مقالة منهجية

الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

DOI:

10.3791/54283

⸱

يوليو 10, 2016

 , 
1Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2Molecular Biology, Princeton University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المخطوطة تقنية القائم على الطباعة الحجرية الناعمة لهندسة صفائف موحدة للثلاثي الأبعاد (3D) الأنسجة الطلائية للهندسة المعرفة وتحيط بها المصفوفة خارج الخلية. هذا الأسلوب هو قابل للمجموعة واسعة من أنواع الخلايا والسياقات التجريبية ويسمح لفحص عالية الإنتاجية من مكررات متطابقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنشأ بنية الأعضاء المتفرعة مثل الرئتين والكلى والغدد الثديية من خلال العملية التنموية للتشكل المتفرع ، والتي يتم تنظيمها بواسطة مجموعة متنوعة من الإشارات القابلة للذوبان والفيزيائية في البيئة المكروية. الموصوفة هنا هي طريقة تم إنشاؤها لدراسة عملية التشكل المتفرع عن طريق تكوين أنسجة ظهارية ثلاثية الأبعاد (3D) هندسيا ذات شكل وحجم محددين مدمجة بالكامل داخل مصفوفة خارج الخلية (ECM). تتيح هذه الطريقة تكوين مصفوفات من الأنسجة المتطابقة وتمكن من التحكم في مجموعة متنوعة من العوامل البيئية ، بما في ذلك هندسة الأنسجة والتباعد وتكوين ECM. يمكن أيضا دمج هذه الطريقة مع التقنيات المستخدمة على نطاق واسع مثل الفحص المجهري لقوة الجر (TFM) للحصول على مزيد من المعلومات حول التفاعلات بين الخلايا وECM المحيطة بها. يمكن استخدام البروتوكول للتحقيق في مجموعة متنوعة من عمليات الخلايا والأنسجة التي تتجاوز التشكل المتفرع ، بما في ذلك غزو السرطان.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطوير الأنسجة الظهارية تشعبت، والمعروفة باسم المتفرعة التشكل، وينظم من قبل، والعوامل البيئية المادية المستمدة من الخلية. في الغدة الثديية، المتفرعة التشكل هو عملية تكرارية من خلالها الموجهة الهجرة الخلية الجماعية تخلق بنية تشبه شجرة. الخطوة الأولى هي تشكيل برعم الأساسي من قنوات الحليب، تليها بدء فرع واستطالة 1،2. وبفعل غزو فروع في سدى المحيطة الإفراج النظامية من هرمونات الستيرويد في سن البلوغ. ثم بدء براعم ابتدائية جديدة من نهايات الفروع القائمة، وتستمر هذه العملية لإنشاء شجرة الظهارية 3. على الرغم من أن تم التعرف على العديد من الإشارات البيوكيميائية المهمة، فهم شامل لآليات الخلية البيولوجية التي توجه هذه العملية التنموية المعقدة تفتقر حاليا. وعلاوة على ذلك، دراسات الميكانيكية على تأثيرات منبهات معينة يصعب تفكيك من من experiالإدلاء بالبيانات في الجسم الحي، اضطرابات والقياسات الزمانية المكانية كما دقيقة وغالبا ما تكون غير ممكنة.

ثلاثي الأبعاد (3D) تقنيات زراعة، مثل ثقافة بأكملها الجهاز، organoids الابتدائي، ونماذج ثقافة الخلية، أدوات مفيدة للتحقيق منهجي الآليات الكامنة التشكل الأنسجة 4-6. هذه يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص لتحديد تأثيرات عوامل محددة بشكل فردي، مثل القوى الميكانيكية والإشارات البيوكيميائية، على مجموعة متنوعة من السلوكيات الخلية، بما في ذلك الهجرة، والانتشار، والتمايز. 6 المهندسة نماذج ثقافة الخلية، على وجه الخصوص، تمكن بسهولة اضطراب من الخلايا الفردية والمكروية بهم.

