مقالة منهجية

التصوير تطهيرها الجنينية وبعد الولادة قلوب في قرار وحيدة الخلية

DOI:

10.3791/54303

⸱

أكتوبر 7, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف بروتوكولا لتصوير الخلايا المسماة بالبروتين الفلوري حجميا في أعماق القلوب الجنينية وما بعد الولادة السليمة. باستخدام طرق تطهير الأنسجة جنبا إلى جنب مع تلطيخ الحامل بالكامل ، يمكن تصوير الخلايا المفردة المسماة بالبروتين الفلوري داخل القلب الجنيني أو بعد الولادة بوضوح ودقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتبع نسيلي واحد والتحليل على مستوى كامل للقلب يمكن تحديد القلب السلوك خلية سلفية والتمايز خلال تطوير القلبية، والسماح لدراسة أساس الخلوية والجزيئية من التشكل القلب الطبيعي وغير الطبيعي. التقنيات الحديثة الناشئة من التحليلات نسيلي واحدة بأثر رجعي تجعل دراسة التشكل القلب في قرار خلية واحدة قابلة للتنفيذ. ومع ذلك، يتم زيادة التعتيم الأنسجة وتشتت الضوء من القلب وعمق التصوير تعيق التصوير كله القلب في قرار خلية واحدة. للتغلب على هذه العقبات، ونظام المقاصة كامل الجنين التي يمكن أن تجعل القلب شفافة للغاية لكلا الإضاءة والكشف ويجب وضع. لحسن الحظ، في السنوات القليلة الماضية، تم الإبلاغ عن العديد من المنهجيات لأنظمة المقاصة كله الكائنات مثل وضوح، هيئة السلع التموينية جنيه، SeeDB، ClearT، 3DISCO، مكعب، قسم تعزيز الحدود، BABB وباكت. هذا المختبر هو مهتم في الآليات الخلوية والجزيئية للبطاقةIAC التشكل. في الآونة الأخيرة، أنشأنا النسب خلية واحدة تتبع عبر ROSA26-لجنة المساواة العرقية ERT2، ونظام ROSA26-النثار إلى خلايا التسمية قليلة خلال تطوير القلب. نحن تكييفها عدة منهجيات لازالة الجنين كلها بما في ذلك هيئة السلع التموينية جنيه ومكعب (واضحة، دون عائق الكوكتيلات تصوير الدماغ والتحليل الحسابي) لمسح الجنين في تركيبة مع جبل بأكمله تلطيخ لاستنساخ واحدة صورة داخل القلب. تم تصوير القلب بنجاح في قرار خلية واحدة. وجدنا أن هيئة السلع التموينية جنيه يمكن مسح قلب الجنين، ولكن لا يمكن مسح بشكل فعال القلب ما بعد الولادة، في حين CUBIC يمكن مسح قلب ما بعد الولادة، ولكن الأضرار قلب الجنين عن طريق إذابة الأنسجة. سوف الأساليب المذكورة هنا يسمح للدراسة وظيفة الجينات في قرار استنساخ واحد خلال التشكل القلب، والتي، بدورها، يمكن أن تكشف عن الأساس الخلوي والجزيئي لعيوب القلب الخلقية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التشكل القلب هو حدث متسلسل يتطلب تنظيم الزمانية المكانية من أربعة أنواع مختلفة من الخلايا الاصلية القلب في قطاعات متميزة من القلب، وأيضا يتطلب عدة شبكات تنظيمية الوراثية لتنظيم هذه العملية لتشكيل 1،2 القلب وظيفية. وينظم القلب مواصفات، والتمايز، الزخرفة، ونضوج غرفة من عوامل النسخ قلبية 3. طفرة جينية أو انحراف posttranscriptional هذه العوامل في الخلايا الاصلية في القلب يمكن أن يؤدي في أي الفتك الجنينية أو عيوب خلقية في القلب (CHD) 4. دراسة التشكل القلب تتطلب فهم التفاصيل الكامنة الهيكلية في ثلاثة أبعاد (3D) واحد وصفت القلب النسب خلية سلفية تتبع أثناء التطور القلب وتعزيز فهم التشكل القلب. وقد تم تطوير عدد من عالية الدقة القسم على أساس أساليب التصوير المقطعي في الالبريد الماضي بضعة عقود إلى صورة هيكل الجهاز 5،6. ومع ذلك، وهذه الأساليب تتطلب باهظة الثمن، والأدوات المتخصصة، والعمل المكثف، وتفتقر إلى التنظيم الهيكلي مفصلة في قرار خلية واحدة في الحجمي النهائي بناؤها صورة 7،8.

