فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

تطورت تقنيات تعدين الجينومات والميتاجينومات بسرعة في السنوات الأخيرة ، وكذلك الاستراتيجيات المتوسطة والعالية الإنتاجية لاستنساخ الإنزيمات المؤتلفة والتعبير عنها. علاوة على ذلك ، توسعت موارد المعلوماتية الحيوية والمستودعات المرتبطة بها ، مثل (CAZy) ^1،2 بشكل كبير. ومع ذلك ، هناك تحديات كبيرة متأصلة في استغلال تنوع الإنزيمات الميكروبية للأغراض الصناعية ، وقد أصبح التحديد التجريبي لأنشطة الإنزيم الآن عنق زجاجة خطير. على سبيل المثال ، تشير التقديرات إلى أنه باستخدام الطرق الحالية ، يمكننا التنبؤ بأمان بأنشطة ما لا يزيد عن 4٪ من البروتينات داخل قاعدة بيانات CAZy. على الرغم من توفر العديد من الطرق لمراقبة أنشطة الإنزيم ، إلا أن جميعها لها بعض القيود. تتوفر تقنيات راسخة تعتمد على الكروماتوغرافيا جنبا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي لتقييم شظايا القلة لأنشطة هيدرولاز الجليكوسيل (GH)^3،4. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب كثيفة العمالة ومنخفضة الإنتاجية بشكل عام. تستخدم الطرق القائمة على قياس السكريات المختزلة مثل حمض ثنائي نيتروساليسيليك⁵ ومقايسات نيلسون-سوموغي⁶ على نطاق واسع لتقييم أنشطة هرمون النمو. ومع ذلك ، فإن هذه المقايسات لها إنتاجية محدودة ويمكن أن تكون عرضة لردود الفعل الجانبية. تستخدم ركائز عديد السكاريد الكروموجينيك الفردية ، مثل الأزورين المتشابك (AZCL) على نطاق واسع لتحديد أنشطة الإنزيم ، ولكن شراء جميع الركائز بشكل منفصل وتوزيع مساحيق الركيزة يدويا داخل لوحة الفحص يمكن أن يكون مرهقا^{ومكلفا 7}.

لقد قمنا بتطوير جيل جديد من ركائز هيدروجيل البوليمر الكروموجينيك (CPH) القائمة على أصباغ الكلوروتريازين التي ، عند استخدامها جنبا إلى جنب مع لوحة ترشيح 96 بئرا ، تشكل نظام فحص عالي الإنتاجية. تم تطوير ركائز إضافية للكتلة الحيوية الملونة غير القابلة للذوبان (ICB) والتي توفر معلومات حول توافر الركيزة داخل مخاليط البوليمر المعقدة ، مثل تلك الموجودة في الكتلة الحيوية الليجنوسليلوزية. يمكن إنتاج كل ركيزة بواحد من أربعة ألوان ، ويمكن دمج ركائز ملونة مختلفة في بئر واحد. في هذا البروتوكول ، يظهر أنه يمكن تطبيق هذه المنهجية على مجموعة متنوعة من السكريات والبروتينات وإمكانية فحص هرمون النمو ، عديد السكاريد الليتي أحادي الأكسجين (LPMOs) والبروتياز. يتم توفير بروتوكولات محددة لاستخدام 96 لوحة آبار وتوضح النتائج التمثيلية الكفاءة العالية لمجموعات الركيزة CPH و ICB كأدوات لفحص الإنزيم.

