مقالة منهجية

التصوير نيون المشتركة القريبة من تحت الحمراء والتصوير المقطعي مايكرو لتصور مباشرة الشلل Thromboemboli

9.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54294

⸱

سبتمبر 25, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Imaging and Neurovascular Research Laboratory, Dongguk University College of Medicine, 2Biomedical Research Center, Korea Institute of Science and Technology, 3Research Institute of Advanced Materials, Department of Materials Science and Engineering, Seoul National University, 4Departments of Radiology and Cancer Systems Imaging, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تطبيق التصوير المقطعي جنبا إلى جنب الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIRF) التصوير والجزئي حسابها (microCT) لتصور thromboemboli الدماغي. هذا الأسلوب يسمح للتقدير حجم عبء الجلطة والتطور. تقنية التصوير NIRF يتصور fluorescently المسمى خثرة في الدماغ المستأصل، في حين أن تقنية microCT يتصور خثرة داخل الحيوانات الحية باستخدام الذهب النانوية.

الملخص

التصوير خثرة المباشر يتصور السبب الجذري للاحتشاء الانسداد التجلطي. أن تكون قادرة على خثرة صورة يسمح مباشرة التحقيق أفضل بكثير من السكتة الدماغية من الاعتماد على القياسات غير المباشرة، وسوف يكون أداة بحث قوية الأوعية الدموية وقوية. نحن نستخدم هذا النهج التصوير الضوئي التي تصف الجلطة الدموية مع الجزيئية علامة التصوير خثرة - مسبار Cy5.5 الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIRF) مرتبط تساهميا إلى خيوط الفيبرين من الجلطة بفعل الأنزيمية، يشابك الفيبرين من تنشيط XIIIa عامل التخثر خلال عملية نضوج جلطة. يستخدم النهج القائم التصوير المقطعي المحسوبة الدقيقة (microCT) جزيئات الذهب التي تسعى خثرة (AuNPs) functionalized لاستهداف المكون الرئيسي للجلطة: الفيبرين. وتصف هذه الورقة بروتوكول مفصلة للمجتمعة في الجسم الحي microCT وخارج الحي NIRF التصوير thromboemboli في نموذج الفأر من السكتة الدماغية الصمية. وتبين لنا أن في الجسم الحي </ م> microCT وAuNPs-غليكول الشيتوزان المستهدفة الفيبرين (أكذوبة-GC-AuNPs) يمكن استخدامها لتصور كل من الجلطات الدماغية والجلطة الدموية الموقع صمي. وصفنا أيضا استخدام في الجسم الحي القائم microCT التصوير خثرة المباشرة لمراقبة متسلسل الآثار العلاجية للمنشط نسيج الجلطات بوساطة المنشط. بعد جلسة التصوير الأخيرة، علينا أن نظهر من خارج الحي NIRF تصوير مدى وتوزيع thromboemboli المتبقية في الدماغ. وأخيرا، نحن تصف صورة الكمية تحليل البيانات التصوير microCT وNIRF. تقنية الجمع بين التصوير خثرة المباشر تتيح طريقتين مستقلة التصور الجلطة يمكن مقارنتها: مجال إشارة الفلورسنت ذات الصلة خثرة على فيفو السابقين NIRF التصوير مقابل حجم الجلطة الدموية hyperdense microCT في الجسم الحي.

المقدمة

وسيكون أحد في 6 أشخاص إصابة بسكتة دماغية في مرحلة ما من حياتهم. السكتة الدماغية هي حتى الآن نوع السكتة الدماغية الأكثر شيوعا، وتشكل نحو 80 في المئة من جميع حالات السكتة الدماغية. لأن thromboemboli تسبب معظم هذه الجلطات الدماغية، وهناك اهتمام متزايد في مجال التصوير خثرة المباشر.

وتشير التقديرات إلى أن حوالي 2000000 خلايا المخ تموت خلال كل دقيقة من وسط انسداد الشريان الدماغي 1، مما أدى إلى شعار "الوقت هو الدماغ". التصوير المقطعي (CT) دراسات يمكن القيام به بسرعة، وتتوفر على نطاق واسع. لهذا السبب، لا تزال CT التصوير من خيار لتشخيص وعلاج السكتة الدماغية المفرط الحدة الأولي. CT هو قيمة خاصة لإعلام القرارات الحرجة الأولى: إدارة منشط منشط نسيج (TPA) لالجلطات و / أو triaging إلى اللف تكوين جلطة دموية استرجاع 2. الحالي القائم على CT خثرة التصوير، ومع ذلك، لا يمكن أن تتبع متسلسل الشللل thromboemboli في الجسم الحي، لأنه يستخدم وسائل غير مباشرة للتدليل الجلطة الدموية: بعد عتامة تجمع الدم على النقيض من ذلك المعالج باليود، وأظهر الجلطة الدموية كما شغل عيوب في الأوعية. هناك حدود ومخاطر الجرعة يرتبط مع الادارة المتكررة على النقيض من ذلك المعالج باليود، الذي يحول دون تكرار التصوير من الجلطة الدموية في هذه الطريقة.