التصوير الحجمي 3D على مستوى خلية واحدة يوفر وسيلة لدراسة تمايز الخلايا السلف والسلوك الخلوية في الجسم الحي 7. ومع ذلك، لا يزال ضوء الأنسجة نثر العقبة الرئيسية أمام تصوير الخلايا والهياكل في 3D عمق قلب سليمة. الدهون هي المصدر الرئيسي للتشتت الضوء، وإزالة الدهون و / أو تعديل الفرق معامل الانكسار بين الدهون والمناطق المحيطة بها من النهج المحتملة لزيادة الشفافية الأنسجة 8. في السنوات القليلة الماضية، تم تطوير عدد من الطرق المقاصة الأنسجة، مما يقلل من التعتيم الأنسجة وتشتت الضوء، مثل BABB (الكحول البنزيل وbenzoat البنزيلالبريد خليط) وقسم تعزيز الحدود (رباعي هيدرو الفوران وdibenzylether)؛ ولكن في هذه الأساليب، لا يزال مضان تبريد قضية 8-10. المذيب تستند أساليب ماء، مثل SeeDB (الفركتوز / thioglycerol) و3DISCO (ثنائي كلورو ميثان / dibenzylether)، والحفاظ على إشارات الفلورسنت، ولكن لا تجعل الجهاز كله شفاف 7،8،11. في المقارنة، وضوح طريقة الأنسجة إزالة يجعل الجهاز شفافة، ولكنه يتطلب جهاز الكهربائي متخصص لإزالة الدهون 8،12، كما يفعل باكت (تقنية الوضوح السلبي)، الأمر الذي يتطلب أيضا هيدروجيل تضمينها 7،13. للحصول على معلومات مفصلة عن جميع طرق ازالة الأنسجة المتاحة، يرجى الرجوع إلى الجدول 1 في ريتشاردسون ويختمن، وآخرون. 7.

في عام 2011، حماة وآخرون. اكتشف مصادفة خليط ماء "هيئة السلع التموينية جنيه" (اليوريا والجليسرول وتريتون X-100 خليط) أن يجعل دماغ الفأر وtranspar الجنينوالأنف والحنجرة مع الحفاظ تماما إشارات الفلورسنت من الحيوانات المستنسخة وصفت 14. وهذا يسمح لتصوير الدماغ سليمة على عمق عدة ملليمترات وإعادة البناء على نطاق واسع من السكان والتوقعات العصبية في قرار التحت خلوية. سوساكي وآخرون. زيادة تحسين هيئة السلع التموينية جنيه بإضافة aminoalcohols وضعت "مكعب" (واضحة، دون عائق الكوكتيلات تصوير الدماغ والتحليل الحسابي) طريقة إزالة الأنسجة، مما أدى إلى زيادة ذوبانية فوسفورية، وخفض الوقت المقاصة، ويسمح للمتعدد الألوان الفلورسنت التصوير 8. في هذه الدراسة، والاستفادة من هيئة السلع التموينية جنيه وتقنيات إزالة الأنسجة مكعب وعالية الدقة 3D باجتزاء البصرية، استنساخ الفردية داخل القلب أثناء تخلق القلب وتتبع باستخدام Rosa26Cre ERT2 15، R26R-النثار 16، αMHC-لجنة المساواة العرقية 17، cTnT-لجنة المساواة العرقية 18، Nfatc1-لجنة المساواة العرقية 19، وRosa26-mTmG (mTmG) 20 خطوط الماوس. مزيج من طريقة جبل بأكمله تلطيخ (WMS) وضعت سابقا 21،22 مع طرق إزالة الأنسجة يسمح كذلك إلى تلطيخ للبروتينات أخرى في استنساخ وصفت ولدراسة سلوكهم في سياق الحجمي 3D. مزيج من تطهير الأنسجة وWMS يسمح لفهم أفضل لدور الجينات والبروتينات المختلفة أثناء التطور القلب، والمسببات من عيوب خلقية في القلب. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لدراسة أخرى تمايز الخلايا السلف، والسلوك الخلوي، والأحداث الجهاز التشكل خلال التنمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافق جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) في كلية ألباني الطبية وإجراء وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. الاستعدادات الحل