تتمثل إحدى الميزات المهمة لمجموعات الفحص الموصوفة ، بغض النظر عن الركيزة ، في أن المجموعات جاهزة للاستخدام في غضون 15 دقيقة ، بعد خطوة التنشيط. هذا يلغي الحاجة إلى تجميع الفحص الذي يستغرق وقتا طويلا من مواد الركيزة الخام كما هو الحال مع بعض الطرق الأخرى⁷. تتميز ركائز CPH و ICB بتخزين ممتاز (سنة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة) ، واستقرار درجة الحموضة ودرجة الحرارة ⁸ ولا تتطلب أي معدات أو تدريب متخصص. تعتمد فحوصات CPH أو ICB على لوحة ترشيح مكونة من 96 بئرا يتم من خلالها إجراء التفاعل مع الإنزيم. إذا كان الإنزيم نشطا مع ركيزة معينة ، يتم إنشاء أوليغومرات مصبوغة قابلة للذوبان ، مما ينتج عنه مادة طافية ملونة يمكن بعد ذلك ترشيحها إلى صفيحة منتظمة ذات 96 بئرا باستخدام مشعب فراغ أو جهاز طرد ^{مركزي 8}.

CPH أداة قيمة لتقييم النشاط المحدد للإنزيم بينما تستخدم ركائز ICB لتقييم قدرة الإنزيم على هضم مكون في سياق مخاليط الركيزة المعقدة التي تواجهها الإنزيمات عادة داخل الكتلة الحيوية. على الرغم من أن ركائز ICB لا توفر معلومات حول خصائص الإنزيم الفردية ، إلا أنها أدوات مفيدة لتقييم الأداء التجاري للإنزيمات أو الكوكتيلات أو المرق.

1. اللونية الفحص مع ركائز CPH في تنسيق لوحة 96-جيدا

1. تفعيل فحص عدة لوحة
   1. تفعيل فلتر 96-جيدا (التي تحتوي على الزرقاء CPH الزيلان) مجموعة فحص لوحة (قائمة المواد) وذلك بإضافة محلول 200 ميكرولتر تفعيل (تم الحصول عليها مع عدة) في كل بئر، تليها 10 دقيقة حضانة في درجة حرارة الغرفة دون الانفعالات.
   2. تطبيق فراغ باستخدام متعددة الفراغ (مع كتلة الفاصل داخل وبأي معيار من المعايير وشفافة لوحة 96-كذلك لوحة جمع) لإزالة الحل تفعيل موجودة. ومن الممكن أيضا استخدام أجهزة الطرد المركزي في 2700 x ج لمدة 10 دقيقة لهذه الخطوة بدلا من مشعب فراغ.
   3. غسل ركائز CPH بإضافة 100 ميكرولتر الماء المعقم وتطبيق فراغ (أو قوة الطرد المركزي) لإزالة استقرار. كرر هذه الخطوة مرتين أكثر ولوحات هي الآن جاهزة للاستخدام.
2. رد فعل إنزيم
   ملاحظة: وتشمل دائما العازلةوحدها كوسيلة لمراقبة سلبية وإذا كان ذلك ممكنا الانزيمات تتميز سابقا الضوابط الإيجابية. استخدام العدد المناسب إحصائيا من مكررات. ركائز CPH مستقرة بين درجة الحموضة 3،0-10،0 والحجم الكلي للحل انزيم نهاية عازلة في كل بئر يجب ألا يتجاوز 180 ميكرولتر. ويمكن أيضا أن مستخلصات نباتية أو مرق الثقافة أن تستخدم بدلا من حل انزيم المنقى.
   1. إضافة 150 ميكرولتر 100 ملي العازلة خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5 و 5 حل -cellulase ميكرولتر إندو (لتركيز النهائي من 1 يو / مل) إلى كل بئر من لوحة عدة الفحص.
   2. وضع لوحة المنتج (لوحة واضحة أيضا متوافقة مع القارئ عيار مكروي لوحة) تحت لوحة عدة فحص لجمع أي تسرب محتمل من لوحة رد فعل أثناء الهز.
   3. احتضان فحص عدة لوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في شاكر الأفقي في 150 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: خلط رد فعل في لوحة عدة الفحص أثناء الحضانة أمر حاسم لتحقيق متسقة وإعدادها في صورة جاهزةنتيجة ducible. ركائز CPH مستقرة تصل إلى 90 درجة مئوية. ينبغي زيادة فترة حضانة تصل إلى 24 ساعة عند اختبار المرق الثقافة التي تحتوي على تركيزات الانزيم غير معروفة مع ركائز CPH. ملاحظة أن مواعيد الحضانة المناسبة تعتمد على نشاط الإنزيم (ق)، ولكن بشكل عام إذا كان هناك أي نشاط يمكن كشفها خلال 24 ساعة، فمن المرجح أن الإنزيم لن تتحلل الركيزة التي تم اختبارها. أنزيم نشط يسبب تدهورا السكريات اللونية غير قابلة للذوبان الركيزة CPH إلى يغوساكاريدس اللونية القابلة للذوبان، والتي هي واضحة كما طاف الملونة.
   4. وضع لوحة المنتج نظيفة داخل مشعب فراغ مع كتلة هل الداخل.
   5. وضع فحص عدة لوحة على رأس وتطبيق فراغ (أقصى قدر من الضغط السلبي ل-60 كيلو باسكال). ومن الممكن أيضا استخدام أجهزة الطرد المركزي في 2700 x ج لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: الراشح تحتوي على يغوساكاريدس الملونة كما ناتج التفاعل هو الآن في لوحة المنتج لمزيد من التحليل ⁸
3. الكشف النوعي والكمي
   1. تأكد من أن حجم السائل في كل بئر من لوحة المنتج هو تقريبا نفس بالمعاينة البصرية.
   2. قراءة الامتصاصية لوحة جمع في 595 نانومتر للأزرق CPH-الزيلان باستخدام قارئ لوحة.
   3. عند القيام بتحليل البيانات، طرح المخزن المؤقت فقط القيم سيطرة سلبية من القيم من الآبار حيث تم إضافة الانزيم. حساب قيمة المتوسط ​​والخطأ المعياري وسائل (SEM) من الآبار تكرار ^8.

