مقالة منهجية

فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

DOI:

10.3791/54286

⸱

سبتمبر 20, 2016

 ,  , 
1Department for Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen, 2School of Agriculture, Food and Rural Development, Newcastle University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم وصف مقايسة عالية الإنتاجية لفحص الإنزيم. تتكون مجموعة الفحص الجاهزة للاستخدام متعددة الإرسال هذه من ركائز Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) المختارة مسبقا وركائز الكتلةB الهرومولينية Cالمعقدة I (ICB). الإنزيمات المستهدفة هي الإنزيمات الداخلية والبروتياز المتحلل للسكاريد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) لها أدوار متعددة في الجسم الحي وتستخدم على نطاق واسع للمعالجة الصناعية في الوقود الحيوي والمنسوجات والمنظفات والورق والصناعات الغذائية. يعد الفهم الأعمق ل CAZymes أمرا مهما من وجهة نظر علم الأحياء الأساسية والصناعية. توجد أعداد هائلة من CAZymes في الطبيعة (خاصة في الكائنات الحية الدقيقة) وقد تم فهرسة مئات الآلاف ووصفها في قاعدة بيانات carbohydrate active enzyme (CAZy). ومع ذلك ، فإن معدل اكتشاف الإنزيمات المفترضة قد تجاوز قدرتنا على توصيف أنشطتها كيميائيا حيويا. أحد أسباب ذلك هو أن التقدم في تسلسل الجينوم والنسخ ، جنبا إلى جنب مع أدوات المعلوماتية الحيوية المرتبطة بها يسمح بالتعرف السريع على CAZymes المرشح ، لكن تقنية تحديد الخصائص الكيميائية الحيوية للإنزيم قد تقدمت بشكل أبطأ. لمعالجة هذه الفجوة التكنولوجية ، يتم وصف مجموعة فحص جديدة عالية الإنتاجية تعتمد على ركائز كروموجينيك غير قابلة للذوبان. تم إنتاج نوعين متميزين من الركيزة: ركائز Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) (مصنوعة من السكريات والبروتينات المنقاة) و Iغير قابل للذوبان Cهروموجينيك Biomass (ICB) (مصنوعة من مواد الكتلة الحيوية المعقدة). يتم توفير كل من ركائز CPH و ICB في نظام فحص عالي الإنتاجية مكون من 96 بئرا. يمكن تصنيع ركائز CPH بأربعة ألوان مختلفة ، مما يتيح مزجها معا وبالتالي زيادة إنتاجية الفحص. يصف البروتوكول مقايسة لوحة 96 بئرا ويوضح كيف يمكن استخدام هذا الاختبار لفحص أنشطة الإنزيمات وكوكتيلات الإنزيم والمرق.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطورت تقنيات تعدين الجينومات والميتاجينومات بسرعة في السنوات الأخيرة ، وكذلك الاستراتيجيات المتوسطة والعالية الإنتاجية لاستنساخ الإنزيمات المؤتلفة والتعبير عنها. علاوة على ذلك ، توسعت موارد المعلوماتية الحيوية والمستودعات المرتبطة بها ، مثل (CAZy) 1،2 بشكل كبير. ومع ذلك ، هناك تحديات كبيرة متأصلة في استغلال تنوع الإنزيمات الميكروبية للأغراض الصناعية ، وقد أصبح التحديد التجريبي لأنشطة الإنزيم الآن عنق زجاجة خطير. على سبيل المثال ، تشير التقديرات إلى أنه باستخدام الطرق الحالية ، يمكننا التنبؤ بأمان بأنشطة ما لا يزيد عن 4٪ من البروتينات داخل قاعدة بيانات CAZy. على الرغم من توفر العديد من الطرق لمراقبة أنشطة الإنزيم ، إلا أن جميعها لها بعض القيود. تتوفر تقنيات راسخة تعتمد على الكروماتوغرافيا جنبا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي لتقييم شظايا القلة لأنشطة هيدرولاز الجليكوسيل (GH)3،4. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب كثيفة العمالة ومنخفضة الإنتاجية بشكل عام. تستخدم الطرق القائمة على قياس السكريات المختزلة مثل حمض ثنائي نيتروساليسيليك5 ومقايسات نيلسون-سوموغي6 على نطاق واسع لتقييم أنشطة هرمون النمو. ومع ذلك ، فإن هذه المقايسات لها إنتاجية محدودة ويمكن أن تكون عرضة لردود الفعل الجانبية. تستخدم ركائز عديد السكاريد الكروموجينيك الفردية ، مثل الأزورين المتشابك (AZCL) على نطاق واسع لتحديد أنشطة الإنزيم ، ولكن شراء جميع الركائز بشكل منفصل وتوزيع مساحيق الركيزة يدويا داخل لوحة الفحص يمكن أن يكون مرهقاومكلفا 7.