ملاحظة: Rosa26Cre ERT2 15، R26R-النثار 16، αMHC-لجنة المساواة العرقية 17، وRosa26-mTmG (mTmG) تم شراء 20 خطوط الماوس تجاريا كان cTnT-لجنة المساواة العرقية 18 هدية من الدكتور جياو في جامعة ألاباما Nfatc1-لجنة المساواة العرقية. كانت هدية من الدكتور بن تشو في كلية ألبرت أينشتاين للطب 19. والموت الرحيم الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون في غرفة مغلقة لمدة 60 ثانية على الأقل تليها الوسائل المادية التحقق الموت بضع الصدر الثنائي، قطع الرأس أو خلع عنق الرحم.

  1. إعداد تاموكسيفين. حل 10 ملغ من عقار تاموكسيفين في 10 مل من منظمة اوكسفام الدولية بذور عباد الشمسل. مرة واحدة يتم حله تماما، قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
  2. إعداد مخزنة المالحة الفوسفات (PBS). حل نا 2 هبو 4 (1.41960 جم)، KH 2 PO 4 (0.24496 جم)، كلوريد الصوديوم (8.0669 ز) و بوكل (0.20129 جم) في 1 لتر من الماء المقطر، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
  3. إعداد PBST: 0.1٪ توين 20 الحل في برنامج تلفزيوني عن طريق تذويب 100 ميكرولتر من توين-20 في 100 مل من برنامج تلفزيوني.
  4. إعداد عازلة تمنع. تقديم 3٪ زلال المصل البقري (BSA) عرقلة الحل عن طريق إذابة 3 غرام من جيش صرب البوسنة في 100 مل من PBST تحتوي على 0.2٪ توين-20.
  5. إعداد مكعب 1 (كاشف 1). خلط 25٪ بالوزن اليوريا 25٪ بالوزن N، N، N '، N' tetrakis (2-هيدروكسي) الإيثيلين و 15٪ بالوزن تريتون X-100 في DH 2 O.
  6. إعداد مكعب 2 (الكاشف 2). خلط 50٪ بالوزن السكروز، 25٪ بالوزن اليوريا، و 10٪ بالوزن 2، 2، 2 '' - nitrilotriethanol و 0.1٪ (ت / ت) تريتون X-100 في DH 2 O.
  7. إعداد هيئة السلع التموينية جنيه A2: 4 M اليوريا، و 10٪ ث / الجلسرين الخامس و 0.1٪ ث / ت تريتون X-100 في DH 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.7.
  8. إعداد هيئة السلع التموينية جنيه B4: 8 M اليوريا و 0.1٪ ث / ت تريتون X-100 في DH 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 8.7.
  9. إعداد هيئة السلع التموينية لو 70: 4 M اليوريا، و 70٪ ث / ت الجلسرين و 0.1٪ ث / ت تريتون X-100 في DH 2 O.