وبالتالي، هناك حاجة ماسة لمنهجية التصوير المباشر للخثرة الدماغية في مرضى السكتة الدماغية، للسماح أسرع والقرارات معاملة أفضل في هذا الشأن. نقترح لتحقيق ذلك من خلال تعزيز قيمة CT، المستخدمة حاليا طريقة التصوير في الخطوط الأمامية للسكتة الدماغية، مع استخدام nanoparticular وكيل التصوير الجزيئي تسعى الجلطة.

لقد أثبتنا استخدام هذا العامل باستخدام المحسوبة الصغيرة التصوير المقطعي (microCT)، عالية الدقة خارج الجسم الحي أو في الجسم الحي (حيوان صغير) نسخة تصوير CT التي تسمح الحصول على البيانات السريع <سوب> 3،4. حتى مع الفقراء نسبيا على النقيض من الأنسجة اللينة متاحة للmicroCT الحيوانات الصغيرة (أسوأ بكثير مما كان متاحا من الماسحات الضوئية الإنسان الحجم)، وكان وكيل التصوير قادرا على السعي وبمناسبة الجلطة الدموية بجعلها hyperdense على CT، وهو 'علامة سفينة كثيفة "تتعزز الجزيئية التصوير.

واستكمالا لتقنية CT، وقد وضعت مجموعتنا من قبل تقنية خثرة التصوير مباشرة البصرية باستخدام Cy5.5 الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIRF) التحقيق لتصور عبء الجلطة الدماغية 5. هذا هو أسلوب خارج الجسم الحي على بعد الوفاة العقول، ولكنها حساسة للغاية، ويعمل على تأكيد في البيانات المجراة في إعداد البحوث.

وجود كل المقطعية وNIRF أساس تقنيات التصوير التي تسعى خثرة يسمح لنا مقارنة وهذه التقنيات الحصول على بيانات غنية بالمعلومات حول دور خثرة والتصوير خثرة في عملية التنمية السكتة الدماغية.

Hيحرث، وصفنا بروتوكول مفصلة من تقنية الجمع في الجسم الحي microCT وخارج الحي NIRF التصوير لتصور مباشرة thromboemboli في نموذج الفأر من السكتة الدماغية الصمية. هذه أساليب بسيطة وقوية ومفيدة لتعميق فهمنا للأمراض الجلطات من خلال تمكين دقة في تقييم المجراة من الجلطة عبء / توزيع وتوصيف تطور خثرة الديناميكي بطريقة سريعة والكمية في الجسم الحي أثناء العلاج، تليها خارج الحي البيانات التي تخدم كما تحكم والمعيار المرجعي للتأكيد في الجسم الحي نتائج التصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تم استعراض جميع الإجراءات الحيوانية موضح في هذا البروتوكول والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان مستشفى Ilsan جامعة دونغ وأجرى وفقا للمبادئ والإجراءات المبينة في دليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات.

1. إعداد خارجيا تكونت جلطة إعتبر مع الإسفار علامة (الشكل 1)