2. اللونية الفحص مع ركائز ICB في تنسيق 96-جيدا

1. رد فعل إنزيم
   1. إضافة 150 ميكرولتر 100 ملي العازلة خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5 و 5 ميكرولتر 31 U / مل إندو -xylanase حل كل بئر من لوحة عدة فحص تحتوي على أحمر القش ICB القمح (تركيز انزيم النهائي في البئر: 1 U / مل) .
      ملاحظة: لوحات عدة فحص (96 جيدا مرشح رريتم تصنيع آتش تحتوي على ركائز ICB) كما هو موضح في الأدب (انظر قائمة من المواد). ركائز ICB مستقرة في مخازن مع مجموعة الحموضة بين الرقم الهيدروجيني 3،0 حتي 10،0. وتشمل دائما العازلة وحدها كوسيلة لمراقبة سلبية، والإنزيمات التجارية وتحكم إيجابية واستخدام العدد المناسب إحصائيا من النسخ المتماثلة.
      1. لم تقم بتنشيط ركائز ICB مثل لوحة CPH الركيزة، ولكن إزالة استقرار عن طريق غسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر المياه تليها الترشيح فراغ أو الطرد المركزي.
   2. وضع لوحة المنتج تحت لوحة الركيزة لجمع أي تسرب محتمل من لوحة الركيزة خلال الهز.
   3. احتضان رد الفعل عند 25 درجة مئوية تهتز في 150 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: أنزيم نشط يسبب تدهورا السكريات اللونية غير قابلة للذوبان في الركيزة ICB إلى يغوساكاريدس القابلة للذوبان، والتي هي واضحة كما طاف الملونة. ركائز ICB مستقرة تصل إلى 90 درجة مئوية. ر حضانةIME ينبغي زيادة تصل إلى 24 ساعة في حالة استخدام الانزيمات غير المنقى مثل المرق الثقافة.
   4. وضع لوحة المنتج داخل مشعب فراغ مع كتلة هل الداخل.
   5. وضع فحص عدة لوحة على رأس وتطبيق فراغ (أقصى قدر من الضغط السلبي ل-60 كيلو باسكال) أو استخدام جهاز للطرد المركزي لالترشيح المنتج من فحص عدة لوحة في بئر من لوحة المنتج.
      ملاحظة: الراشح تحتوي على يغوساكاريدس الملونة كما ناتج التفاعل هو الآن في لوحة جمع لمزيد من التحليل ^8.
2. كشف والقياس
   1. تأكد من أن حجم السائل في كل بئر من لوحة جمع ما يقرب من نفس عن طريق التفتيش البصري.
   2. قراءة الامتصاصية لوحة جمع في 517 نانومتر للأحمر القش ICB القمح باستخدام قارئ لوحة.
   3. عند القيام بتحليل البيانات - طرح المخزن المؤقت - فقط القيم سيطرة سلبية من القيم من الآبار حيث انزيمتمت أضافتة. حساب قيمة المتوسط ​​والخطأ المعياري وسائل (SEM) من الآبار تكرار ^8.
      ملاحظة: في حالة فحص انزيمات غير معروفة، فإننا نقترح اتخاذ سلسلة التخفيف من أجل الحصول على بيانات أكثر تفصيلا عن مجموعة ديناميكية من النشاط الإنزيم.