لقد قمنا بتطوير جيل جديد من ركائز هيدروجيل البوليمر الكروموجينيك (CPH) القائمة على أصباغ الكلوروتريازين التي ، عند استخدامها جنبا إلى جنب مع لوحة ترشيح 96 بئرا ، تشكل نظام فحص عالي الإنتاجية. تم تطوير ركائز إضافية للكتلة الحيوية الملونة غير القابلة للذوبان (ICB) والتي توفر معلومات حول توافر الركيزة داخل مخاليط البوليمر المعقدة ، مثل تلك الموجودة في الكتلة الحيوية الليجنوسليلوزية. يمكن إنتاج كل ركيزة بواحد من أربعة ألوان ، ويمكن دمج ركائز ملونة مختلفة في بئر واحد. في هذا البروتوكول ، يظهر أنه يمكن تطبيق هذه المنهجية على مجموعة متنوعة من السكريات والبروتينات وإمكانية فحص هرمون النمو ، عديد السكاريد الليتي أحادي الأكسجين (LPMOs) والبروتياز. يتم توفير بروتوكولات محددة لاستخدام 96 لوحة آبار وتوضح النتائج التمثيلية الكفاءة العالية لمجموعات الركيزة CPH و ICB كأدوات لفحص الإنزيم.

تتمثل إحدى الميزات المهمة لمجموعات الفحص الموصوفة ، بغض النظر عن الركيزة ، في أن المجموعات جاهزة للاستخدام في غضون 15 دقيقة ، بعد خطوة التنشيط. هذا يلغي الحاجة إلى تجميع الفحص الذي يستغرق وقتا طويلا من مواد الركيزة الخام كما هو الحال مع بعض الطرق الأخرى7. تتميز ركائز CPH و ICB بتخزين ممتاز (سنة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة) ، واستقرار درجة الحموضة ودرجة الحرارة 8 ولا تتطلب أي معدات أو تدريب متخصص. تعتمد فحوصات CPH أو ICB على لوحة ترشيح مكونة من 96 بئرا يتم من خلالها إجراء التفاعل مع الإنزيم. إذا كان الإنزيم نشطا مع ركيزة معينة ، يتم إنشاء أوليغومرات مصبوغة قابلة للذوبان ، مما ينتج عنه مادة طافية ملونة يمكن بعد ذلك ترشيحها إلى صفيحة منتظمة ذات 96 بئرا باستخدام مشعب فراغ أو جهاز طرد مركزي 8.

< p class = 'jove_content'> يتم صبغ الركائز بأصباغ الكلوروتريازين التي تمتص في نطاق الطيف المرئي (VIS) ويمكن حل الألوان الفردية (الأحمر والأزرق والأصفر والأخضر) باستخدام الانحدار الخطي إذا تم خلط ركائز CPH مختلفة بألوان مختلفة في بئر واحد ، ويعمل الإنزيم على أكثر من ركيزة واحدة. يمكن قياس اللوحة الناتجة مع المواد الطافية باستخدام قارئ لوحة ميكروتيتر قياسي قادر على قياس الامتصاص في نطاق VIS. يؤدي خلط ركائز مختلفة بألوان مختلفة في بئر واحد إلى زيادة إنتاجية نظام الفحص ، إلى ما مجموعه 384 تجربة في صفيحة مكونة من 96 بئرا (4 ركائز مختلفة بألوان مختلفة لكل بئر).

توفر ركائز

CPH أداة قيمة لتقييم النشاط المحدد للإنزيم بينما تستخدم ركائز ICB لتقييم قدرة الإنزيم على هضم مكون في سياق مخاليط الركيزة المعقدة التي تواجهها الإنزيمات عادة داخل الكتلة الحيوية. على الرغم من أن ركائز ICB لا توفر معلومات حول خصائص الإنزيم الفردية ، إلا أنها أدوات مفيدة لتقييم الأداء التجاري للإنزيمات أو الكوكتيلات أو المرق.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. اللونية الفحص مع ركائز CPH في تنسيق لوحة 96-جيدا