2. تاموكسيفين والاستقراء، وعزل الأجنة والتثبيت

  1. تاموكسيفين الحث وعزل الأجنة
    1. باستخدام بروتوكول أنبوب التغذية المنحني المعتمدة (ACUP 13-12007)، أنبوب تغذية للإناث الفئران R26Cre ERT2 النثار (توصيل بواسطة R26Cre ERT2 الفئران الذكور) مع 10 ميكروغرام / غرام من تاموكسيفين في اليوم التنموي الجنينية E7.75 33. في اليوم الجنينية 9.5 (E9.5) أو E10.5، الموت ببطء إناث الفئران مع CO 2 والتفكك عنق الرحم.
    2. بعد التحقق من وفاة الماوس (انظر القسم 1 لاحظ)، فتح الماوس تجويف البطن مع مقص وتشريح خارج قرن الرحم، وإزالة طبقات أنبوب الرحم بمساعدة مقص وملاقط، وإعادةاستئجار الأجنة من 23،24 أنبوب الرحم.
      1. نقل الأجنة إلى طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). تحت المجهر تشريح، وإزالة طبقات غير الجنينية (المشيمه، الكيس المحي والسلى) مع مساعدة من ملاقط.
    3. باستخدام الملقط والمقص، وجمع العينات الماوس وذيل الجنين الأنثى التنميط الجيني كما ذكرت سابقا 22. باستخدام ماصة بلاستيكية، ونقل كل جنين إلى بئر من لوحة جيدا 48 تحتوي على 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
    4. تحت المجهر الفلورسنت، وتحديد GFP / RFP / CFP الأجنة إيجابية عن طريق مجهر مقلوب مع كاميرا. قشر بعيدا التأمور باستخدام الملقط وتدوير القلب / جنين مع مساعدة من ملاقط منحنية لتحديد عدد من الحيوانات المستنسخة الفلورسنت على كلا الجانبين من القلب مع المرشحات GFP / RFP / الحراجية المعتمدة. هناك حاجة إلى أي تخفيضات.
  2. بعد تحديد GFP / RFP / CFP الأجنة إيجابية، بسرعة غسل الأجنة مرتين (2 دقيقة لكل منهما) مع برنامج تلفزيوني 1X في اله 48 جيدا لوحة على شاكر لوحة في درجة حرارة الغرفة (RT). سيؤدي هذا إلى إزالة الدم الزائد.
  3. إصلاح الجنين / قلب الجنين باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في RT. الساعة التثبيت يعتمد على الجنينية العمر والنسيج الحجم. لE9.5 إصلاح الجنين لمدة 2 ساعة على RT. تتطلب الأجنة المرحلة الجنينية في وقت متأخر أطول وقت التثبيت، والتي يمكن أن يكون حتى لفترات طويلة على مدار 24 ساعة لقلبك ما بعد الولادة.
    تنبيه: لامتصاص العرق غير سامة، وتجنب ملامسة الجلد والعينين والأغشية المخاطية.
  4. بعد التثبيت، وغسل الجنين / القلب في البئر لوحة 48 مرتين (10 دقيقة لكل منهما) مع برنامج تلفزيوني 1X على شاكر لوحة في RT. هذا يزيل الزائد PFA من الجنين / قلب. ثم يتم زيادة معالجة الأجنة لجبل بأكمله تلطيخ والمقاصة الأنسجة.

3. الجامع جبل تلطيخ

ملاحظة: بعد تثبيت PFA يتعرض الجنين / قلب لجبل بأكمله تلطيخ على النحو التالي.