ويستند الإنتاجية العالية والقدرة على مضاعفة من هذا الاختبار على غير قابلة للذوبان مولد اللون البوليمر (أو البروتين) هيدروجيل (CPH) ركائز مرتبة في لوحات تصفية 96-جيدا. تضاف الإنزيمات، وكذلك ضوابط السلبية لوحة عدة فحص (الشكل 1A) والإنزيمات تتحلل الركيزة المقابلة إنتاج طاف الملونة (الشكل 1B). بعد الانتهاء من رد الفعل، ويتم نقل طاف في لوحة المنتج واضح جيدا والامتصاصية يمكن قياسها مباشرة باستخدام معمل مناسبة لوحات 96-جيدا (الشكل 1C).

يظهر - (0.75 U / مل 0،00) في الشكل 1D حيث تركيز انزيم تناقص يمكن ملاحظتها بالعين المجردة مثال على الاستجابة للجرعة من CPH-arabinoxylan إلى xylanase بتركيزات مختلفة من الانزيم. وضليع في الرياضيات طيفية أكثر تفصيلاification يمكن استخدامها لرسم الامتصاصية مقابل تركيز انزيم (الشكل 1E). كثافة إشارة يتوافق مع نشاط الإنزيم. يظهر استنساخ للفحص من قبل أشرطة الخطأ (خطأ المعياري للمتوسط، ووزارة شؤون المرأة، من ثلاث نسخ طبق الأصل). وتنشر التجارب أكثر تفصيلا عن استنساخ هذا الاختبار في أي مكان آخر 8.