يستخدم نموذج واحد ثقافة هذا النهج القائم على التصنيع الدقيق لهندسة الأنسجة الظهارية الثديية نموذجية مع هيكل 3D للرقابة التي تشكل على الدوام وبتكاثر الفروع التي تهاجر بشكل جماعي عندما الناجم مع لعوامل النمو ppropriate. والميزة الرئيسية لهذا النموذج هو القدرة على التعامل بدقة وقياس آثار العوامل الفيزيائية والكيميائية الحيوية، مثل أنماط من إجهاد، مع الثقة إحصائية عالية. هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع النمذجة الحاسوبية، وقد تم بالفعل تستخدم لتحديد المساهمات النسبية للإشارات الجسدية والكيميائية الحيوية في توجيه التطور الطبيعي للأنسجة الظهارية الثديية وغيرها من ظهائر متفرعة 7-11. المقدمة هنا هو بروتوكول مفصلة لبناء هذه الأنسجة النموذج، والتي يمكن أن تمتد بسهولة إلى أنواع أخرى من الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) والمواد الهلامية، والتي هي بمثابة أداة محتملة لاختبار العلاجات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد حلول

  1. لإعداد 5 ملغ / مل حل الأنسولين، يخفف من الأسهم الأنسولين مسحوق مع 5 ملم حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) في DH 2 O (500 ملغ الأنسولين في 100 مل المذيبات). إعداد 100 مل المذيبات وذلك بإضافة 50 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركز إلى 100 ​​مل من الماء المقطر (DH 2 O).
  2. لجعل 1X حل من برنامج تلفزيوني، وتمييع الحل الأسهم 10X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ل1x أخرى مع DH 2 O تحت ظروف معقمة.
  3. إعداد ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) المطاط الصناعي الحل كما يلي: خلط prepolymer PDMS مع وكيل علاج في نسبة 10:: 1 (ث ث).
  4. إعداد خلية ثقافة المتوسط ​​على النحو التالي: 500 مل من الأسهم Dulbecco لتعديل النسر متوسطة: خليط المغذيات F-12 (DMEM / F-12)، إضافة 10 مل من معقم مصل بقري جنيني (FBS)، و 500 ميكرولتر من كاشف جنتاميسين، و 500 ميكرولتر من 5 ملغ / مل الانسولين.
  5. لإعداد 1٪ مصل بقري الزلال (BSA) في حل برنامج تلفزيوني 1X، إضافة 1٪ (ث: •) حل من مسحوق جيش صرب البوسنة 1X برنامج تلفزيوني وتخلط جيدا.
  6. لإعداد 4 ملغ / مل حل من نوع البقري تحييد أنا الكولاجين، إضافة 50 ميكرولتر 10X هانك في محلول ملحي متوازن (HBSS) العازلة، 30 ميكرولتر 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)، 30 ميكرولتر مستنبت الخلية، و 400 ميكرولتر من الكولاجين الأسهم إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge المبردة. مزيج ببطء عن طريق pipetting صعودا وهبوطا، تجنب إدخال فقاعات. لإزالة أي فقاعات، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الخليط في 4 درجات مئوية.
  7. يعد حل تثبيتي عن طريق تمييع 16٪ امتصاص العرق 1: 4 (ت: ت) في برنامج تلفزيوني 1X.
  8. يعد حل نوى وضع العلامات عن طريق تمييع نوى الأسهم العلامات الحل 1: 1000 (ت: ت) في برنامج تلفزيوني 1X.
  9. إعداد 0.3٪ الفوسفات مخزنة المالحة والمنظفات (PBST) حل عن طريق خلط برنامج تلفزيوني 1X مع 0.3٪ (ت: ت) المنظفات.
  10. إعداد عازلة تمنع عن طريق تمييع مصل الماعز 01:10 (ت: ت) في 0.3٪ PBST.
  11. يعد حل الأجسام المضادة الأولية لبروتين معين من الاهتمام عن طريق تمييع الحزب الثوري المؤسسيماري الأجسام المضادة (على سبيل المثال، أرنب المضادة للتنسيق التصاق كيناز (FAK)) 1: 200 (ت: ت) في عرقلة العازلة.
  12. يعد حل الضد الثانوية عن طريق تمييع الأجسام المضادة مسبار مترافق فلوري (على سبيل المثال، الماعز المضادة للأرنب) 1: 1000 (ت: ت) في عرقلة العازلة.

2. إعداد طوابع المرنة لMicropatterning 3D

ملاحظة: تتم الطوابع المرنة مع PDMS.