  1. تخدير الماوس في غرفة تحريض باستخدام 3٪ الأيزوفلورين مختلطة مع 30٪ من الأكسجين (1.5 لتر / دقيقة 100٪ الأكسجين). ضمان عمق كاف من التخدير من خلال مراقبة قوة العضلات ويؤكد عدم وجود منعكس قرصة أخمص قدميه.
  2. وضع الحيوان على ثنى العقيمة في موقف المعرضة، وابقائه تحت التخدير باستخدام قناع استنشاق و 2٪ الأيزوفلورين مختلطة مع 30٪ من الأكسجين. تنفيذ الإجراءات التالية باستخدام تقنيات العقيم ومعقمة العباءات / أقنعة / القفازات / الصكوك. الحفاظ على ظروف معقمة عن طريق تنظيف وتعقيم المنطقة التجريبية مع 70٪ من الكحول قبلالثانية بعد الإجراءات.
  3. جمع الدم حوالي 300 ~ 1000 ميكرولتر الشرياني بعد ثقب في القلب 6. مزيج 70 ميكرولتر من الدم الكامل مع 30 ميكرولتر C15 التحقيق 5 (20 مكرومول / تركيز L)، تحقيق Cy5.5 فلوري حساسة للالنشاط يشابك الفيبرين من عامل تنشيط الثالث عشر (FXIIIa) انزيم التخثر، وذلك بمناسبة fluorescently الجلطة (الشكل 1A ). حقن الدم المختلط باستخدام حقنة 3 مل (23 إبرة قياس) في أنبوب البولي اثيلين 20 سنتيمترا (PE-50، الرقم 0.58 ملم). يجب تعقيم PE أنابيب (أو شهادة عقيمة من قبل الشركة المصنعة) ويجب أن يكون مستعدا للجلطات جو معقم و مطهر في نسيج الثقافة هود.
  4. تحقق من وفاة الحيوان من خلال ملاحظة عدم وجود التنفس والنبض القلبي.
  5. ترك الأنبوب محملة الدم في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة، ثم في 4 درجة مئوية لمدة 22 ساعة، وتنفيذ الإجراءات التالية، كما ذكرت سابقا 7.
  6. قطع أنبوب يحتوي على خثرة إلى قطع 1.5 سم طويلة. باستخدام حقنة 3 مل مليئة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وطرد خثرة على برنامج تلفزيوني التي تحتوي على لوحة 6 جيدا عن طريق حقن بلطف PBS إلى كل قطعة من الأنبوب. غسل جلطات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (الشكل 1B).
  7. تحميل جزء نهاية البعيدة من 15 سم طويلة PE-10 أنبوب (ID 0.28 ملم) مع خثرة 1.5 سم طويلة عن طريق رسم بعناية خثرة غسلها، مع تجنب فقاعات الهواء، وذلك باستخدام حقنة 1 مل مليئة المالحة مع 30 إبرة قياس التي يتم إدراجها في نهاية القريبة من الأنبوب.
  8. ربط PE-10 أنبوب محملة خثرة مع 3 سم PE-50 أنبوب (ID 0.58 ملم) معدلة لديك نهاية مدبب (ID 200 ميكرون)، والتي سيتم وضعها على الشريان الدماغي الأوسط (مولودية الجزائر) - الأمامي الدماغي منطقة الشريان (ACA) التشعب من الشريان السباتي الداخلي (ICA) في نموذج الفأر من السكتة الدماغية الصمية (الشكل 1C).

2. النمذجة نموذج الفأر من السكتة الدماغية الانصمام الخثاري (الشكل 2)

  1. Anesthetizعصام ماوس مختلفة إلى أن القوية كما ذكرت سابقا 7 في غرفة الاستقراء باستخدام 3٪ الأيزوفلورين مختلطة مع 30٪ من الأكسجين (1.5 لتر / دقيقة). حقن ميلوكسيكام (5 ملغ / كلغ) تحت الجلد لتخفيف الألم بعد الجراحة. ضمان عمق كاف من التخدير من خلال مراقبة قوة العضلات ويؤكد عدم وجود منعكس قرصة أخمص قدميه.
  2. تنطبق على كمية صغيرة من مرهم البيطرية إلى كل عين لمنع جفاف أثناء التخدير. إجراء العمليات الجراحية التالية باستخدام تقنيات العقيم ومعقمة العباءات / أقنعة / القفازات / الصكوك. الحفاظ على ظروف معقمة عن طريق تنظيف وتعقيم المنطقة الجراحية مع 70٪ من الكحول قبل وأثناء وبعد الجراحة.