  1. تفعيل فحص عدة لوحة
    1. تفعيل فلتر 96-جيدا (التي تحتوي على الزرقاء CPH الزيلان) مجموعة فحص لوحة (قائمة المواد) وذلك بإضافة محلول 200 ميكرولتر تفعيل (تم الحصول عليها مع عدة) في كل بئر، تليها 10 دقيقة حضانة في درجة حرارة الغرفة دون الانفعالات.
    2. تطبيق فراغ باستخدام متعددة الفراغ (مع كتلة الفاصل داخل وبأي معيار من المعايير وشفافة لوحة 96-كذلك لوحة جمع) لإزالة الحل تفعيل موجودة. ومن الممكن أيضا استخدام أجهزة الطرد المركزي في 2700 x ج لمدة 10 دقيقة لهذه الخطوة بدلا من مشعب فراغ.
    3. غسل ركائز CPH بإضافة 100 ميكرولتر الماء المعقم وتطبيق فراغ (أو قوة الطرد المركزي) لإزالة استقرار. كرر هذه الخطوة مرتين أكثر ولوحات هي الآن جاهزة للاستخدام.
  2. رد فعل إنزيم
    ملاحظة: وتشمل دائما العازلةوحدها كوسيلة لمراقبة سلبية وإذا كان ذلك ممكنا الانزيمات تتميز سابقا الضوابط الإيجابية. استخدام العدد المناسب إحصائيا من مكررات. ركائز CPH مستقرة بين درجة الحموضة 3،0-10،0 والحجم الكلي للحل انزيم نهاية عازلة في كل بئر يجب ألا يتجاوز 180 ميكرولتر. ويمكن أيضا أن مستخلصات نباتية أو مرق الثقافة أن تستخدم بدلا من حل انزيم المنقى.
    1. إضافة 150 ميكرولتر 100 ملي العازلة خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5 و 5 حل -cellulase ميكرولتر إندو (لتركيز النهائي من 1 يو / مل) إلى كل بئر من لوحة عدة الفحص.
    2. وضع لوحة المنتج (لوحة واضحة أيضا متوافقة مع القارئ عيار مكروي لوحة) تحت لوحة عدة فحص لجمع أي تسرب محتمل من لوحة رد فعل أثناء الهز.
    3. احتضان فحص عدة لوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في شاكر الأفقي في 150 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: خلط رد فعل في لوحة عدة الفحص أثناء الحضانة أمر حاسم لتحقيق متسقة وإعدادها في صورة جاهزةنتيجة ducible. ركائز CPH مستقرة تصل إلى 90 درجة مئوية. ينبغي زيادة فترة حضانة تصل إلى 24 ساعة عند اختبار المرق الثقافة التي تحتوي على تركيزات الانزيم غير معروفة مع ركائز CPH. ملاحظة أن مواعيد الحضانة المناسبة تعتمد على نشاط الإنزيم (ق)، ولكن بشكل عام إذا كان هناك أي نشاط يمكن كشفها خلال 24 ساعة، فمن المرجح أن الإنزيم لن تتحلل الركيزة التي تم اختبارها. أنزيم نشط يسبب تدهورا السكريات اللونية غير قابلة للذوبان الركيزة CPH إلى يغوساكاريدس اللونية القابلة للذوبان، والتي هي واضحة كما طاف الملونة.
    4. وضع لوحة المنتج نظيفة داخل مشعب فراغ مع كتلة هل الداخل.
    5. وضع فحص عدة لوحة على رأس وتطبيق فراغ (أقصى قدر من الضغط السلبي ل-60 كيلو باسكال). ومن الممكن أيضا استخدام أجهزة الطرد المركزي في 2700 x ج لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: الراشح تحتوي على يغوساكاريدس الملونة كما ناتج التفاعل هو الآن في لوحة المنتج لمزيد من التحليل 8 .
  3. الكشف النوعي والكمي
    1. تأكد من أن حجم السائل في كل بئر من لوحة المنتج هو تقريبا نفس بالمعاينة البصرية.
    2. قراءة الامتصاصية لوحة جمع في 595 نانومتر للأزرق CPH-الزيلان باستخدام قارئ لوحة.
    3. عند القيام بتحليل البيانات، طرح المخزن المؤقت فقط القيم سيطرة سلبية من القيم من الآبار حيث تم إضافة الانزيم. حساب قيمة المتوسط ​​والخطأ المعياري وسائل (SEM) من الآبار تكرار 8.

2. اللونية الفحص مع ركائز ICB في تنسيق 96-جيدا

  1. رد فعل إنزيم
    1. إضافة 150 ميكرولتر 100 ملي العازلة خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5 و 5 ميكرولتر 31 U / مل إندو -xylanase حل كل بئر من لوحة عدة فحص تحتوي على أحمر القش ICB القمح (تركيز انزيم النهائي في البئر: 1 U / مل) .
      ملاحظة: لوحات عدة فحص (96 جيدا مرشح رريتم تصنيع آتش تحتوي على ركائز ICB) كما هو موضح في الأدب (انظر قائمة من المواد). ركائز ICB مستقرة في مخازن مع مجموعة الحموضة بين الرقم الهيدروجيني 3،0 حتي 10،0. وتشمل دائما العازلة وحدها كوسيلة لمراقبة سلبية، والإنزيمات التجارية وتحكم إيجابية واستخدام العدد المناسب إحصائيا من النسخ المتماثلة.
      1. لم تقم بتنشيط ركائز ICB مثل لوحة CPH الركيزة، ولكن إزالة استقرار عن طريق غسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر المياه تليها الترشيح فراغ أو الطرد المركزي.
    2. وضع لوحة المنتج تحت لوحة الركيزة لجمع أي تسرب محتمل من لوحة الركيزة خلال الهز.
    3. احتضان رد الفعل عند 25 درجة مئوية تهتز في 150 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: أنزيم نشط يسبب تدهورا السكريات اللونية غير قابلة للذوبان في الركيزة ICB إلى يغوساكاريدس القابلة للذوبان، والتي هي واضحة كما طاف الملونة. ركائز ICB مستقرة تصل إلى 90 درجة مئوية. ر حضانةIME ينبغي زيادة تصل إلى 24 ساعة في حالة استخدام الانزيمات غير المنقى مثل المرق الثقافة.
    4. وضع لوحة المنتج داخل مشعب فراغ مع كتلة هل الداخل.
    5. وضع فحص عدة لوحة على رأس وتطبيق فراغ (أقصى قدر من الضغط السلبي ل-60 كيلو باسكال) أو استخدام جهاز للطرد المركزي لالترشيح المنتج من فحص عدة لوحة في بئر من لوحة المنتج.
      ملاحظة: الراشح تحتوي على يغوساكاريدس الملونة كما ناتج التفاعل هو الآن في لوحة جمع لمزيد من التحليل 8.
  2. كشف والقياس
    1. تأكد من أن حجم السائل في كل بئر من لوحة جمع ما يقرب من نفس عن طريق التفتيش البصري.
    2. قراءة الامتصاصية لوحة جمع في 517 نانومتر للأحمر القش ICB القمح باستخدام قارئ لوحة.
    3. عند القيام بتحليل البيانات - طرح المخزن المؤقت - فقط القيم سيطرة سلبية من القيم من الآبار حيث انزيمتمت أضافتة. حساب قيمة المتوسط ​​والخطأ المعياري وسائل (SEM) من الآبار تكرار 8.
      ملاحظة: في حالة فحص انزيمات غير معروفة، فإننا نقترح اتخاذ سلسلة التخفيف من أجل الحصول على بيانات أكثر تفصيلا عن مجموعة ديناميكية من النشاط الإنزيم.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويستند الإنتاجية العالية والقدرة على مضاعفة من هذا الاختبار على غير قابلة للذوبان مولد اللون البوليمر (أو البروتين) هيدروجيل (CPH) ركائز مرتبة في لوحات تصفية 96-جيدا. تضاف الإنزيمات، وكذلك ضوابط السلبية لوحة عدة فحص (الشكل 1A) والإنزيمات تتحلل الركيزة المقابلة إنتاج طاف الملونة (الشكل 1B). بعد الانتهاء من رد الفعل، ويتم نقل طاف في لوحة المنتج واضح جيدا والامتصاصية يمكن قياسها مباشرة باستخدام معمل مناسبة لوحات 96-جيدا (الشكل 1C).