  1. جعل حل PDMS على نفس النسبة كما هو موضح في الخطوة 1.3 و تخلط جيدا. ضع الخليط في فراغ الغرفة ل15-30 دقيقة لإزالة أي فقاعات الهواء التي تم تقديمها خلال عملية الخلط.
  2. من أجل حل نزع الغاز في البلاستيك وزن القارب أو طبق بتري تحتوي على درجة الماجستير السيليكون الذي هو نمط lithographically مع ميزات للهندسة المطلوب. للحصول على أفضل النتائج، وعلاج حل PDMS على 60 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ~.
    ملاحظة: السيليكون سادة قابلة للتخصيص للغاية. يستخدم هذا البروتوكول الهياكل مستطيلة ذات أبعاد من 50متباعدة ميكرون × 200 ميكرون × 50 ميكرون 200 ميكرون بعيدا. ويمكن إجراء سادة السيليكون باستخدام تقنيات ضوئيه القياسية. لفترة وجيزة، وتدور المغلفة ومقاومة للضوء من الإيبوكسي على رأس رقاقة السيليكون. يتم وضع قناع تفاصيل ملامح الطوابع المطلوبة على أعلى الرقاقة المغلفة مقاومة للضوء، الذي هو ثم تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية. ويتعرض الميزات المطلوبة لا يعوقها قناع للضوء ومقاوم الضوء في هذه المواقع يصبح crosslinked، في حين أن ما تبقى من طلاء مقاوم الضوء قابل للذوبان ويمكن غسلها بعيدا.
  3. بعد الشفاء من PDMS حول السمات المرغوبة على سيد السيليكون، وإزالة PDMS والماجستير من وعاء من البلاستيك. بعناية فصل PDMS من رقاقة السيليكون وإزالة PDMS الزائدة من حول ميزات مطبوع باستخدام شفرة حلاقة نظيفة.
  4. الآن قطع PDMS منقوشة مع ميزات مطبوع في الطوابع مستطيلة الفردية (~ 8 مم × 5 ملم) بشفرة حلاقة. تخزين هذه الميزة على جانب المتابعة في شركة كليطبق بيتري 100 ملم القطر.
  5. بالإضافة إلى ذلك، استخدام حل PDMS هو موضح في الخطوة 1.3 لجعل الدعم للطوابع مستطيلة.
  6. باستخدام المغطي تدور، انتشرت ~ 2-3 غرام من حل PDMS بالتساوي على 100 ملم قطرها طبق بتري وعلاج PDMS ل~ 12 ساعة على 60 درجة مئوية كما في الخطوة 2.1. ثم، باستخدام شفرة حلاقة، وقطع طبقة رقيقة من PDMS إلى مستطيلات (~ 5 مم × 2 مم).
    ملاحظة: هناك حاجة لاثنين من الدعم لكل ختم PDMS في الخطوة 2.3. ويدعم يمكن تخزينها في 100 ملم قطرها طبق بتري الذي يحتوي على PDMS الطوابع.
  7. قبل الطوابع PDMS والدعم يمكن أن تستخدم لزراعة الخلايا، وتعقيم عن طريق الغمر في 70٪ من الإيثانول والجافة باستخدام الشافطة في خزانة السلامة البيولوجية (خلية ثقافة هود).

