبان الجليد 1 × 10 6 تقييمات النتائج والكفاءات و5 × 10 5 RBMECs في البطانية المتوسطة الخلية، على أن تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني، 1٪ تكملة نمو الخلايا البطانية و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (SECM). تقييمات النتائج والكفاءات البذور في قارورة T175 في 20 مل SECM وRBMECs في قارورة T75 في 10 مل SECM.
- البذر الخلية على إدراجات
- علاج جانب واحد من البولي إثيلين (PET) غشاء transpar 6 متعددة أيضاإدراج والأنف والحنجرة مع بولي-L-ليسين 100 ميكروغرام / مل وعلى الجانب الآخر مع فبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل، للسماح الحجز على تقييمات النتائج والكفاءات وBMECs. التعامل مع إدراج مع ملاقط من أجل تجنب الاتصال مع غشاء PET.
- وضع تدرج في لوحة 6 جيدا وإضافة محلول فبرونيكتين (الحد الأدنى 500 ميكرولتر) في مجلس الشيوخ. بعد 1 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، وإزالة حل فبرونيكتين، واتخاذ إدراج قبالة لوحة متعددة جيدا ووضعها رأسا على عقب على الجزء السفلي من 150 سم طبق 2 بيتري، والذي يستخدم هنا كدعم معقم لل المغلفة بالفعل إدراج.
- إضافة بلطف 800 ميكرولتر من بولي-L-يسين على الجانب السفلي من إدراج (كما هو موضح في الشكل 1A، يشار إلى تقييمات النتائج والكفاءات البذر)، والحفاظ على حل على إدراج لمدة 1 ساعة على RT.
- نضح الحل والسماح للإدراج الجافة في RT مدة 15-30 دقيقة. يدرج هي الآن جاهزة للزرع الخلايا، ولكن يمكن أيضا أن يتم تخزينها في لوحة متعددة جيدا لعدةأيام في 4 درجات مئوية، وذلك قبل الشروع في البناء BBB.
ملاحظة: تذكر أن تحافظ على الأقل 3 إدراج المغلفة خالية من الخلايا، لاستخدامها الضوابط للتحقق من صحة إنشاء BBB من قبل FD40 قياسات التدفق.
- تقييمات النتائج والكفاءات البذور (35000 / سم 2) على الجانب السفلي من إدراج المغلفة بولي-L-ليسين، من خلال إسقاط 800 ميكرولتر من تعليق على الخلية رأسا على عقب إدراج (الشكل 1A). ترك تعليق RCA على إدراج لمدة 4 ساعة على RT، من أجل السماح للمرفق كفاءة الخلايا لغشاء.
- نضح الحل المتبقية، ضع تدرج في الآبار التي تحتوي على 2 مل من SECM والحفاظ على لوحة متعددة جيدا عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ في جو مرطب، وتغيير SECM كل أيام 2.
- بعد 3 أيام، عندما المغلفة تقييمات النتائج والكفاءات الوجه السفلي للإدراج، RBMECs البذور على الجانب العلوي من إدراج، باتباع الخطوات التالية:
- فصل RBMECs من قوارير T175 وعدمجموع الخلايا الحية، كما ورد في خطوات 1.1.2 و 1.1.3.
- RBMECs البذور (60000 / سم 2) على السطح العلوي للإدراج في SECM (1000 ميكرولتر) (الشكل 1B)، وترك 3 إدراج مع الخلايا النجمية فقط، لاستخدامها طير الخلفية. وضع لوحة متعددة جيدا في ظروف ثقافة القياسية. الحفاظ على نظام للثقافة لمدة 3 أيام على الأقل، وتغيير SECM في الغرفة الداخلية وانخفاض كل أيام 2.
- علاج جانب واحد من البولي إثيلين (PET) غشاء transpar 6 متعددة أيضاإدراج والأنف والحنجرة مع بولي-L-ليسين 100 ميكروغرام / مل وعلى الجانب الآخر مع فبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل، للسماح الحجز على تقييمات النتائج والكفاءات وBMECs. التعامل مع إدراج مع ملاقط من أجل تجنب الاتصال مع غشاء PET.