  3. تحريك الماوس إلى جدول التشغيل. وضع الحيوان على ثنى العقيمة في موقف المعرضة، وابقائه تحت التخدير باستخدام قناع استنشاق و 2٪ الأيزوفلورين. ثم، المشبك درجة حرارة الجسم عند 36.5 درجة مئوية باستخدام بطانية homeothermic مع ردود الفعل من ميزان حرارة المستقيم.
  4. بعد surgiكال الإعدادية مع betadine والكحول 70٪، وجعل شق عمودي 1 سم باستخدام مشرط على فروة الرأس بين الأذن اليسرى والعين. الغراء النهاية البعيدة من الألياف البصرية من مقياس الجريان دوبلر الليزر على سطح العظم الصدغي تركت مكشوفة (1 ملم اليسار و4 مم أسفل من bregma). ثم، تبدأ دوبلر مراقبة تدفق (الشكل 2A).
  5. وضع الحيوان. تصويب الرقبة من خلال سحب على الأسنان الأمامية العلوية مع سلسلة تعلق على دبوس وحلق منطقة الرقبة. ثم، وجعل 3 سم خط الوسط العمودي شق، انتشر مفتوحة، وفضح منطقة مبة السباتي الأيسر من تشريح الأنسجة الرخوة المحيطة الأوعية الدموية. احرص على عدم إصابة العصب المبهم.
  6. Ligate اليسار القريب الشريان السباتي المشترك (CCA) باستخدام معقمة 6-0 خياطة الحرير الأسود، وligate في ICA اليسار والشريان الحنكي الأيسر (PPA) باستخدام معقم 7-0 خيوط الحرير الأسود.
  7. يكوي اليسار الشريان الغدة الدرقية، والتي هي فرع من باليود الشريان السباتي الخارجي الأيسرنانوغرام والكي الكهربائي أحادي القطب، وligate اليسار القريب الشريان السباتي الخارجي (ECA) فضفاضة وموقع أكثر البعيدة بإحكام باستخدام معقم 7-0 خيوط الحرير الأسود.
  8. باستخدام مقص الصغرى، وجعل ثقب صغير (حوالي 0.2 ~ 0.25 ميكرون قطر) بين المواقع ligated من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا.
  9. إدراج القسطرة التي تحتوي على خثرة في حفرة في اللجنة الاقتصادية لأفريقيا في حين تخفيف ربط اللجنة الاقتصادية لأفريقيا الداني. تشديد ربط اللجنة الاقتصادية لأفريقيا الداني مرة أخرى بعد دفع القسطرة في التقييم القطري المشترك من أجل حزام السرج القسطرة في مكان.
  10. كوى إلى قطع جزء من القاصي اللجنة الاقتصادية لأفريقيا، والذي هو بعيد عن موقع ربط القاصي والداني تدوير اللجنة الاقتصادية لأفريقيا المجانية في اتجاه عقارب الساعة لمحاذاته إلى اتجاه ICA حين سحب القسطرة من التقييم القطري المشترك. ثم، ودفع القسطرة حوالي 9 مم في MCA - منطقة التشعب ACA من ICA البعيدة فورا بعد فك ربط ICA. ثم، وتشديد ربط ICA.
  11. وضع خثرة في منطقة التشعب التي كتبها بلطفالضغط على حقنة 1 مل لحقن الجلطة. تحقق انخفاض دوبلر تدفق الدم إلى المخ (البرازيلي)، الذي ينبغي تخفيض بنسبة 30٪ أو أقل بالمقارنة مع خط الأساس، وإذا كانت الجلطة المغطي بنجاح السفينة (الشكل 2B).
  12. إزالة القسطرة، وligate موقع اللجنة الاقتصادية لأفريقيا الداني على الفور وبإحكام. وبالإضافة إلى ذلك، unligate التقييم القطري المشترك والمؤسسة العامة للتقاعد.
  13. إغلاق موقع شق باستخدام 6-0 خيوط الحرير. وقف التخدير بعد استمرار رصد دوبلر على مدى فترة زمنية المطلوب (هنا، لمدة 30 دقيقة بعد الحقن خثرة). عودة الماوس في قفص فارغ، وإبقائه دافئا مع مصباح التدفئة. لا تترك الماوس غير المراقب حتى اكتسب الوعي الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصية.