الشكل 1. العلاج Xylanase من CPH-arabinoxylan. أ) مخطط لوحة عدة فحص مع الركيزة CPH (على سبيل المثال، CPH-arabinoxylan) تحميل في 96-جيدا الآبار مرشح لوحة فقط قبل إضافة الإنزيمات 1 و 2 و المخزن المؤقت السيطرة -فقط (كان انزيم 1 النشاط -xylanase إندو)؛ ب) تدهور CPH-arabinoxylan بواسطة انزيم 1 أنتجت طاف الملونة؛ ج) عند filtrat بمساعدة فراغأيون من supernatants في لوحة المنتج، يتم قياس الامتصاصية طيفيا؛ D) لوحة المنتجات التي تحتوي على منتجات التفاعل بعد العلاج من CPH-arabinoxylan في 4 ألوان مختلفة مع تركيزات مختلفة من إندو -β-1،4-xylanase في 100 ملي الصوديوم الخلات، ودرجة الحموضة 4.5 لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة؛ هاء) الكمي من المنتجات رد فعل من D باستخدام القياس الطيفي الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هناك خيارات مختلفة لاستخدام هذا الاختبار في فحص انزيم. خيار واحد هو استخدام لوحة 96-جيدا تحتوي على السكريات المختلفة للفحص، على سبيل المثال، هناك عدد قليل من (تنقيته) إندو -enzymes مع نشاط غير معروف. في هذه الحالة سوف تظهر النتيجة التي السكريات هي degradقادرة بواسطة انزيم الهدف. لإظهار هذا المبدأ، تم اختبار على -cellulase إندو ضد ركائز CPH مختلفة عند 25 درجة مئوية. حضنت ثلاثة تركيزات مختلفة انزيم (0.5 U / مل، 1.0 U / مل و 5 U / مل) لمدة 30 دقيقة. والنتيجة هي واضحة للعيان في لوحة المنتج (الشكل 2A). ورقة المنتج لهذا إندو -cellulase التي يقدمها المورد تحدد الجانب النشاط لxyloglucan (تمر هندي)، الشعير β-جلوكان، glucomannan، الزيلان BIRCHWOOD وانخفاض الجانب النشاط لgalactomannan. وتمشيا مع هذا، تم العثور على نشاط إضافي لالسيلولوز ضد CPH-β-جلوكان (الشعير)، CPH-xyloglucan (تمر هندي)، CPH-الزيلان (الزان) وانخفاض النشاط ضد CPH-galactomannan (الشكل 2B). لم يختبر Glucomannan. تم هضمها ركائز CPH نفسها مع الإنزيمات المتاحة التجارية (ثلاثة تركيزات مختلفة انزيم: 0.1 U / مل، 0.5 U / مل و 1.0 U / مل) تستخدم الضوابط الإيجابية في ظل نفس الظروف من السابقتجربة. وقد تدهورت جميع ركائز بواسطة انزيم السيطرة الإيجابية وكثافة إشارة زادت المقابلة لأعلى تركيز انزيم (الشكل 2C).

الرقم حضنت 2. ثمانية ركائز CPH مختلفة في إطار التحريض على درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أ) لوحة نتاج ركائز CPH مختلفة هضمها مع إندو -cellulase، بتركيزات مختلفة. B) الكمي من النشاط والنشاط جانب مختلف من وإندو -cellulase. تمثل أشرطة الخطأ والخطأ المعياري للمتوسط ​​من ثلاث نسخ طبق الأصل C) نشاط الإنزيمات التجارية المختلفة إلى الركيزة CPH المقابلة (إندو-سلولاز و2-HE-السليلوز و E-LAMSE وCPH-pachyman، CPH-curdlan، CPH- β-جلوكان (الشعير)؛ E-XYAN4 وCPH-الزيلان، E-XEGP وCPH-xyloglucan، E-BLAAM وCPH أميلوز، E-BMACJ وCPH-galactomannan. كل الانزيمات من Megazyme). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​من نسختين متماثلتين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكتلة الحيوية اللونية (ICB) ركائز غير قابلة للذوبان هي إضافة مفيدة للذخيرة الركيزة مولد اللون لأنها تحتفظ في جزء الترتيب الطبيعي من السكريات في جدران الخلايا النباتية التي هي المكونات الرئيسية للكتلة الحيوية. وتستخدم CPH وICB ركائز في مثالنا لتحليل انزيمات تفرز من Phanerochaete ذهبية الأبواغ عندما يزرع في وسط سائل. يظهر الإعداد لوحة من لوحة عدة فحص في الشكل 3A، مع 19 CPH ركائز و5 ركائز ICB (4 آبار لكل الركيزة، الشكل 3B). ب. كانت ذهبية الأبواغ cultivatإد لمدة ثلاثة أيام ثم طاف ثقافة تحليلها. لذلك، تم نقل 125 ميكرولتر 200 عازلة ملي لكل طاف الثقافة بشكل جيد و25 ميكرولتر المضافة. وقد تم اختبار ثلاثة شروط الحموضة المختلفة باستخدام العازلة خلات الصوديوم درجة الحموضة 4.0 العازلة فوسفات الصوديوم 6.0 درجة الحموضة أو درجة الحموضة 8.0 (الشكل 3C). والمحتضنة لوحة تهز (150 دورة في الدقيقة) عند 25 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.