  1. Permeabilize الجنين / القلب في طبق بشكل جيد لمدة 48 باستخدام 1 ملتر من 0.1٪ PBST لمدة 2 ساعة على لوحة شاكر في RT.
  2. بعد permeabilization، تزج الجنين / القلب في 1 مل من العازلة حظر، لمدة 2 ساعة أو طوال الليل على شاكر لوحة عند 4 درجات مئوية.
  3. تزج الجنين / القلب إلى خلايا محددة البطانية الأجسام المضادة PECAM (CD31)، المخفف (1: 100) في 0.3 مل عازلة تمنع لمدة 48 ساعة على لوحة شاكر في 4 درجة مئوية.
  4. غسل الجنين / القلب باستخدام PBST 5 مرات، 30 دقيقة لكل منهما في RT على لوحة شاكر. هذا يزيل الأجسام المضادة الزائدة غير محددة ملزمة الأساسي من الأنسجة.
  5. تزج الجنين / القلب في اليكسا فلور 647 الماعز المضادة للفأر الضد الثانوية، المخفف (1: 1000) في 1 مل عازلة تمنع لمدة 48 ساعة على لوحة شاكر في 4 درجة مئوية.
  6. كرر الخطوة 3.4 لغسل الأجسام المضادة الثانوية.
  7. بعد إصلاح جنين / القلب مع PFA 4٪ لمدة 1 ساعة على RT على لوحة شاكر ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني 5 دقائق لكل منهما.
  8. وصمة عار على الجنين / القلب مع وصمة عار النووية 4، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) (المخفف في PBST في تناسقالتموينية من 0.01 ملغ / مل) لمدة 10 دقيقة على لوحة شاكر في RT. اتبع مع اثنين من يغسل PBS من 5 دقائق لكل منهما.

4. جنين / المقاصة القلب مع هيئة السلع التموينية ل ه أو أسلوب مكعب

ملاحظة: بعد جبل بأكمله تلطيخ، يتعرض الجنين / قلب إما جنيه هيئة السلع التموينية أو CUBIC طريقة إزالة الأنسجة. اختيار طريقة يعتمد على حجم الأنسجة والعمر الجنيني. لE11.5 أو السابقة الأجنة العمر، واستخدام هيئة السلع التموينية ل ه طريقة إزالة الأنسجة، في حين أن الأجنة القديمة أو قلوب ما بعد الولادة ويفضل CUBIC طريقة إزالة الأنسجة.

  1. على نطاق والأنسجة المقاصة الطريقة
    1. احتضان الجنين / القلب مع 1 مل من هيئة السلع التموينية ل حل ه A2 في قارورة التلألؤ (ملفوفة في رقائق الألومنيوم) مع بعض الأحيان لطيف الهز (باليد) لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية.
    2. بعد مرور فترة الحضانة هيئة السلع التموينية ل ه A2، واحتضان الجنين / القلب مع 1 مل من هيئة السلع التموينية ل حل ه B4 في 4 درجات مئوية في نفس القارورة مع عرضية هز لطيف لanotلها 48 ساعة.
    3. احتضان الجنين / قلب لمدة 48 ساعة أخرى مع 1 مل هيئة السلع التموينية ل ه 70 في 4 درجات مئوية مع اهتزاز لطيف في بعض الأحيان. جبل الجنين باستخدام 90٪ الجلسرين (انظر القسم 5.1).
  2. الأنسجة مكعب المقاصة الطريقة
    1. لكامل جنين / قلب المقاصة مكعب، تزج كل جنين / القلب في 1 مل من مكعب 1 مع عرضية لطيف تهتز لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية 7. بعد 48 ساعة، يستعاض عن حل مع نفس الحجم من كاشف CUBIC الطازجة 1، واحتضان العينة لمدة 48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية مع عرضية هز بيده.
    2. غسل مكعب 1 يعامل القلب / جنين مع برنامج تلفزيوني 1X عدة مرات في درجة حرارة الغرفة مع طيف تهتز بيده. هذا يزيل الزائد مكعب 1 الحل.
    3. بعد الغسيل خارج مكعب 1 مع برنامج تلفزيوني، تزج الأجنة / قلوب في حل مكعب 2 (1 غ لكل جنين / القلب) لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية مع عرضية لطيف تهتز بيده. ويأتي ذلك بعد جنين / قلب تزايد استخدام الجلسرين (انظر القسم 50.2).