يظهر - (0.75 U / مل 0،00) في الشكل 1D حيث تركيز انزيم تناقص يمكن ملاحظتها بالعين المجردة مثال على الاستجابة للجرعة من CPH-arabinoxylan إلى xylanase بتركيزات مختلفة من الانزيم. وضليع في الرياضيات طيفية أكثر تفصيلاification يمكن استخدامها لرسم الامتصاصية مقابل تركيز انزيم (الشكل 1E). كثافة إشارة يتوافق مع نشاط الإنزيم. يظهر استنساخ للفحص من قبل أشرطة الخطأ (خطأ المعياري للمتوسط، ووزارة شؤون المرأة، من ثلاث نسخ طبق الأصل). وتنشر التجارب أكثر تفصيلا عن استنساخ هذا الاختبار في أي مكان آخر 8.

figure-results-1
الشكل 1. العلاج Xylanase من CPH-arabinoxylan. أ) مخطط لوحة عدة فحص مع الركيزة CPH (على سبيل المثال، CPH-arabinoxylan) تحميل في 96-جيدا الآبار مرشح لوحة فقط قبل إضافة الإنزيمات 1 و 2 و المخزن المؤقت السيطرة -فقط (كان انزيم 1 النشاط -xylanase إندو)؛ ب) تدهور CPH-arabinoxylan بواسطة انزيم 1 أنتجت طاف الملونة؛ ج) عند filtrat بمساعدة فراغأيون من supernatants في لوحة المنتج، يتم قياس الامتصاصية طيفيا؛ D) لوحة المنتجات التي تحتوي على منتجات التفاعل بعد العلاج من CPH-arabinoxylan في 4 ألوان مختلفة مع تركيزات مختلفة من إندو -β-1،4-xylanase في 100 ملي الصوديوم الخلات، ودرجة الحموضة 4.5 لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة؛ هاء) الكمي من المنتجات رد فعل من D باستخدام القياس الطيفي الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هناك خيارات مختلفة لاستخدام هذا الاختبار في فحص انزيم. خيار واحد هو استخدام لوحة 96-جيدا تحتوي على السكريات المختلفة للفحص، على سبيل المثال، هناك عدد قليل من (تنقيته) إندو -enzymes مع نشاط غير معروف. في هذه الحالة سوف تظهر النتيجة التي السكريات هي degradقادرة بواسطة انزيم الهدف. لإظهار هذا المبدأ، تم اختبار على -cellulase إندو ضد ركائز CPH مختلفة عند 25 درجة مئوية. حضنت ثلاثة تركيزات مختلفة انزيم (0.5 U / مل، 1.0 U / مل و 5 U / مل) لمدة 30 دقيقة. والنتيجة هي واضحة للعيان في لوحة المنتج (الشكل 2A). ورقة المنتج لهذا إندو -cellulase التي يقدمها المورد تحدد الجانب النشاط لxyloglucan (تمر هندي)، الشعير β-جلوكان، glucomannan، الزيلان BIRCHWOOD وانخفاض الجانب النشاط لgalactomannan. وتمشيا مع هذا، تم العثور على نشاط إضافي لالسيلولوز ضد CPH-β-جلوكان (الشعير)، CPH-xyloglucan (تمر هندي)، CPH-الزيلان (الزان) وانخفاض النشاط ضد CPH-galactomannan (الشكل 2B). لم يختبر Glucomannan. تم هضمها ركائز CPH نفسها مع الإنزيمات المتاحة التجارية (ثلاثة تركيزات مختلفة انزيم: 0.1 U / مل، 0.5 U / مل و 1.0 U / مل) تستخدم الضوابط الإيجابية في ظل نفس الظروف من السابقتجربة. وقد تدهورت جميع ركائز بواسطة انزيم السيطرة الإيجابية وكثافة إشارة زادت المقابلة لأعلى تركيز انزيم (الشكل 2C).