تم نقل المنتجات رد فعل على لوحة المنتج (الشكل 3D) وتحليلها. ب. ذهبية الأبواغ تنتج الانزيمات لتحلل مختلف جلوكان والنشا وxylans (الشكل 3E). يمكن أن يتم الكشف عن إشارات الأدنى للarabinan hemicelluloses (بنجر السكر) وغالاكتان بكتينية وكذلك لآر جي آي (فول الصويا). وكانت الأنزيمات المنتجة أكثر نشاطا في الظروف الحمضية (درجة الحموضة 4.0) مما كان عليه في ظروف محايدة أو الأساسية قليلا (درجة الحموضة 8.0). انخفاض النشاط نحو ركائز ICB (الشكل 3F)يظهر أنه عندما السكريات هي في سياق أكثر طبيعية، وكفاءة الانزيم ليست هي نفسها كما هو الحال مع السكاريد نقية وهذا هو السبب ركائز ICB تثبت وجهة نظر أكثر واقعية على الكفاءة انزيم، إذا تم تطبيقه على الخام أو ما قبل تعامل المواد النباتية.

الشكل 3. فحص لطاف الثقافة من ثقافة السائل القديمة لمدة 3 أيام من Phanerochaete ذهبية الأبواغ باستخدام لوحة الركيزة متعددة تحتوي على 19 CPH و 5 ركائز ICB. أ) ومخطط الإعداد لوحة مع 4 آبار لكل الركيزة الفردية (خلفية رمادية = ركائز CPH، الخلفية البرتقالية = ركائز ICB). ب) صورة من لوحة فحص تحتوي على الركيزة. C) مخطط تظهر الظروف العازلة المستخدمة في هذه التجربة (تم الكشف عن 200 ملي خلات الصوديوم الهيدروجيني 4.0، فوسفات الصوديوم 6.0 درجة الحموضة وفوسفات الصوديوم 8.0 درجة الحموضة). D) صورة للوحة المنتج بعد 2 ساعة عند 25 درجة مئوية. E) الامتصاصية في 517 نانومتر، ورسم لكل الركيزة CPH الفردية وF ) النتائج ICB الركيزة للأنزيمات منها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ركائز اللونية يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة آثار التآزر باستخدام خليط من مختلف ركائز CPH الملونة في بئر واحدة وتحليل طاف رد فعل بعد العلاج باستخدام الإنزيمات واحدة أو انزيم الكوكتيلات.

في المثال التالي هو مبين في الشكل (4)، أحمر CPH السليلوز وركائز CPH الزيلان الصفراء كانت مختلطة معا في EQU تقريبانسبة القاعدة في 96-جيدا الآبار مرشح لوحة. ويبين الشكل 4A المنتجات رد فعل الملونة بعد العلاج 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع عدم وجود إنزيم (السيطرة)، سل السليلوز (2 U / مل)، xylanase XYL (1 يو / مل)، و خليط من كل من الأنزيمات (3 مكررات لكل النهج) في 100 ملي خلات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 4.5. لتحليلها، وكان كميا للناتج التفاعل طيفيا عن طريق مسح الطيف الامتصاصية من 350 نانومتر إلى 700 نانومتر (الشكل 4B). في كثير من الأحيان الفحص البصري وحده يمكن أن تعطي مؤشرا على ما إذا كان انزيم يتصرف على واحد أو عدة ركائز، ومع ذلك سجلت يمكن أيضا امتصاص الأطياف النابعة من الأصباغ المختلفة يمكن حلها باستخدام بسيط الانحدار الخطي 8 لتعطي مؤشرا أكثر دقة لمدى تدهور كل الركيزة من الخليط.