3. إعداد 3D طلائي الأنسجة

  1. في خزانة السلامة البيولوجية، إضافة قطرة من ما يقرب من 50 ميكرولتر من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني على رأس كل طابع. وضع قطرة مغطاة الطوابع في 4 درجة مئوية لمدة مصغرةأمي من 4 ساعات للتأكد من أن BSA تمتز على سطح الختم.
  2. حل نضح جيش صرب البوسنة من الطوابع PDMS.
  3. غسل الأسطح من الطوابع مرتين مع خلية ثقافة المتوسط ​​(50 ميكرولتر لكل يغسل في ختم ينبغي أن يكون كافيا)، الشفط بعد كل غسل.
  4. التعامل مع PDMS الطوابع والدعم تعقيمها باستخدام منحني ملاقط الفولاذ المقاوم للصدأ. في خزانة السلامة البيولوجية، وضع واحد 35 ملم قطرها طبق زراعة الأنسجة لكل PDMS الطوابع. في كل طبق، وضع اثنين PDMS الدعم مفصولة مسافة أقل قليلا من طول الطوابع PDMS.
  5. باستخدام الملقط، تعقيم العديد من coverslips الزجاج الدائرية (15 مم في القطر، رقم 1) كما أن هناك PDMS الطوابع باستخدام الايثانول 70٪. نضح السوائل الزائدة من لل coverslips في حين عقد لهم مع ملاقط. تخزين لل coverslips غسلها في 100 ملم قطرها طبق منفصل بيتري.
  6. الاستغناء ~ 50 ميكرولتر من مزيج الكولاجين لبالتساوي معطف سطح كل PDMS الطوابع.
  7. امسككل PDMS المغلفة الكولاجين ختم مع ملاقط وعكس لهم بلطف. خفض الطوابع مقلوب على أعلى PDMS يدعم المنصوص عليها في نسيج الثقافة 35 ملم قطرها زعته مثل أن الكولاجين هو بين الطابع والجزء السفلي من صحن زراعة الأنسجة. احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  8. الاستغناء ~ 50 ميكرولتر من مزيج الكولاجين المتبقية على كل لل coverslips دائرية (في وقت لاحق، سيتم وضع هذه على أعلى من الأنسجة المهندسة لتغليف تماما لهم في الكولاجين)، واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  9. الحصول على طبق زراعة الأنسجة 100 ملم القطر التي تحتوي على الخلايا الظهارية (على سبيل المثال. EpH4 الماوس الخلايا الظهارية الثديية) في ~ 40٪ confluency. نضح مستنبت الخلية ويغسل مرة واحدة مع 10 مل برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 2 مل من التربسين إلى الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
  10. إضافة 8 مل من مستنبت الطازجة إلى الطبق زراعة الأنسجة التي تحتوي على الخلايا trypsinized، فصل أي الخلايا الملتصقة المتبقية من الطبق. المزيج بلطف قبل pipetting ونقل خليط الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 5 دقائق.
  11. نضح طاف من أنبوب مخروطي الشكل و resuspend بيليه خلية في خلية ثقافة المتوسط. باستخدام عدادة الكريات، عد الخلايا لتحديد تركيز التعليق. ضبط حجم تعليق للحصول على التركيز النهائي من ~ 10 6 -10 7 خلية / مل.
  12. إزالة عينات الكولاجين تبلور من الحاضنة. باستخدام الملقط، ورفع بلطف PDMS الطوابع مباشرة صعودا إلى فصل لهم من الكولاجين مصبوب والتخلص منها.
  13. الاستغناء ~ 30 ميكرولتر من تعليق خلية تتركز على سطح كل هلام الكولاجين تحتوي على تجاويف مصبوب الهندسة المرجوة. مراقبة الخلايا تحت المجهر brightfield مع الهدف NA 10X / 0.25 بينما تهز بلطف الأطباق الجانبية إلى جنب لتعزيز خلية تسوية داخل تجاويف. يجب ملء تجاويف داخل ~ 5 دقائق.
  14. إلى remove الخلايا الزائدة من جميع أنحاء تسوس الأسنان، وإمالة كل طبق زراعة الأنسجة على جانبها والاستغناء بلطف ~ 400 ميكرولتر مستنبت الخلايا على سطح الهلام الكولاجين. نضح السائل وتكرار غسل 1-2 مرات أكثر، والتحقق من المواد الهلامية الكولاجين تحت المجهر بين كل غسل.
  15. بعد أن تم مسح الخلايا الزائدة من جميع أنحاء تجاويف مملوءة خلية في قالب الكولاجين، ووضع أطباق زراعة الأنسجة في حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم، وذلك باستخدام الملقط، عكس بلطف لل coverslips الطبقة المغلفة الكولاجين ووضعها على رأس قوالب الكولاجين مليئة الخلية بحيث الكولاجين من لل coverslips يشكل الغطاء على تجاويف مملوءة الخلية. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  16. مرة واحدة انضمت القبعات الكولاجين الكولاجين العفن مليئة الخلية، والاستغناء ~ 2-2.5 مل خلية مستنبت ببطء على مدى ساترة الزجاج على رأس المواد الهلامية. ثقافة العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 أيام.
    ملاحظة:24 ساعة بعد الغرس الأولي، والأنسجة الطلائية يمكن علاجها مع عوامل النمو مثل عامل نمو البشرة (EGF) أو عامل النمو الكبدية (HGF) للحث على المتفرعة.