2. التحقق من صحة BBB
- قياس طير
- في يوم 3 الثالثة وثقافة مشتركة، والتحقق من طير عن طريق إدراج إدراج BBB الحاملة الى غرفة المناسبة (التي لديها سقف واذا كان كل من غرفة وغطاء تحتوي على زوج من الجهد الاستشعار عن بعد والأقطاب الكهربائية الحالية)، مليئة 4 مل من SECM. اتصال الظهارية فولت الأنسجة / جهاز قياس المقاومة.
- جنبا إلى جنب مع القياسات طير الخلية BBB-أنظمة، تسجيل القيم طير من 3 إدراج تحمل تقييمات النتائج والكفاءات عشرفي سوف تطرح من القيم التي تم الحصول عليها مع BBBS. ضرب القيم طير الناجم عن سطح إدراج (4.2 سم 2) من أجل التعبير عن النتائج على النحو Ω س سم 2.
- من يوم 3 الثالثة وثقافة مشتركة، وقياس طير كل يوم. ملاحظة: بعد فترة أولية حيث يزيد من طير، وينبغي أن تظل القيم المسجلة مستقر لمدة سنتين على الأقل أيام متتالية (عادة ما بين ال 5 واليوم ال 7 من شارك في الثقافة). في هذه النقطة BBB مستعدة للخطوة الثانية من التحقق من صحة (القسم 2.2) و / أو التجارب العابرة للBBB.
ملاحظة: الإجراء هو موضح في القسم 2.1 لا يمكن أن يؤديها على نفس BBB-نظم المكرسة ل(القسم 3) التجارب نفاذية التالية. تعمل تحت ظروف معقمة.
- عبر BBB الجريان من FITC-ديكستران 40 (FD40)
- قياس تدفق FD40 من الأعلى إلى مجلس النواب من النماذج BBB مقارنة بما كان عليه في 3 إدراج فارغة(راجع الملاحظة من القسم 1.2.1) وفقا للخطوات التالية:
- إضافة 1 ملغ / مل FD40 (المخفف في SECM) في حجرة العليا من BBBS، وبعد 1 و 2 و 3 ساعة سحب 200 ميكرولتر SECM من مجلس النواب وقياس كثافة مضان من قبل spectrofluorimeter (λ السابق 488 نانومتر، λ م 515 نانومتر، شق 5).
- الحصول على قيم SECM خلفية fluorescenceby قياس 500 ميكرولتر من المتوسطة البكر باستخدام نفس المعايير التحليلية. طرح مضان الخلفية SECM من كل القيم مضان FD40.
- تحديد مقدار FD40 تعم من خلال المقارنة بين القيم مضان لوحظ مع منحنى المعايرة المنتجة مع تركيزات المعروفة (أي 0.312، 0.625، 1.25، 2.5 ميكروغرام / مل) من التتبع الفلورسنت المذاب في 500 ميكرولتر من SECM.
- حساب معامل نفاذية واضح (P التطبيق) من قيم التدفق يعني فقا لما يلي:
P التطبيق = J / AC
حيث J هو تدفق جزيء (الشامات / ثانية)، A هي مساحة تخلل (سم 2) وC هو تركيز جزيء في المقصورة العليا (الشامات / سم 3).
ملاحظة: ثلاثة أو أكثر من BBB-النظم التي وصلت قيم طير مناسبة، يجب أن يخصص حصرا لهذا الإجراء التحقق من صحة، وينبغي ألا تستخدم للتجارب نفاذية التالية (القسم 3). العقم ليس إلزاميا.
- قياس تدفق FD40 من الأعلى إلى مجلس النواب من النماذج BBB مقارنة بما كان عليه في 3 إدراج فارغة(راجع الملاحظة من القسم 1.2.1) وفقا للخطوات التالية:
3. تخلل من Ferritins تحميل FITC (FNN) عبر BBB
ملاحظة: البديل المؤتلف من الفيريتين الإنسان (الجبهة الوطنية)، التي تنتج في القولونية وتجميعها في قفص نانوي (FNN) لتغليف جزيئات الفلورسنت مختلفة، متاح من NanoBioLab الأستاذ بروسبيري (جامعة ميلانو بيكوكا، إيطاليا). يتم تحميل FNN مع FITC، وفقا لبروتوكول سبق وصفها 13 و تركيزات كل من الجبهة الوطنية والجزيئات تحميل وdetermin بدقةأد.