figure-results-2
الرقم حضنت 2. ثمانية ركائز CPH مختلفة في إطار التحريض على درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أ) لوحة نتاج ركائز CPH مختلفة هضمها مع إندو -cellulase، بتركيزات مختلفة. B) الكمي من النشاط والنشاط جانب مختلف من وإندو -cellulase. تمثل أشرطة الخطأ والخطأ المعياري للمتوسط ​​من ثلاث نسخ طبق الأصل C) نشاط الإنزيمات التجارية المختلفة إلى الركيزة CPH المقابلة (إندو-سلولاز و2-HE-السليلوز و E-LAMSE وCPH-pachyman، CPH-curdlan، CPH- β-جلوكان (الشعير)؛ E-XYAN4 وCPH-الزيلان، E-XEGP وCPH-xyloglucan، E-BLAAM وCPH أميلوز، E-BMACJ وCPH-galactomannan. كل الانزيمات من Megazyme). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​من نسختين متماثلتين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكتلة الحيوية اللونية (ICB) ركائز غير قابلة للذوبان هي إضافة مفيدة للذخيرة الركيزة مولد اللون لأنها تحتفظ في جزء الترتيب الطبيعي من السكريات في جدران الخلايا النباتية التي هي المكونات الرئيسية للكتلة الحيوية. وتستخدم CPH وICB ركائز في مثالنا لتحليل انزيمات تفرز من Phanerochaete ذهبية الأبواغ عندما يزرع في وسط سائل. يظهر الإعداد لوحة من لوحة عدة فحص في الشكل 3A، مع 19 CPH ركائز و5 ركائز ICB (4 آبار لكل الركيزة، الشكل 3B). ب. كانت ذهبية الأبواغ cultivatإد لمدة ثلاثة أيام ثم طاف ثقافة تحليلها. لذلك، تم نقل 125 ميكرولتر 200 عازلة ملي لكل طاف الثقافة بشكل جيد و25 ميكرولتر المضافة. وقد تم اختبار ثلاثة شروط الحموضة المختلفة باستخدام العازلة خلات الصوديوم درجة الحموضة 4.0 العازلة فوسفات الصوديوم 6.0 درجة الحموضة أو درجة الحموضة 8.0 (الشكل 3C). والمحتضنة لوحة تهز (150 دورة في الدقيقة) عند 25 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.

تم نقل المنتجات رد فعل على لوحة المنتج (الشكل 3D) وتحليلها. ب. ذهبية الأبواغ تنتج الانزيمات لتحلل مختلف جلوكان والنشا وxylans (الشكل 3E). يمكن أن يتم الكشف عن إشارات الأدنى للarabinan hemicelluloses (بنجر السكر) وغالاكتان بكتينية وكذلك لآر جي آي (فول الصويا). وكانت الأنزيمات المنتجة أكثر نشاطا في الظروف الحمضية (درجة الحموضة 4.0) مما كان عليه في ظروف محايدة أو الأساسية قليلا (درجة الحموضة 8.0). انخفاض النشاط نحو ركائز ICB (الشكل 3F)يظهر أنه عندما السكريات هي في سياق أكثر طبيعية، وكفاءة الانزيم ليست هي نفسها كما هو الحال مع السكاريد نقية وهذا هو السبب ركائز ICB تثبت وجهة نظر أكثر واقعية على الكفاءة انزيم، إذا تم تطبيقه على الخام أو ما قبل تعامل المواد النباتية.

figure-results-3
الشكل 3. فحص لطاف الثقافة من ثقافة السائل القديمة لمدة 3 أيام من Phanerochaete ذهبية الأبواغ باستخدام لوحة الركيزة متعددة تحتوي على 19 CPH و 5 ركائز ICB. أ) ومخطط الإعداد لوحة مع 4 آبار لكل الركيزة الفردية (خلفية رمادية = ركائز CPH، الخلفية البرتقالية = ركائز ICB). ب) صورة من لوحة فحص تحتوي على الركيزة. C) مخطط تظهر الظروف العازلة المستخدمة في هذه التجربة (تم الكشف عن 200 ملي خلات الصوديوم الهيدروجيني 4.0، فوسفات الصوديوم 6.0 درجة الحموضة وفوسفات الصوديوم 8.0 درجة الحموضة). D) صورة للوحة المنتج بعد 2 ساعة عند 25 درجة مئوية. E) الامتصاصية في 517 نانومتر، ورسم لكل الركيزة CPH الفردية وF ) النتائج ICB الركيزة للأنزيمات منها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ركائز اللونية يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة آثار التآزر باستخدام خليط من مختلف ركائز CPH الملونة في بئر واحدة وتحليل طاف رد فعل بعد العلاج باستخدام الإنزيمات واحدة أو انزيم الكوكتيلات.

في المثال التالي هو مبين في الشكل (4)، أحمر CPH السليلوز وركائز CPH الزيلان الصفراء كانت مختلطة معا في EQU تقريبانسبة القاعدة في 96-جيدا الآبار مرشح لوحة. ويبين الشكل 4A المنتجات رد فعل الملونة بعد العلاج 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع عدم وجود إنزيم (السيطرة)، سل السليلوز (2 U / مل)، xylanase XYL (1 يو / مل)، و خليط من كل من الأنزيمات (3 مكررات لكل النهج) في 100 ملي خلات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 4.5. لتحليلها، وكان كميا للناتج التفاعل طيفيا عن طريق مسح الطيف الامتصاصية من 350 نانومتر إلى 700 نانومتر (الشكل 4B). في كثير من الأحيان الفحص البصري وحده يمكن أن تعطي مؤشرا على ما إذا كان انزيم يتصرف على واحد أو عدة ركائز، ومع ذلك سجلت يمكن أيضا امتصاص الأطياف النابعة من الأصباغ المختلفة يمكن حلها باستخدام بسيط الانحدار الخطي 8 لتعطي مؤشرا أكثر دقة لمدى تدهور كل الركيزة من الخليط.