3. في فيفو MicroCT التصوير الدماغي من الجلطة (الشكل 3)

  1. إعادة تخدير الماوس مع 2٪ الأيزوفلورين كما هو موضح في الخطوة 2.1 في وقت نقطة محددة مسبقا (هنا، 1 ساعة) بعد بدايةمن السكتة الدماغية صمية بسبب وضع الجلطة في الشريان الدماغي. ضمان عمق كاف من التخدير من خلال التأكيد على عدم وجود منعكس قرصة أخمص قدميه. تنطبق على كمية صغيرة من مرهم البيطرية إلى كل عين لمنع جفاف أثناء التخدير.
  2. و resuspend المستهدفة الفيبرين جزيئات الذهب (أكذوبة-GC-AuNP 4) بتركيز 10 ملجم الاتحاد الافريقي / مل في 10 ملي برنامج تلفزيوني، ويصوتن وكيل خثرة التصوير لمدة 30 دقيقة لضمان حل وتشتت الجسيمات النانوية. ضخ 300 ميكرولتر أكذوبة-GC-AuNP (10 ملغ / مل) في الوريد القضيب.
  3. وضع الحيوان على السرير آلة microCT، وتصويب الرقبة عن طريق سحب الأسنان الأمامية العلوية مع سلسلة تعلق على دبوس للحد من الحركة الفنية.
  4. في 5 دقائق بعد حقن أكذوبة-GC-AuNP، والبدء في الحصول على صور microCT من الدماغ. لوصف التجارب هنا، استخدم المعلمات التصوير التالية: 65 KVP، 60 أمبير، 26.7 X 26.7 X 27.9 مم 3 مجال الرؤية، 0.053 س 0.053 س 0.054 مم 3 حجم فوكسل، 100 مللي ثانية لكل إطار، 1 المتوسط، 360 وجهات النظر، 512 × 512 إعادة الإعمار مصفوفة، 600 شرائح، 64 ثانية وقت الفحص.
  5. عودة الماوس في قفص فارغ، وإبقائه دافئا مع مصباح التدفئة. لا تترك الماوس غير المراقب حتى اكتسب الوعي الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصية.
  6. تحويل البيانات الخام إلى صورة التصوير الرقمي والاتصالات في شكل الطب (DICOM) باستخدام الأمر "ابدأ" لوحة "إعادة الإعمار" في مجموعة من البرامج المثبتة على الماسح الضوئي microCT.
  7. لالكمي لتحليل الصور (في الخطوة 6)، وتحويل البيانات DICOM إلى صيغة TIFF باستخدام مجموعة من البرامج المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  8. لالنوعي تحليلات وكذلك تحليل كمي في طريقة أسهل وأسرع، واستخدام حزمة البرامج والأصلي 0.054 مم الصور سميكة في شكل DICOM لتوليد مجموعة جديدة منصور المحورية والاكليلية المقدمة الى 1 أو 2 مم (هنا، 2 مم) سمك، على النحو التالي.
    1. حدد المجلد DICOM على شجرة في "مصدر البيانات"، انقر فوق الزر الأيمن للماوس، واستيراد المجلد إلى "MasterDB 'أو' PrivateDB".
    2. انقر على "MasterDB 'أو' PrivateDB" في الشجرة "مصدر البيانات"، وحدد المجلد المستوردة. بعد النقر فوق علامة التبويب "3D" على أقصى اليسار لوحة، عندما يظهر نافذة "خيارات تحميل 'حتى، اضغط على" موافق "لاستيراد سلسلة من الصور في المجلد مثل كومة.
    3. تغيير تمثيل صورة لشكل أقصى كثافة الإسقاط (MIP) بالضغط على كلمة "جواز سفر يقرأ إلكترونيا" في محوري والنوافذ صورة الاكليلية واختيار 'MIP "من القائمة المنبثقة. ثم، تغيير سماكة الصورة ل2 مم بعد النقر فوق "TH: 0 [مم] 'في نفس النوافذ.
    4. عن طريق عرض 3D 2 مم ناشريط vigator التي تسمح لاستكشاف رصة صور وتقطيع عليه في زاوية، والمكان المناسب، وإعداد 2 ملم محوري سميك قسم صورة مع التغطية الكاملة لدائرة ويليس (البقرة)، والتي تؤوي الجلطة الدموية. انقر على زر التقاط (رمز الكاميرا) على لوحة "الناتج". حفظ الصورة في تنسيق TIFF.
  9. ثم، وإعداد خمسة 2 مم الاكليلية قسم الصور التي تغطي متاخم من الفص الجبهي لالمخيخ.
    1. أولا، وإعداد شريحة الثانية عن طريق مواءمة بعناية شريط الملاح على الصورة المحورية بحيث تكون الصورة الاكليلية يمكن أفضل تصور MCA - الجلطة الدموية ACA.
    2. التالي، وإعداد أربع شرائح أخرى بطريقة متجاورة. انقر على زر التقاط (رمز الكاميرا) على لوحة "الناتج". حفظ الصور في شكل TIFF.

4. الجلطات وفي فيفو MicroCT التصوير الدماغي من الجلطة (الشكل 3)

  1. إعداد 100 سم PE-10 أنبوب بإبرة قياس 30 على نهاية واحدة وحقنة 1 مل على الطرف الآخر. ملء الأنبوب مع أي المالحة (600 ميكرولتر) أو منشط البلاسمينوجين النسيجي (هنا، 24 ملغ / كغ، 600 ميكرولتر) مع تجنب فقاعات الهواء.
  2. إعادة تخدير الماوس كما هو موضح في الخطوة 2.1. إدراج غيض إبرة داخل الوريد القضيب من الحيوان. وضع الحيوان بعناية على السرير الجهاز microCT. ثم، شل وتحقيق الاستقرار في جزء حقن عن طريق الوريد للنظام القسطرة عن طريق تسجيل إلى السرير.
  3. إجراء دورة التصوير المتابعة حسب خط الأساس قبل العلاج. ثم، حقن إما 60 ميكرولتر ملحي أو منشط البلاسمينوجين النسيجي بالضغط على المكبس حقنة في نظام القسطرة. بعد حقن البلعة، والبدء في ضخ الحل المتبقية (540 ميكرولتر) على مدى فترة من الزمن (هنا، 30 دقيقة).
  4. الحصول على صور microCT باستخدام نفس المعلمات كما في الخطوة 3.4 في وقت نقاط محددة مسبقا: هنا، في 3 و 24 ساعة بعد الحقن البلعة. إلى القيام بما يلي خارج الحي NIRF thromالتصوير حافلة من الدماغ، والموت ببطء الحيوان تحت التخدير عن طريق خلع عنق الرحم.