استخدام ركائز CPH كما خليط كبير يزيد من الإنتاجية للمقايسة، مما يتيح قرار مجلس الأمنeening ضد ما يصل إلى 4 ركائز مختلفة في تجربة واحدة (بئر واحدة). في المثال الموضح أربع ركائز المختلفة المستخدمة: أزرق CPH-β-جلوكان (الشعير)، أصفر CPH الزيلان (الزان)، والأخضر CPH أميلوز والأحمر غالاكتان-CPH بكتيني (الترمس). يظهر تخطيط لوحة الركيزة في الشكل 4C وصورة من لوحة فحص في الشكل 4D. تم إجراء رد فعل في 100 ملي خلات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 4.5 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية و 150 دورة في الدقيقة. تم اختبار الانزيمات واحدة الأولى مع زيادة تركيز الانزيم مع الركيزة المقابلة CPH (الشكل 4E) وطاف الملونة وكان في استقبال كما هو متوقع في لوحة المنتج (الشكل 4F، الصف 1A - 12D). الواردة الصف E في اثنين من مختلف ركائز CPH الأصفر CPH-الزيلان والأزرق CPH-β-جلوكان، التي تدهورت مع نسب مختلفة من الانزيمات المقابلة إندو -xylanase وإندو -glucanase. بعد رد الفعل، والنتيجة هي visibفي لوحة المنتج لو: كان لون ناتج التفاعل أكثر قتامة الأخضر والأزرق، عندما كان أكثر إندو -glucanase الحالي (الشكل 4F، 4E-6E) وتحولت إلى أخف وزنا الأصفر والأخضر، عندما زاد إندو -xylanase تركيز ( الرقم 4F، 10-12E). وينظر الى نفسه في الصف F، حيث تدهورت اثنين من ركائز الحمراء CPH بكتيني غالاكتان والأصفر CPH-الزيلان مع إندو -galactanase وإندو -xylanase. وكانت كل أربعة أنواع مختلفة من الألوان CPH الركيزة الحالي (الشكل 4F، 1G-12F)، والأنزيمات واحدة تدهور الركيزة CPH المناسبة وذلك بإضافة إضافية الانزيمات وكان في استقبال مجموعة من المنتجات رد فعل الملونة.

الرقم 4. مزيج من اثنين من ركائز CPH مختلفة، أحمر CPH السليلوز والأصفر CPH-الزيلان، وتعامل مع إنزيمات مختلفة. ا) supernatants رد الفعل بعد العلاج من اثنين من ركائز مع إندو -cellulase (سل) أو إندو -xylanase (XYL) أو كليهما الانزيمات. ب) أطياف الامتصاص من supernatants رد فعل. مزيج من أربعة ركائز CPH المختلفة التي تتم معالجتها مع الانزيمات المختلفة C) مخطط لوحة الركيزة التي تحتوي على ركائز CPH: الأزرق CPH-β-جلوكان (الشعير)، أصفر CPH الزيلان (الزان)، والأخضر CPH أميلوز وCPH- الأحمر غالاكتان بكتينية (الترمس) D) صورة من لوحة فحص تحتوي على ركائز CPH مختلفة E) مخطط لوحة المنتج تبين نسبة الأنزيمات المضافة (تركيز الاسمية (NC):.. غلو = 1 يو / مل إندو -glucanase، XYL = 1 يو / مل إندو -xylanase، ايمي = 5 U / مل إندو -amylase وغال = 0،5 يو / مل إندو -galactanase). F) صورة من لوحة المنتج بعد حضانة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. قائمة متاح اللونية البوليمر هيدروجيل (CPH) وغير قابل للذوبان اللونية الكتلة الحيوية (ICB) ركائز.

هناك نوعان من طلبات البراءات المودعة التي تنطوي على 96 بئرا لوحة CPH الركيزة فحص و96-جيدا ICB الركيزة مقايسة (WO2015036000 والدنمارك السلطة الفلسطينية 2015 70311).