استخدام ركائز CPH كما خليط كبير يزيد من الإنتاجية للمقايسة، مما يتيح قرار مجلس الأمنeening ضد ما يصل إلى 4 ركائز مختلفة في تجربة واحدة (بئر واحدة). في المثال الموضح أربع ركائز المختلفة المستخدمة: أزرق CPH-β-جلوكان (الشعير)، أصفر CPH الزيلان (الزان)، والأخضر CPH أميلوز والأحمر غالاكتان-CPH بكتيني (الترمس). يظهر تخطيط لوحة الركيزة في الشكل 4C وصورة من لوحة فحص في الشكل 4D. تم إجراء رد فعل في 100 ملي خلات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 4.5 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية و 150 دورة في الدقيقة. تم اختبار الانزيمات واحدة الأولى مع زيادة تركيز الانزيم مع الركيزة المقابلة CPH (الشكل 4E) وطاف الملونة وكان في استقبال كما هو متوقع في لوحة المنتج (الشكل 4F، الصف 1A - 12D). الواردة الصف E في اثنين من مختلف ركائز CPH الأصفر CPH-الزيلان والأزرق CPH-β-جلوكان، التي تدهورت مع نسب مختلفة من الانزيمات المقابلة إندو -xylanase وإندو -glucanase. بعد رد الفعل، والنتيجة هي visibفي لوحة المنتج لو: كان لون ناتج التفاعل أكثر قتامة الأخضر والأزرق، عندما كان أكثر إندو -glucanase الحالي (الشكل 4F، 4E-6E) وتحولت إلى أخف وزنا الأصفر والأخضر، عندما زاد إندو -xylanase تركيز ( الرقم 4F، 10-12E). وينظر الى نفسه في الصف F، حيث تدهورت اثنين من ركائز الحمراء CPH بكتيني غالاكتان والأصفر CPH-الزيلان مع إندو -galactanase وإندو -xylanase. وكانت كل أربعة أنواع مختلفة من الألوان CPH الركيزة الحالي (الشكل 4F، 1G-12F)، والأنزيمات واحدة تدهور الركيزة CPH المناسبة وذلك بإضافة إضافية الانزيمات وكان في استقبال مجموعة من المنتجات رد فعل الملونة.

figure-results-4
الرقم 4. مزيج من اثنين من ركائز CPH مختلفة، أحمر CPH السليلوز والأصفر CPH-الزيلان، وتعامل مع إنزيمات مختلفة. ا) supernatants رد الفعل بعد العلاج من اثنين من ركائز مع إندو -cellulase (سل) أو إندو -xylanase (XYL) أو كليهما الانزيمات. ب) أطياف الامتصاص من supernatants رد فعل. مزيج من أربعة ركائز CPH المختلفة التي تتم معالجتها مع الانزيمات المختلفة C) مخطط لوحة الركيزة التي تحتوي على ركائز CPH: الأزرق CPH-β-جلوكان (الشعير)، أصفر CPH الزيلان (الزان)، والأخضر CPH أميلوز وCPH- الأحمر غالاكتان بكتينية (الترمس) D) صورة من لوحة فحص تحتوي على ركائز CPH مختلفة E) مخطط لوحة المنتج تبين نسبة الأنزيمات المضافة (تركيز الاسمية (NC):.. غلو = 1 يو / مل إندو -glucanase، XYL = 1 يو / مل إندو -xylanase، ايمي = 5 U / مل إندو -amylase وغال = 0،5 يو / مل إندو -galactanase). F) صورة من لوحة المنتج بعد حضانة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الركيزة مصدر
CPH-2-هيدروكسي N / A
(CPH-2-HE-السليلوز)
CPH-الأميلوبكتين البطاطس
CPH أميلوز البطاطس
CPH-arabinan شمندر سكري
CPH-arabinoxylan قمح
CPH الكازين الحليب البقري
CPH-الشيتوزان أصل حيواني
CPH-curdlan المقلونة البرازية
CPH-ديكستران النستقة النيابة.
CPH-galactomannan خروب
CPH-امينارين لاميناريا إصبعية
CPH-lichenan موس الأيسلندي
CPH-ميثيل N / A
CPH-pachyman بوريا كوكوس
غالاكتان-CPH بكتيني البطاطس
CPH-بولولان ذهبية الدعامات الملوثة
CPH-rhamnogalacturonan الأول (RG الأول) البطاطس
CPH-rhamnogalacturonan الأول (-Gal) * البطاطس
CPH-rhamnogalacturonan فول الصويا
CPH-الزيلان الزان
CPH-xyloglucan تمر هندي
CPH-β-جلوكان من الشعير شعير
CPH-β-جلوكان من الشوفان شوفان نباتة
CPH-β-جلوكان من الخميرة خميرة
ICB-نبات الأرابيدوبسيس روزيت يترك من نبات الأرابيدوبسيس thaliana العقيد-0 (نبات الكبار)
بذور ICB-نبات الأرابيدوبسيس نبات الأرابيدوبسيس thaliana
ICB-تفل قصب السكر officinarum (نبات الكبار المجففة، ساق وأوراق)
ICB البلورية السليلوز (ورقة فلتر) ورقة هتما 3MM مركز حقوق الانسان اللوني التجارية
بذور ICB-الحلبة الحلبة النيابة. بذور
ICB-القنب القنب النيابة. (نبات الكبار المجففة، ساق وأوراق)
بذور ICB-الترمس ترمس ضيق الأوراق والبذور
ICB-حبوب اللقاح P. pratense Phleum pratense حبوب اللقاح
ICB-شجرة التنوب Picea النيابة. (ميلجذع شجرة lled)
ICB من التبغ يترك من النيكوتين benthamiana (محطة الشباب)
قش القمح ICB قمح النيابة. (نبات الكبار المجففة، ساق وأوراق)
ICB الصفصاف صفصاف النيابة. (المجففة نبات الكبار، شجرة المضروب الجذع)
ICB-الذرة الذرة النيابة. (يترك من نبات الكبار)
(السلاسل الجانبية β-1،4-D-غالاكتان إزالتها مع إندو -β-1،4-D-galactanase) *