5. فيفو السابقين NIRF الجلطة التصوير وثلاثي فينيل كلوريد نتروبلو (TTC) تلون أنسجة المخ (الشكل 4)

  1. بعد قطع الرأس، وإزالة فروة الرأس وقطع طريق الجمجمة مع مقص من ماغنوم الثقبة تصل نحو الدرز السهمي. إزالة قبو الجمجمة عن طريق رفع بعناية حواف الجمجمة قطعي باستخدام مقص مع تجنب إصابة في الدماغ الكامنة، وبالتالي تعرية نصفي الكرة الأرضية.
  2. قطع الأعصاب البصرية في قاعدة الدماغ في أقرب وقت ممكن لسطح الدماغ، لأنها يمكن أن تتداخل مع دائرة الشرايين ويليس الذي يجب تصوره على التصوير NIRF. ثم، من أجل وضع تصور واضح لY-شكل "MCA / ACA / القاصي ICA" للتصوير NIRF خثرة، قطع تنفيذ اتفاقيتي البعيدة إلى أقصى حد ممكن لسطح الدماغ بعد ضغط بلطف على قاعدة للدماغ لفضح عشرنقاط القطع الإلكترونية (الشكل 4A).
  3. أداء NIRF التصوير (الإثارة / الانبعاثات، 675/690 نانومتر (1)؛ التعرض ثانية) من أنسجة المخ إزالتها مع قاعدتها إلى الارتفاع (الشكل 4B، C)، والذي يتصور thromboemboli fluorescently المسمى في شرايين البقرة (الشكل 4D) . ثم، نفذ التصوير إضافي مع قمة الرأس من الدماغ إلى الارتفاع، والذي يتصور thromboemboli القشرية. تجنب جفاف الدماغ عن طريق وضع بضع قطرات من المياه المالحة على الأنسجة.
  4. باستخدام جهاز مصفوفة الدماغ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، بسرعة إعداد شرائح سميكة الدماغ 2 مم coronally: 6 قطع من 2 ملم شرائح سميكة (2.3، 0.3، -1.7، -3.7، -5.7 ملم من bregma). تجنب تجفيف شرائح الدماغ باستخدام قطرات المياه المالحة، وأداء NIRF التصوير من كل من الجبهة والسطح الخلفي للأقسام.
  5. وضع شرائح الدماغ في 2٪ ثلاثي فينيل كلوريد نتروبلو (TTC) حل لمدة 20 دقيقة، مع تجنب التعرض لمن lighت. بعد ذلك، نقل الشرائح في 4٪ محلول الفورمالديهايد في 4 درجات مئوية، مع تجنب التعرض للضوء.

6. الكمي لجلطة منطقة عن طريق الصور MicroCT ويماغيج (1.49d) البرمجيات (الشكل 5)

  1. صور المفتوحة (الشكل 5A).
    1. فتح ملفات تسلسل الصور لإنشاء ملف كومة عن طريق اختيار "ملف> استيراد> صورة تسلسل 'أو' ملف> فتح". تحويل الصور الى الرمادي 8-بت باستخدام "صورة> نوع> 8 بت.
  2. تحويل وحدة من بوصة إلى ملليمتر (الشكل 5A).
    1. عندما يقابل بكسل واحد من ملفات الصور المقطعية إلى 0.053 ملم، واستخدام "تحليل> مقياس مجموعة 'للدخول' 1 '،' 0.053 '، و' مم 'ل' بعد في بكسل '،' المسافة المعروفة"، و "وحدة طول '، على التوالي.
    2. عندما (فقط) على شريط المقياس هو متاح،باستخدام أداة "خط مستقيم" رسم خط مع طوله مساو لحجم شريط. ثم، استخدم "تحليل> مقياس مجموعة 'لدخول طول شريط الحجم في المليمتر.
  3. الطرح الخلفية (الشكل 5B)
    1. باستخدام 'تحرير> اختيار> تحديد "مكان منطقة دائرية أو مستطيلة ذات الاهتمام (ROI) على مساحة لحمة الدماغ دون خثرة أو المناطق hyperdense ذات الصلة العظام. لأن العائد على الاستثمار المحدد ينطبق على كل شريحة من المكدس، تحقق للتأكد من إذا لم يتم تتداخل مع المناطق hyperdense في كل شريحة.
    2. اختر 'البرنامج المساعد> العائد على الاستثمار> BG الطرح من العائد على الاستثمار "، وأدخل 2.0 ل' عدد من الانحراف القياسي عن المتوسط".
  4. تجزئة من الآفات Hyperdense المتعلقة Thromboemboli (الشكل 5C)
    1. اختر 'صورة> ضبط> العتبة "، وأدخل قيم" لوور مستوى عتبة "و" مستوى العتبة العليا "إلى 22 و 255 على التوالي. اختر 'أكثر / أقل من' لعرض بكسل أقل من قيمة عتبة أدنى في الزرقاء، بكسل thresholded في الرمادي، وبكسل فوق قيمة العتبة العلوية باللون الأخضر.
    2. استخدام 'حر اختيار أداة "لرسم رويس التي تحيط الآفات hyperdense المتعلقة thromboemboli دون بما في ذلك المناطق العظمية. أثناء الرسم، والحفاظ على الضغط إما [التحول] أو [بديل] لإضافة أو إزالة المنطقة، على التوالي.
      ملاحظة: إذا الآفات الانصمام الخثاري hyperdense بعيدة من الهياكل العظمية، بدلا من 'حر أداة التحديد'، 'أداة العصا "يمكن استخدامها بأمان دون تغيير في مستوى' التسامح '.
  5. الكمي للآفات مقطع (الشكل 5D)
    1. استخدام "تحليل> القياسات تعيين" لاختيار 'المنطقة'، 'يعني رمادي القيمة "، و" الكثافة المتكاملة (المنطقة X متوسط)9 ؛. التحقق من الخيارات التالية: "الحد الى عتبة" و "العرض تسمية". استخدام "تحليل> قياس" للحصول على البيانات الكمية. ثم، حفظ النتائج كملف ". XLS".
    2. حفظ الملف المكدس في تنسيق TIFF. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام "تحليل> أدوات> مدير العائد على الاستثمار" لإنقاذ رويس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