4. المناعي وتحليل الصور

  1. نضح مستنبت الخلية من أطباق زراعة الأنسجة وإضافة ما يكفي من حل تثبيتي لتغطية المواد الهلامية التي تحتوي على الخلية. احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على شاكر في 200 دورة في الدقيقة.
  2. نضح تثبيتي، وملء أطباق زراعة الأنسجة مع برنامج تلفزيوني 1X، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على شاكر في 200 دورة في الدقيقة. كرر مرتين لمدة ثلاث إجمالي يغسل.
  3. لتسمية نوى: نضح في برنامج تلفزيوني من الطبق زراعة الأنسجة واستبدالها مع حل هويشت. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة. وصمة عار لFAK أو علامة أخرى غير قابلة للكشف الأجسام المضادة، انتقل إلى الخطوة 4.5.
  4. نضح الحل وسم النووي وغسل غرام تحتوي على خليةإلس ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X كما في الخطوة 4.2. عينات الملون يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني 1X في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  5. وصمة عار لبروتين من الفائدة: نضح في برنامج تلفزيوني من أطباق زراعة الأنسجة، إضافة 300 ميكرولتر من 0.3٪ PBST، واحتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  6. نضح في برنامج تلفزيوني، وتغطي المواد الهلامية مع عازلة تمنع، واحتضان على شاكر (200 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة ل~ 4 ساعات.
  7. نضح المخزن المؤقت عرقلة، وتغطي المواد الهلامية مع حل الأجسام المضادة الأولية، واحتضان على شاكر في 200 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.
  8. نضح حل الأجسام المضادة الأولية، إضافة 0.3٪ حل PBST، واحتضان على شاكر في 200 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. نضح PBST وتكرار كل 30 دقيقة لمدة 3-4 ساعة.
  9. كرر الخطوات من 4.7 و 4.8، وهذه المرة احتضان مع الحل الضد الثانوية. التفاف أطباق زراعة الأنسجة مع رقائق الألومنيوم لمنع photobleaching من من الأجسام المضادة الثانوية. بعد فينال غسل، وعينات الملون يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني 1X في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  10. لتصور العينات، واستخدام الهدف NA 10X / 0.30 ركز على المستوى الناصف من الأنسجة الظهارية.
  11. لتصور نواة الخلية، صورة ثابتة عينات المسمى مع علامة النووية باستخدام الهدف NA 10X / 0.30 تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية.
  12. لتصور عينات الملون لبروتين من الفائدة، صورة باستخدام الهدف NA 10X / 0.30 على مجهر مضان مقلوب.
  13. لإنشاء خرائط تردد من تلطيخ البروتين من أنسجة متعددة (عادة 50 أو أكثر) من الهندسة الأولية متطابقة، استيراد أول كل الصور باستخدام معيار برمجيات تحليل الصور (انظر المواد) وتحويلها إلى الرمادي 8 بت.
  14. إلى عتبة هذه الصور، وتحويلها إلى ثنائي (أي نصفية / أبيض وأسود) عن طريق تحديد نقطة قطع تدرج الرمادي. القيم تدرج الرمادي تحت عتبة تصبح سوداء، وأولئك الذين تجاوزوا عتبة تصبح بيضاء. ثم، والجمع بينكل من صور ثنائية الفردية في كومة صورة واحدة.
  15. المقبل، وسجل الصور مكدسة (أي محاذاة أو مطابقتها) في برامج التحليل. العديد من حزم برمجيات تحليل الصور التي تأتي مع البرنامج المساعد التسجيل متاح مجانا.
    1. استخدام كل صورة في كومة كنموذج لمحاذاة الصورة التالية، بحيث يتم محاذاة الصور في كومة بأكمله عن طريق الإكثار. وأخيرا، تراكب (المشروع) الصور في كومة صورة الانحياز على أساس متوسط ​​كثافة لتشكيل صورة واحدة مع خريطة تردد بكسل. هذه الصورة يمكن أن يكون ثم مرمزة باستخدام برامج تحرير الصور من اختيار 10،11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التخطيطي العام لالثديية التصنيع الدقيق الأنسجة الظهارية