- عبر BBB الجريان من FITC وFITC-FNN
- قياس تدفق FITC-FNN من الأعلى إلى مجلس النواب من نماذج BBB التحقق من صحة (عادة في 5 تشرين - يوم ال 7 من شارك في ثقافة)، مقارنة بما كان عليه الصبغة حرة بعد 7 و 24 ساعة من الحضانة، وفقا ل الخطوات التالية:
- إضافة FITC-FNN (50 ميكروغرام / مل FNN، 1.1 ميكرومتر FITC) أو مبلغا مساويا لحرية FITC في مجلس الشيوخ لا يقل عن 6 أنظمة BBB لكل صياغة، من أجل سحب 2 مل من محلول SECM من مجلس النواب من على الأقل 3 إدراج بعد 7 ساعات، ومن مجلس النواب من 3 إدراج أخرى بعد 24 ساعة.
- قياس كثافة مضان من 500 ميكرولتر من العينات التي تم جمعها spectrofluorimeter (λ السابق 488 نانومتر، λ م 515 نانومتر، شق 5).
- الحصول على مضان خلفية SECM عن طريق قياس 500 ميكرولتر من المتوسط باستخدام نفس المعايير التحليلية. طرح مضان الخلفية SECMمن كل القيم مضان FITC أو FITC-FNN.
- تحديد تركيز تعم FITC أو FITC-FNN بمقارنة القيم مضان الحصول عليها مع اثنين من منحنيات المعايرة المختلفة المنتجة مع تركيزات المعروفة (أي 6.87، 13.75، 27.5، 55 نانومتر) من الصبغة مجانا أو nanoformulated المذاب في 500 SECM ميكرولتر.
- قياس تدفق FITC-FNN من الأعلى إلى مجلس النواب من نماذج BBB التحقق من صحة (عادة في 5 تشرين - يوم ال 7 من شارك في ثقافة)، مقارنة بما كان عليه الصبغة حرة بعد 7 و 24 ساعة من الحضانة، وفقا ل الخطوات التالية:
- FITC-FNN التعريب في RBMECs
- إزالة SECM من الغرفة العليا من أنظمة BBB، وغسل إدراج مع برنامج تلفزيوني وإصلاح RBMECs على اثنين على الأقل إدراج لكل المجموعة التجريبية وذلك بإضافة 500 ميكرولتر بارافورمالدهيد (4٪ في الفوسفات عازلة المالحة PBS) في المقصورة العليا لل10 دقيقة في RT.
- غسل إدراج ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة امتصاص العرق المتبقي.
ملاحظة: من هذه النقطة، والعقم ليس من الضروري. - قطع قطع مناسبة للغشاء PET، والمضي قدما في immunodecoration من الخلايا وفقا للخطوات التالية:
- Permeabiليز RBMECs مع 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. إجراء خطوة حجب لمدة 1 ساعة على RT مع محلول يحتوي على 2٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، 2٪ مصل الماعز في برنامج تلفزيوني. احتضان هذه العينات مع مضاد للعامل فون ويل براند (VWF) في 1:20 التخفيف، لمدة 2 ساعة على RT.
- بعد غسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، وتعريض الخلايا لمدة 2 ساعة على RT لجيش صرب البوسنة 2٪ و 2٪ من محلول المصل الماعز يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية مناسبة في التخفيف 1: 300 وذلك للكشف عن مكافحة VWR، ودابي في 1: 1500 تخفيف للكشف نوى.