صور الأساس microCT، حصلت في الجسم الحي بعد إدارة أكذوبة-GC-AuNP (10 ملغ / مل، 300 ميكرولتر) في 1 ساعة بعد السكتة الدماغية الصمية، تصور بوضوح الجلطة الدماغية في MCA - ACA منطقة التشعب من الشريان السباتي الداخلي البعيدة (الشكل 6 ). وأظهرت المتابعة التصوير microCT أي تغيير في خثرة البقر مع العلاج المالحة. ومع ذلك، والمعاملة مع منشط البلاسمينوجين النسيجي أظهرت حل التدريجي للخثرة البقرة (السهام الزرقاء في الشكل 6).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أثبتنا استخدام اثنين من تقنيات التصوير الجزيئي التكميلية للتصوير خثرة المباشر في نماذج تجريبية من السكتة الدماغية الصمية: الليفين استهدف الذهب جسيمات متناهية الصغر (أكذوبة-GC-AuNP) في الجسم الحي التصوير القائم على microCT، وFXIIIa المستهدفة التحقيق التصوير الضوئي لالسابقين فيفو التصوير الفلورسنت.

بعد الوريد من أكذوبة-GC-AuNPs، أصبحت الجلطة الدموية مرئية للCT عن الهياكل كثيفة، والناجمة عن الجسيما...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

DE.K.، JY.K، CH.A، وKK هي أصحاب براءات الاختراع للجسيمات متناهية الصغر من الذهب المستهدفة الفيبرين (10-1474063-0000، الكورية للملكية الفكرية مكتب). الكتاب المتبقية ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل كوريا الرعاية الصحية والتكنولوجيا R & مشروع التطوير، وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية (HI12C1847، HI12C0066)، وبرنامج الحيوية والعلوم الطبية التنمية (2010-0019862) وبرنامج مختبر الأبحاث العالمية الخاضعة للتفتيش (جبهة الخلاص الوطني، 2015K1A1A2028228) من مؤسسة البحوث الوطنية، بتمويل من الحكومة الكورية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
< قوية > آلات < / قوية >
microCTNanoFocusRay ، جيونجو ، كورياNFR نظام التصوير Polaris-G90
NIRFRoper-Scientific ، Tucson ، AZcoolsnap-Ez
Laser Doppler مقياس الجريانPerimed ، ستوكهولم ، السويدنظام PeriFlux 5000
مجهر جراحيLeica Microsystems ، سيول ، كورياEZ4HD
آلة التخدير الاستنشاقيةPerkinElmer ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةXGI-8
Software< / قوي >
NFR التحكمNanoFocusRay ، JeonJu ، كورياNFR Polaris-G90microCT برنامج التحكم
LucionInfinitt ، سيول ، كورياLucion3D تقديم برنامج التصوير
مخطط المختبر 7ADnstruments ، كولورادو ، الولايات المتحدة الأمريكيةمخطط المختبر 7rCBF
ImageJ برنامجWanye Rasband ، المعاهد الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة الأمريكية1.49dتحليل التصوير
الأجهزة / الأدوات
مضخة التسريبهارفارد ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةمضخة 22 (55-2226)
بطانية حراريةمنزلية Panlab ، برشلونة ، إسبانياHB101
كي الجيبدايجونج ، سيول ، كورياDJE-39
ماتريكوس الدماغتيد بيلا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية15003القسم الإكليلي
PE-50 أنابيبناتسومي ، طوكيو ، اليابانSP-45 (PE-50)معرف 0.58 مم OD 0.96 مم
PE-10 أنابيبNatsume ، طوكيو ، اليابانSP-10 (PE-10)معرف 0.28 مم OD 0.61 مم
30 مقياس إبرةsungshim-medical ، سيول ، كوريا
حقنةCPL-Medical ، أنسان ، كوريا1 و 3 سم مكعب
شاشباناميديك ، تشونان ، كوريا
الشريطسكوتش ، سيول ، كوريا3M-810
ملقط صغيرأدوات العلوم الدقيقة ، فانكوفر ، كندا& nbsp ؛ 11253-27Dumont #L5
المقص الصغير، فانكوفر ، كندا15000-03Vannas Spring
ScissorFine Science Tools ، فانكوفر ، كندا14084-088.5 سم
خياطة حريرية سوداءAilee ، بوسان ، كورياSK6071 ، SK7286-0 و 7-0
Recodes< / strong>
meloxicamيوهان ، سيول ، كوريا
مرهم بيطرينوفارتيس ، بازل ، سويسرا
10٪ بوفيدون اليود (بيتادين)فيرسون ، تشون آن ، كوريا
FeCl 3< / sub>سيجما ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية157740-5G
TTCAmresco ، أوهايو ، الولايات المتحدةالأمريكية 0765-100g
IsofluraneHana-Pham ، Gyeonggi ، كورياIfran100 مل
PBSWelgene ، Daegu ، كورياLB001-02500 مل
جزيئاتالتوليف
C15 عاملالتوليف
منشط البلازمينوجين للأنسجةBoehringer Ingelheim ، Biberach ، ألمانياrtPA (أكتيليز)20 مجم
محلول ملحي عاديDaihan Pham ، سيول ، كوريا48N3AF320 مل
أدوات العلوم الدقيقة الذهب النانوية بصري