ويرد التخطيطي العام لإجراء التصنيع الدقيق يحدد تدفق العمل التجريبي في الشكل 1. والنتيجة النهائية هي مجموعة من الأنسجة الطلائية للهندسة متطابقة والمباعدة بين الولادات التي هي جزء لا يتجزأ تماما داخل هلام ECM. تستخدم تجربة تمثيلية EpH4 الماوس الخلايا الظهارية الثديية مثقف في مادة هلامية من نوع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد البروتوكول الموصوف أعلاه طريقة لإنتاج أنسجة ظهارية متطابقة ذات شكل محدد مسبقا ، مما يتيح التحكم المكاني في الإجهاد الميكانيكي الذي تتعرض له الخلايا في الأنسجة. يتم استخدام قالب مرن لإنشاء تجاويف في الكولاجين من النوع الأول يتم ملؤها بعد ذلك بالخلايا الظهارية وتغطيتها بطبقة كولاجين إضافية بحيث يتم تغليف الخلايا بالكامل في بيئة مصفوفة الكولاجين ثلاثية الأبعاد. إن زراعة هذه الأنسجة الإضافية وعلاجها بعوامل النمو للحث على التفرع من البنية الأولية تجعل هذا النظام قابلا لدراسة التشكل المتفرع للخلايا الظهارية. هناك العديد م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (HL118532، HL120142، CA187692)، ومؤسسة ديفيد وولوسيل باكارد، وكميل ومؤسسة هنري دريفوس، وبوروز مرحبا صندوق. وأيد ASP في جزء من شارلوت إليزابيث بروكتر شرفية زمالة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS)المواد اللاصقة إلسورثسيلجارد 184
عامل علاجPDMS Ellsworth المواد اللاصقةسيلجارد 184
سيد السيليكون منقوش بالطباعة الحجريةعصاميN / A
قارب وزن بلاستيكيفيشر ساينتيك08-732-115
أطباق بتري بقطر 100 ممBioExpressD-2550-2
الكحول الإيثيلي 200 مقاومللفارمكو Aaper111000200اصنع محلول 70٪ EtOH (v: v) عن طريق الخلط مع dH2< / sub>O
شفرة الحلاقةالأمريكية للسلامة620179
1: 1 Dulbecco ' s النسر المعدل s وسط : لحم الخنزير s F12 خليط المغذيات (DMEM / F12) (1: 1)HycloneSH30023FS
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Atlanta BiologicalsS11150H
10x Hank ' s محلول ملح متوازن (HBSS)Life Technologies14185-052
الأنسولينSigma AldrichI6634-500MG
GentamicinLife Technologies15750-060
10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)فيشر ScientificBP399-500
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)سيجما ألدريتش221465-500 جرام
بقري النوع الأول من الكولاجين (غير البيبسين)KokenIAC-50
الألبومين من مصل الأبقار (BSA)Sigma AldrichA-7906
ملاقط منحنية من الفولاذ المقاوم للصدأDumont7
أطباق زراعة الأنسجة بقطر 35 ممBioExpressT-2881-6
أنابيب مخروطية 15 ملBioExpressC-3394-2
1.5 مل Eppendorf أنبوب القفل الآمنالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1615-5500
أغطية زجاجية دائرية # 1 ، قطرها 15 ممBellco Glass Inc.طلب
0.05٪ 1x Trypsin-EDTALife Technologies25300-054
ParaformaldehydeVWR100503-916
Triton X-100Perkin ElmerN9300260Detergent
HGFSigma AldrichH 9661معلق في dH2< / sub>O عند 50 مجم / مل
أرنب مضاد للجسم المضاد FAKالحياة تقنياتAMO0672
الماعز المضادة للأرانب Alexa 488 الأجسام المضادةLife TechnologiesA-11034
Adobe PhotoshopAdobeN / Aتستخدم لخرائط تردد البكسل للترميز اللوني.
FIJI (ImageJ)NIHN / Aبرنامج مجاني لتحليل الصور يستخدم لعتبة الصور وتسجيلها وتراكبها لإنشاء خريطة تردد بكسل. تم استخدام المكون الإضافي StackReg لتسجيل الصور الثنائية.
خاص

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
  2. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
  3. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).
  4. Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
  5. Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
  6. Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
  7. Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
  8. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
  9. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
  10. Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458(2015).
  11. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
  12. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  13. Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
  14. Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDMS HGF

مقالات ذات صلة