Method Article

الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

DOI:

10.3791/54283

⸱

July 10th, 2016

 , 
1Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2Molecular Biology, Princeton University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المخطوطة تقنية القائم على الطباعة الحجرية الناعمة لهندسة صفائف موحدة للثلاثي الأبعاد (3D) الأنسجة الطلائية للهندسة المعرفة وتحيط بها المصفوفة خارج الخلية. هذا الأسلوب هو قابل للمجموعة واسعة من أنواع الخلايا والسياقات التجريبية ويسمح لفحص عالية الإنتاجية من مكررات متطابقة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنشأ بنية الأعضاء المتفرعة مثل الرئتين والكلى والغدد الثديية من خلال العملية التنموية للتشكل المتفرع ، والتي يتم تنظيمها بواسطة مجموعة متنوعة من الإشارات القابلة للذوبان والفيزيائية في البيئة المكروية. الموصوفة هنا هي طريقة تم إنشاؤها لدراسة عملية التشكل المتفرع عن طريق تكوين أنسجة ظهارية ثلاثية الأبعاد (3D) هندسيا ذات شكل وحجم محددين مدمجة بالكامل داخل مصفوفة خارج الخلية (ECM). تتيح هذه الطريقة تكوين مصفوفات من الأنسجة المتطابقة وتمكن من التحكم في مجموعة متنوعة من العوامل البيئية ، بما في ذلك هندسة الأنسجة والتباعد وتكوين ECM. يمكن أيضا دمج هذه الطريقة مع التقنيات المستخدمة على نطاق واسع مثل الفحص المجهري لقوة الجر (TFM) للحصول على مزيد من المعلومات حول التفاعلات بين الخلايا وECM المحيطة بها. يمكن استخدام البروتوكول للتحقيق في مجموعة متنوعة من عمليات الخلايا والأنسجة التي تتجاوز التشكل المتفرع ، بما في ذلك غزو السرطان.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطوير الأنسجة الظهارية تشعبت، والمعروفة باسم المتفرعة التشكل، وينظم من قبل، والعوامل البيئية المادية المستمدة من الخلية. في الغدة الثديية، المتفرعة التشكل هو عملية تكرارية من خلالها الموجهة الهجرة الخلية الجماعية تخلق بنية تشبه شجرة. الخطوة الأولى هي تشكيل برعم الأساسي من قنوات الحليب، تليها بدء فرع واستطالة 1،2. وبفعل غزو فروع في سدى المحيطة الإفراج النظامية من هرمونات الستيرويد في سن البلوغ. ثم بدء براعم ابتدائية جديدة من نهايات الفروع القائمة، وتستمر هذه العملية لإنشاء شجرة الظهارية 3. على الرغم من أن تم التعرف على العديد من الإشارات البيوكيميائية المهمة، فهم شامل لآليات الخلية البيولوجية التي توجه هذه ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد حلول

  1. لإعداد 5 ملغ / مل حل الأنسولين، يخفف من الأسهم الأنسولين مسحوق مع 5 ملم حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) في DH 2 O (500 ملغ الأنسولين في 100 مل المذيبات). إعداد 100 مل المذيبات وذلك بإضافة 50 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركز إلى 100 ​​مل من الماء المقطر (DH 2 O).
  2. لجعل 1X حل من برنامج تلفزيوني، وتمييع الحل الأسهم 10X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ل1x أخرى مع DH 2 O تحت ظروف معقمة.
  3. إعداد ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التخطيطي العام لالثديية التصنيع الدقيق الأنسجة الظهارية