المراجع

  1. Saver, J. L. Time is brain--quantified. Stroke. 37 (1), 263-266 (2006).
  2. Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
  3. Kim, D. E., et al. Hyperacute direct thrombus imaging using computed tomography and gold nanoparticles. Ann Neurol. 73 (5), 617-625 (2013).
  4. Kim, J. Y., et al. Direct Imaging of Cerebral Thromboemboli Using Computed Tomography and Fibrin-targeted Gold Nanoparticles. Theranostics. 5 (10), 1098-1114 (2015).
  5. Kim, D. E., et al. Direct thrombus imaging as a means to control the variability of mouse embolic infarct models: the role of optical molecular imaging. Stroke. 42 (12), 3566-3573 (2011).
  6. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  7. Durukan, A., Tatlisumak, T. Animal models of ischemic stroke. Handbook of clinical neurology: Stroke Part 1: Basic and epidemiological aspects.Volume 92. Fisher, M. 92, Elsevier. 43-66 (2009).
  8. Overoye-Chan, K., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J Am Chem Soc. 130 (18), 6025-6039 (2008).
  9. Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
  10. Tung, C. H., et al. Novel factor XIII probes for blood coagulation imaging. Chembiochem. 4 (9), 897-899 (2003).
  11. Robinson, B. R., Houng, A. K., Reed, G. L. Catalytic life of activated factor XIII in thrombi. Implications for fibrinolytic resistance and thrombus aging. Circulation. 102 (10), 1151-1157 (2000).
  12. Reed, G. L., Houng, A. K. The contribution of activated factor XIII to fibrinolytic resistance in experimental pulmonary embolism. Circulation. 99 (2), 299-304 (1999).
  13. Sun, I. C., et al. Biocompatible glycol chitosan-coated gold nanoparticles for tumor-targeting CT imaging. Pharm Res. 31 (6), 1418-1425 (2014).
  14. Celi, A., et al. Thrombus formation: direct real-time observation and digital analysis of thrombus assembly in a living mouse by confocal and widefield intravital microscopy. J Thromb Haemost. 1 (1), 60-68 (2003).
  15. Chen, I. Y., Wu, J. C. Cardiovascular molecular imaging: focus on clinical translation. Circulation. 123 (4), 425-443 (2011).
  16. Wintermark, M., et al. Imaging recommendations for acute stroke and transient ischemic attack patients: a joint statement by the American Society of Neuroradiology, the American College of Radiology and the Society of NeuroInterventional Surgery. J Am Coll Radiol. 10 (11), 828-832 (2013).
  17. Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. Jr In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
  18. Narayanan, S., et al. Biocompatible magnetite/gold nanohybrid contrast agents via green chemistry for MRI and CT bioimaging. ACS Appl Mater Interfaces. 4 (1), 251-260 (2012).
  19. Amendola, V., et al. Magneto-plasmonic Au-Fe alloy nanoparticles designed for multimodal SERS-MRI-CT imaging. Small. 10 (12), 2476-2486 (2014).
  20. Zhu, J., et al. Synthesis of Au-Fe3O4 heterostructured nanoparticles for in vivo computed tomography and magnetic resonance dual model imaging. Nanoscale. 6 (1), 199-202 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة