Method Article

ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

DOI:

10.3791/54300

⸱

September 27th, 2016

 ,  , 
1Department of Plant Sciences, University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon, University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, Knoxville

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوصف منهجية الإنتاجية العالية، الآلي، إنتاج البروتوبلازم التبغ والتحول. النظام الآلي يمكن التعبير الجيني الموازي واسع والاكتشاف في نظام نموذجي BY-2 التي ينبغي أن تكون للترجمة للمحاصيل غير النموذجية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى العقد الماضي كان هناك تجدد في استخدام جبلة مجردة النباتية التي تتراوح بين الأنواع نموذج لاقتصاص أنواع، لتحليل مسارات نقل الإشارة والشبكات التنظيمية النسخي، التعبير الجيني، الجينوم التحرير، والجينات إسكات. وعلاوة على ذلك، تم إحراز تقدم كبير في تجديد النباتات من جبلة مجردة، التي ولدت المزيد من الاهتمام في استخدام هذه النظم لعلم الجينوم المصنع. في هذا العمل، وقد تم وضع بروتوكول لأتمتة العزلة البروتوبلازم والتحول من 2 (BY-2) ثقافة تعليق التبغ "الأصفر الساطع" باستخدام منصة الروبوتية. تم التحقق من صحة إجراءات التحول باستخدام البرتقال ببروتين (النفط مقابل الغذاء) مراسل الجين (pporRFP) تحت سيطرة المروج القرنبيط فيروس تبرقش 35S (35S). وأكد التعبير النفط مقابل الغذاء في جبلة مجردة بواسطة المجهر epifluorescence. شملت التحليلات أيضا الأساليب كفاءة الإنتاج البروتوبلازم باستخدام propidiuم يوديد. وأخيرا، تم استخدام منخفضة التكلفة الإنزيمات للمأكولات لإجراء البروتوبلازم العزلة، التحايل على الحاجة إلى مختبر الصف الانزيمات التي هي في الإنتاجية العالية الآلي العزلة البروتوبلازم وتحليل باهظة التكلفة. على أساس بروتوكول المتقدمة في هذا العمل، ويمكن إجراء الإجراء الكامل من العزلة البروتوبلازم إلى تحول في أقل من 4 ساعات، من دون أي مساهمة من المشغل. في حين تم التحقق من صحة بروتوكول المتقدمة في هذا العمل مع ثقافة الخلية BY-2، وينبغي أن تكون الإجراءات والأساليب للترجمة إلى أي ثقافة تعليق مصنع / نظام بروتوبلازمي، والتي ينبغي تمكين تسريع الأبحاث الجينومية المحاصيل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة كان هناك زخم كبير وضعت على تصميم المحاصيل المعدلة وراثيا للتغلب على الأمراض المختلفة 1، منح مقاومة مبيدات الأعشاب 2، منح الجفاف 3،4 والتسامح الملح 5، ومنع الحيوانات العاشبة 6، وزيادة العائد الكتلة الحيوية 7، وتقليل جدار الخلية عناد 8. وقد ساعد هذا الاتجاه من خلال تطوير أدوات جزيئية جديدة لتوليد النباتات المعدلة وراثيا، بما في ذلك الجينوم التحرير باستخدام كريسبر وTALENs 9، والجينات إسكات من خلال الرنا المزدوج الجديلة 10، ميرنا 11، وسيرنا 12. في حين أن هذه التقنيات وتبسيط جيل من النباتات المع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إنشاء الثقافات خلية تعليق