ويرد التخطيطي العام لإجراء التصنيع الدقيق يحدد تدفق العمل التجريبي في الشكل 1. والنتيجة النهائية هي مجموعة من الأنسجة الطلائية للهندسة متطابقة والمباعدة بين الولادات التي هي جزء لا يتجزأ تماما داخل هلام ECM. تستخدم تجربة تمثيلية EpH4 الماوس الخلايا الظهارية الثديية مثقف في مادة هلامية من نوع .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد البروتوكول الموصوف أعلاه طريقة لإنتاج أنسجة ظهارية متطابقة ذات شكل محدد مسبقا ، مما يتيح التحكم المكاني في الإجهاد الميكانيكي الذي تتعرض له الخلايا في الأنسجة. يتم استخدام قالب مرن لإنشاء تجاويف في الكولاجين من النوع الأول يتم ملؤها بعد ذلك بالخلايا الظهارية وتغطيتها بطبقة كولاجين إضافية بحيث يتم تغليف الخلايا بالكامل في بيئة مصفوفة الكولاجين ثلاثية الأبعاد. إن زراعة هذه الأنسجة الإضافية وعلاجها بعوامل النمو للحث على التفرع من البنية الأولية تجعل هذا النظام قابلا لدراسة التشكل المتفرع للخلايا الظهارية. هناك العديد م.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (HL118532، HL120142، CA187692)، ومؤسسة ديفيد وولوسيل باكارد، وكميل ومؤسسة هنري دريفوس، وبوروز مرحبا صندوق. وأيد ASP في جزء من شارلوت إليزابيث بروكتر شرفية زمالة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS)المواد اللاصقة إلسورثسيلجارد 184
عامل علاجPDMS Ellsworth المواد اللاصقةسيلجارد 184
سيد السيليكون منقوش بالطباعة الحجريةعصاميN / A
قارب وزن بلاستيكيفيشر ساينتيك08-732-115
أطباق بتري بقطر 100 ممBioExpressD-2550-2
الكحول الإيثيلي 200 مقاومللفارمكو Aaper111000200اصنع محلول 70٪ EtOH (v: v) عن طريق الخلط مع dH2< / sub>O
شفرة الحلاقةالأمريكية للسلامة620179
1: 1 Dulbecco ' s النسر المعدل s وسط : لحم الخنزير s F12 خليط المغذيات (DMEM / F12) (1: 1)HycloneSH30023FS
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Atlanta BiologicalsS11150H
10x Hank ' s محلول ملح متوازن (HBSS)Life Technologies14185-052
الأنسولينSigma AldrichI6634-500MG
GentamicinLife Technologies15750-060
10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)فيشر ScientificBP399-500
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)سيجما ألدريتش221465-500 جرام
بقري النوع الأول من الكولاجين (غير البيبسين)KokenIAC-50
الألبومين من مصل الأبقار (BSA)Sigma AldrichA-7906
ملاقط منحنية من الفولاذ المقاوم للصدأDumont7
أطباق زراعة الأنسجة بقطر 35 ممBioExpressT-2881-6
أنابيب مخروطية 15 ملBioExpressC-3394-2
1.5 مل Eppendorf أنبوب القفل الآمنالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1615-5500
أغطية زجاجية دائرية # 1 ، قطرها 15 ممBellco Glass Inc.طلب
0.05٪ 1x Trypsin-EDTALife Technologies25300-054
ParaformaldehydeVWR100503-916
Triton X-100Perkin ElmerN9300260Detergent
HGFSigma AldrichH 9661معلق في dH2< / sub>O عند 50 مجم / مل
أرنب مضاد للجسم المضاد FAKالحياة تقنياتAMO0672
الماعز المضادة للأرانب Alexa 488 الأجسام المضادةLife TechnologiesA-11034
Adobe PhotoshopAdobeN / Aتستخدم لخرائط تردد البكسل للترميز اللوني.
FIJI (ImageJ)NIHN / Aبرنامج مجاني لتحليل الصور يستخدم لعتبة الصور وتسجيلها وتراكبها لإنشاء خريطة تردد بكسل. تم استخدام المكون الإضافي StackReg لتسجيل الصور الثنائية.
خاص

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
  2. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Epithelial TissuesBranching MorphogenesisExtracellular MatrixCollagen GelPDMS StampsTraction Force MicroscopyCell SeedingTissue GeometryHGF TreatmentFocal Adhesion Kinase

Related Articles