الجدول 1. قائمة متاح اللونية البوليمر هيدروجيل (CPH) وغير قابل للذوبان اللونية الكتلة الحيوية (ICB) ركائز.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نستخدم جيل جديد من CPH وICB ركائز متعددة الألوان التي تعتمد على الأصباغ chlorotriazine (قائمة كاملة من ركائز في الجدول 1) مرتبة في العرف تصميم عدة فحص التجارية. انزيم الهضم من ركائز غلة صغيرة، قابلة للذوبان، ومنتجات مصبوغ والتي يمكن كشفها في حل الاختبار، ويمكن أن يكون كميا باستخدام قارئ لوحة 9. تم تصميم هذا الاختبار لتقييم إندو -acting الانزيمات وحساسية الفحص مشابه لاحد باستخدام azurine عبر ربط (AZCL) ركائز 10، في حين أن الوسائل الأخرى المتاحة لإكسو الانزيمات -acting 11،12. الحد من هذه المجموعة الفحص تكمن في الكشف عن إندو -enzyme النشاط، كما CPH فضلا عن ركائز ICB ليست للتحلل من قبل -enzymes الأرجح إكسو بسبب عائق الفراغية الناتجة عن الصبغة وcrosslinker جزيئات 8.

يتم إجراء الفحص في 96 أهلا وسهلاشكل لتر وردود الفعل الفردية تتم في الآبار. رد الفعل يجب أن تكون مختلطة في لوحة لاستقبال البيانات استنساخه. وتصفية supernatants مما أدى إلى لوحة المنتج حيث الامتصاصية من كل جانب يمكن قياسها كميا باستخدام الامتصاص الطيفي. وترد المبادئ الأساسية والتخطيط للفحص في الشكل 1. الفحص يتكون من لوحة فحص (مرشح لوحة 96 أيضا) مع ركائز، وبعد الحضانة مع الانزيمات، ويتم تصفية طاف خلال في لوحة جيدا واضحة وتتم قراءة الامتصاصية توفير قياس نصف الكمية من خصوصية الإنزيم والنشاط. فقد تبين أن هذا الفحص فحص باستخدام ركائز CPH يمكن أن تستخدم أيضا في شكل لوحة أجار، حيث خلق منتجات التفاعل القابلة للذوبان هالة ملونة بعد الحضانة بين عشية وضحاها. 8

مجموعات الفحص يمكن استخدامها لفحص انزيمات النقاء والأنشطة الجانبية المحتملة كما هو موضح فيالرقم 2، ويمكن-الأنشطة الجانبية تنشأ من إنزيم واحد وخصوصيته منحل ولكن أيضا من حقيقة أن العينات التى تم تحليلها هي مزيج من الإنزيمات المختلفة وتأثيرها تآزر يحتاج إلى دراسة. بالإضافة إلى ذلك، كما ثبت ذلك في دراسات سابقة، أن الكوكتيلات الانزيم، والقناة الهضمية الجراثيم 13 و ثقافة مرق من الفطريات 8 وكذلك الذاتية انزيم النباتية والبكتيريا (بيانات غير منشورة) يمكن استخدامها كمصدر للإنزيم.

ركائز ICB معالجة مخاليط معقدة من مكونات جدار الخلية اجه كثير من الأحيان في العمليات الصناعية من انهيار الكتلة الحيوية. وقد تم تصميم هذه ركائز لتقييم توافر السكاريد وتقديم معلومات حول كيفية تحسين فعالية الكوكتيلات تدهور للإخراج تدهور أكثر كفاءة. كما هو موضح في الشكل (3) CPH وICB ركائز يمكن استخدامها في الإنزيم جانب فحص من قبل الجانب - وكشف عن ثروة من المعلومات حول خصوصية انزيمالنشاط د في كل سياق الركيزة المفضلة (CPH) ومجمع أكثر طبيعية تحتوي على مكونات أخرى بالإضافة إلى الركيزة المفضلة محاكاة عن كثب على تجمع لجزيئات الموجودة في الطبيعة (ICB). استخدام ألوان متعددة يسمح للكشف في وقت واحد من الأنشطة الإنزيمية المختلفة ضد عدة ركائز مما يزيد من الإنتاجية العالية وmultiplexity من الفحص. أطياف الأصباغ المختلفة يمكن حلها عن طريق الانحدار الخطي البسيط وفي معظم الحالات النشاط متعددة الركيزة يمكن ملاحظتها عن طريق التفتيش البصري وحده. ويصور مثال محاكاة هذه التجربة ونتائجها في الشكل (4).