  1. تحضير السائل BY-2 وسائل الاعلام من خلال إضافة 4،43 ز Linsmaier وسكوغ وسائل الإعلام بصل، 30 غرام من السكروز، 200 ملغ KH 2 PO 4، و 200 ميكروغرام من 2،4-ثنائي كلورو فينوكسياسيتين حمض (2،4-D) إلى 900 مل من المقطر المياه ودرجة الحموضة إلى 5.8 مع 0.1 M KOH. بعد تعديل درجة الحموضة، وضبط الحجم النهائي إلى 1000 مل بالماء المقطر والأوتوكلاف. وسائل الاعلام ويمكن تخزين تصل إلى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية.
  2. تطعيم قارورة 250 مل مخروطي مع 100 مل من السائل B....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الدراسة الحالية، فإن معدل مضاعفة BY-2 تباينت 14-18 ساعة تعتمد على درجة الحرارة التي حضنت الثقافات، بما يتفق مع التقارير السابقة لطول دورة الخلية متوسط ​​من 15 ساعة. مع هذا المعدل مضاعفة، 1: تم استخدام 100 ابتداء من اللقاح لبدء الثقافات، مما يؤدي إلى الثقافات مع حجم معبأة الخلية (PCV) من 50٪ في 5-7 أيام. في البروتوكول الحالي، والتي كانت تزرع الثقافات في 200 مل من وسائل الاعلام، فقد تولدت PCV من 100 مل في 7 أيام، والتي تقدم خلايا كافية لملء 33 6 ل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم التحقق من صحة بروتوكول المذكورة أعلاه بنجاح لعزل البروتوبلازم، والعد، والتحول باستخدام التبغ زراعة الخلايا تعليق BY-2. ومع ذلك، يمكن بسهولة تمديد بروتوكول لأي ثقافة تعليق النبات. في الوقت الحاضر، وقد تم تحقيق العزلة والتحول البروتوبلازم في محطات عديدة، بما في ذلك الذرة (ذرة شامية) 10، الجزرة (Daucus carota) 32، الحور (حور euphratica) 33، العنب (كرمة العنب الاوروبي) 34، زيت النخيل (Elaeis gui.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصلحة مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من قبل وكالة مشاريع البحوث المتقدمة - جائزة الطاقة (ARPA-E) رقم. DE-AR0000313.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Orbitor RS Microplate MoverThermo Scientific
Bravo LiquidHandler Agilent
Synergy H1 قارئ متعدد الأوضاعBioTek
MultiFlo FX موزع متعدد الأوضاعBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC سخان / مبردInheco7000190
برنامج أتمتة Vworksيستخدم برنامج Agilentللتحكم في البروتوكولات وكتابتها لبرنامج Agilent Bravo
Momentumبرنامج جدولة المهام العلمية الحراريةللتحكم في
السوائل Orbiter RS 2.17 برنامجBiotekيستخدم للتحكم في البروتوكولات وكتابتها للمجهر المقلوب MultiFlo FX
IX81أوليمبوس
زيلا 3-Tap كاميرا مجهرAndor
ET-CY3 / TRITC مجموعة مرشحاتChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB إنزيماتعينة زجاجةسليولاز منخفضة التكلفة
Rohapect UFAB إنزيماتعينةالتكلفة من البكتيناز
Rohapect 10LAB إنزيماتبكتيناز منخفض التكلفة / أرابيناز
Linsmaier & مختبرات سكوج القاعدية المتوسطةللتكنولوجيا النباتيةL689
2،4-حمض ثنائي كلورو فينوكسي أسيتيكمختبرات التكنولوجيا النباتيةD295
بروبيديوم يوديدسيجما ألدريتشP4170
بولي (إيثيلين جلايكول) 4000سيجما ألدريتش95904-250G-Fسابقا فلوكا PEG
بروبيديوم يوديدفيشر Scientific25535-16-4أكروس أورجانكس
CaCl2< / sub>سيجما ألدريتشC7902-1KG
أسيتات الصوديومفيشر ScientificBP333-500
مانيتولسيجما ألدريتشM1902-1KG
السكروزفيشر العلميS5-3
KH2< / sub>PO4< / sub>AC424205000فيشر العلمي
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6 آبار لوحةThermo Scientific103184
96 بئر 1.2 مل لوحة بئر عميقةThermo ScientificAB-0564
96 لوحة سفلية بصريةبئر حراري علمية165305
Finntip 1000 نصائحماصة واسعة التجويفثيرمو ساينتيفيك9405 163
كلوريد الصوديومفيشر العلميBP358-10
KClسيجما ألدريتشP4504-1KG
MESفيشر ScientificAC17259-5000
MgCl2< / sub>فيشر ScientificM33-500
التحكم في التحكم في معالجة زجاجة منخفضة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protoplast IsolationProtoplast TransformationRobotic PlatformHigh throughput ScreeningBY 2 TobaccoEnzyme DigestionFluorescent MicroscopyPropidium IodideOrange Fluorescent ProteinPolyethylene Glycol

Related Articles