- تركيب قطع إدراج على الشرائح المجهر باستخدام تصاعد antifade حل (قطرة واحدة في إدراج جزء)، ثم أغلق عينة مع انزلاق الغطاء. تحليل بواسطة المجهر متحد البؤر باستخدام عدسة الغمر النفط في 40X التكبير، 1.5 التكبير و1،024 X 1024 بيكسل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
خلال إنشاء نموذج BBB، مرفق الخلية والنمو على إدراج يمكن رصدها باستخدام المجهر الخفيفة وذلك بفضل طبيعة شفافة من الأغشية PET. تقييمات النتائج والكفاءات، المصنف في مناطق ذات كثافة من 35،000 خلية / سم 2، ونعلق بكفاءة إلى الجانب السفلي من إدراج بعد 4 ساعات من الحضانة في RT (الشكل 2A) وتنمو لتغطية سطح الغشاء في 3 أيام، مع الأخذ في التشكل على شكل مغزلي (الشكل 2B). RBMECs المصنفة في مناطق ذات كثافة من 60،000 خلي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الأسلوب في المختبر الموصوفة هنا يمثل نهجا التحقق من المفيد دراسة تقديم العابر للBBB من جزيئات الفلورسنت على nanoformulation مع النانوية. هنا نستخدم FNN، وهو ما يمثل مرشح جيد لدراسة النبات من الجزيئات البضائع عبر BBB. يعتبر FNN وnanovector الذهب العابرة للBBB تسليم المخدرات / وكلاء لأن من المسلم به على وجه التحديد من قبل مستقبلات TfR1، وهو ما يعبر عنه على الغشاء اللمعية من BMECs وتتوسط امتصاص جسيمات متناهية الصغر باستخدام استيعاب مسار بوساطة مستقبلات. وعلاوة على ذلك، FNN ه...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
يقر المؤلفون ب Assessorato alla Sanità و Regione Lombardia ومستشفى ساكو (مشروع NanoMeDia) لتمويل البحوث.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
الخلايا أغشية
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| البطانية الوعائية الدقيقة في دماغ الفئران | Innoprot | P10308 | معزولة من أنسجة دماغ الفئران Sprague Dawley ، محفوظة بالتبريد عند الممر الأول وسلمت |
| الخلايا النجمية القشرية المجمدة ؛ | Innoprot | P10202 | معزولة من 2 أيام أنسجة دماغ الفئران, بالتبريد محفوظة في الممر الأول وتسليمها مجمدة. |
| مجموعة الخلايا البطانية المتوسطة | Innoprot | P60104 | ECM (500 مل) ومصل بوفين الجنين (25 مل) ، مكمل نمو الخلايا البطانية (5 مل) والبنسلين / الستربتومايسين (5 مل). دافئ في 37 درجة. C حمام مائي قبل الاستخدام والحماية من الضوء |
| Trypsin-EDTA بدون الفينول الأحمر | EuroClone | ECM0920D | دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام |
| الفلورسين إيزوثيوسيانات-ديكستران 40،000 | سيجما | FD40S | يحمي من الضوء |
| بارافورمالدهايد ؛ | سيجما | 158127 | التخفيف في الغطاء الكيميائي |
| Dulbecco's محلول ملحي عازل للفوسفات بدون Ca و Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton & nbsp ؛ X-100 | Sigma | T8787 | |
| ألبومين مصل الأبقار | سيجما | A7906 | |
| مصل الماعز | EuroClone | ECS0200D | |
| فأر أحادي النسيلة مضاد لفون ويلبراند فاكتور | داكو | M0616 | |
| AlexaFluor 546 الجسم المضاد المترافق ضد الفأر IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | يحمي من الضوء |
| DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | يحمي من الضوء |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | يمكن استخدام نفس المحلول عدة مرات |
| من البلازما البقرية & nbsp ؛ | يمكن استخدام نفس المحلول Sigma | F1141 | عدة مرات |
| إدراج البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) | فالكون | F3090 | البولي إيثيلين تيريفثاليت الشفافة (PET) ؛ مساحة السطح: 4.2 سم < سوب >2 < / سوب> حجم المسام 0.4 وميكرو ؛ م / مساحة السطح |
| قارورة T75 Primo TC قارورة | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC قارورة | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 الأنسجة الظهارية فولت / أومتر ؛ | World Precision Instruments ألمانيا | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP كأس | العالم للأدوات الدقيقة ألمانيا | ENDOHM-24SNAP | |
| مجهر ضوئي / مضان مع كاميرا | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo / ICC50 W Camera Module | مجهر مقلوب للخلايا الحية مع الكاميرا |
| مجهر متحد البؤر | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| مقياس الطيف الفلوري | جاسكو | FP-8000 |
المراجع
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3(2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140(2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278(2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