هذه الأدوات فحص وبراعة تطبيقه تناسب بشكل جيد للغاية للكشف عن المستوى الأول من الانزيمات والمرق الثقافة مع الأنشطة غير معروفة. وأهم جوانب هذا الاختبار هي طبيعة الإنتاجية العالية لها، التفصيل، وسهولة الاستخدام والمرونة. مع أخذ ذلك في الاعتبار، ثه ويعتقد أن هذه المجموعة رواية من الأدوات سوف تحسن كثيرا وتسريع عمليات الفرز الانزيم في الصناعة وكذلك التطبيقات الأكاديمية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك نوعان من طلبات البراءات المودعة التي تنطوي على 96 بئرا لوحة CPH الركيزة فحص و96-جيدا ICB الركيزة مقايسة (WO2015036000 والدنمارك السلطة الفلسطينية 2015 70311).

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونود أن نشكر البروفيسور جون بول نوكس (جامعة ليدز، المملكة المتحدة)، الذين قدموا الوصول إلى مختبراته للتصوير، وسوزان ماركوس لتقديم المساعدة التقنية الممتازة. شبيبة يقر مشروع WallTraC (البرنامج الإطاري السابع المفوضية الأوروبية (اتفاقية منحة لا: 263916) والكتلة الحيوية المشروع للقرن ال21 (الابتكار الأساس الدنمارك، القضية رقم: 103408) SKK وشكر المشروع SET4Future (مجلس البحوث الاستراتيجية الدنماركية)، والاستراتيجية الحيوية القيمة التي أسسها المجلس الدانمركي للبحوث الاستراتيجية، والمجلس الدانمركي للتكنولوجيا والابتكار (جرانت القضية رقم: 0603-00522B)، ونهج يحركها الأحياء لفهم تدهور الأنزيمية من السكاريد نظم مجمع (جرانت القضية رقم .:. 107279) للحصول على التمويل وتعكس هذه الورقة آراء المؤلفين فقط الاتحاد الأوروبي ليست مسؤولة عن أي استخدام يمكن أن تكون مصنوعة من المعلومات تتضمن هذه الوثيقة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
لوحات طقم الفحصGlycospotمخصص لمجموعة الفحص
حلتنشيط Glycospotلتنشيط ركائز CPH
350 مل كتلة فاصل لوحة الاستقبال لمشعب الفراغPall Corporation5015
فاصل 96 بئر لوحة مرشح HV متعددة الشاشات ، 0.45 & micro ؛ م ، لوحةMilliporeMSHVN4510
96 بئر Microplates ، لوحة تجميع 651201 من مادة البولي بروبيلينGreiner Bio-Oneبعد غسل الركائز
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermo Scientific269620لوحة المنتج
مضخة الحجاب الحاجز MZ 2 NTVacuubrand732000مضخة فراغ تستخدم مع مشعب
انفورز إتش تي إيكوترونإنفورز إتش تي4950132 (Buch & amp; هولم)شاكر أفقي
SpectraMax M5الأجهزة الجزيئية10067-750 (VWR)قارئ امتصاص لوحة 96 جيدا
مشعب الفراغPall Corporation5017فراغ مشعب
<م > إندو < / م > سليلاز (EGII) (<م > Trichoderma longibrachiatum < / م >)ميجازيمE-CELTRالسليولاز [<م > سيل < / م >]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus) MegazymeE-BMACJmannanase [man]
endo-β-1،3-glucanase (Trichoderma spp.)MegazymeE-LAMSE&-glucanase [glu]
endo-&β-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger) MegazymeE-EGALNgalactanase [gal]
endo-& beta;-1،4-xylanase M4 (Aspergillus niger) MegazymeE-XYAN4xylanase [xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.) MegazymeE-XEGPxyloglucanase [xg]
α-amylase (Bacillus licheniformis) ميجازيمE-BLAAMالأميليز [<م > ايمي < / إم >]
كتلة فحص شفافة وغير معقمةالفراغ

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D490-D495 (2014).
  2. Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).
  3. Agblevor, F. A., Murden, A., Hames, B. R. Improved method of analysis of biomass sugars using high-performance liquid chromatography. Biotechnol. Lett. 26 (15), 1207-1211 (2004).
  4. Black, G. E., Fox, A. Recent progress in the analysis of sugar monomers from complex matrices using chromatography in conjunction with mass spectrometry or stand-alone tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 720 (1-2), 51-60 (1996).
  5. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).
  6. Somogyi, M. Notes on Sugar Determination. J. Biol. Chem. 195 (1), 19-23 (1952).
  7. Zantinge, J. L., Huang, H. C., Cheng, K. J. Microplate diffusion assay for screening of beta-glucanase-producing microorganisms. Biotechniques. 33 (4), 798(2002).
  8. Kračun, S. K., et al. A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes. Biotechnol Biofuels. 8, (2015).
  9. Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity. J. Biotechnol. 103 (3), 203-212 (2003).
  10. Nyyssonen, M., et al. Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries. Front Microbiol. 4, 282(2013).
  11. Sweeney, M. D., Xu, F. Biomass Converting Enzymes as Industrial Biocatalysts for Fuels and Chemicals: Recent Developments. Catalysts. 2 (2), 244-263 (2012).
  12. Biely, P., et al. Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose. J. Biotechnol. 151 (1), 137-142 (2011).
  13. Mackenzie, A. K., et al. A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility. Appl Environ Microbiol. 81 (1), 187-195 (2015).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

96

مقالات ذات صلة