5. تركيب العينة والتصوير

ملاحظة: الأجنة أو أجهزة مسح في هيئة السلع التموينية ل ه 70 أو مكعب 2 الحل يمكن تصويرها مباشرة مع مقياس 70 ومكعب 2 حل باعتبارها وسيلة التصوير، على التوالي. ومع ذلك، بالنظر إلى ضعف عينات الجنينية إلى الكواشف المقاصة، إذا لا يمكن تصوير العينات على الفور، ولكن تخزين على المدى الطويل، وتخزين العينات في 90٪ الجلسرين بعد بروتوكول أدناه.

  1. تزج مباشرة هيئة السلع التموينية جنيه مسح العينة في 1 مل من 90٪ الجلسرين وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى التصوير.
  2. غسل العينة تعامل مكعب مع برنامج تلفزيوني 1X مرتين، 5 دقائق لكل منهما وبالتتابع احتضان العينة مع 1 مل من 30٪، 50٪، 70٪ و 90٪ الحل الجلسرين كل لمدة 30 دقيقة.
  3. للتصوير، ونقل العينة إلى أسفل الزجاج طبق بيتري مع الحد الأدنى من 90٪ الجلسرين وصورة استنساخ مع المجهر متحد البؤر مجهزة مع اثنين من قدرات الفوتون.
  4. صورة قلب أو الجنين في الجلسرين مع 10X / 0.3 NA، و25X / 0.8 NA الغمر، أو 40X / 1.2 NA المياه التصحيحية عدسة الهدف. صورة دابي باستخدام 2 الفوتون الإثارة من التيتانيوم متماسك: الياقوت حرباء الليزر. وسيكون اختيار المجهر والعدسة الشيئية يتوقف على الغرض من التجارب، على سبيل المثال لفائقة الدقة، ويمكن استخدام المجهر الفلورسنت ورقة الخفيفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصوير القلب الجنينية مسح

تشكيل قلب الفقاريات هو عملية morphogenic ينظم spatiotemporally ويعتمد على التنظيم وتمايز الخلايا السلف من أربعة مصادر مختلفة 1. والخلايا من مجال القلب الأول من الهلال القلب أضعاف باتجاه خط الوسط بطني لتشكيل أنبوب القلب الخطي. الخلايا من حقل قلبية ثانية، ويقيم في البداية dorsomedially إلى الميدان قلبية للمرة الأول...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل الجنين هو خطوة حاسمة جدا. الأجنة E9.5 هشة جدا وصغيرة الحجم، لذلك ينبغي اتخاذ مزيد من الحذر على عدم الإضرار الهياكل جنين / القلب أثناء العزلة. يجب إزالة طبقات اضافية غير الجنينية يغلف الجنين / قلب بعناية خاصة عند تصوير الجنين كله. وهذا يسمح اختراق الأجسام المضادة والمقاصة خليط عمق الأنسجة الجنينية، ويساعد أيضا في إزالة إشارة الخلفية عند التصوير. تم فحص الأجسام المضادة متعددة بما في ذلك الأجسام المضادة ضد PECAM، الأسيتيل α تويولين وβ1 إنتغرين وجميع تم الكشف عن بنجاح (لا تظهر الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أعضاء مختبر MW على المناقشة العلمية. يتم دعم هذا العمل من قبل AHA [13SDG16920099] إلى MW ، ومن خلال منح المعهد الوطني للقلب والرئة والدم [R01HL121700] إلى MW تم التقاط الصور في مرفق التصوير الأساسي في كلية ألباني الطبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2،2 & رئيس الوزراء ؛ 2 & '-nitrilotriethanol سيجما ألدريتش90279
4٪ بارافورمالديهايد في PBSAffymetrix19943
BSAFischer Scientific  BP16000
N ، N ، N '، N '-tetrakis (2-hydroxypropyl) إيثيلين ديامين   ؛سيجما ألدريتش122262
عازلة الفوسفات الملحيةسيجما ألدريتشP5368-10PAK
Triton  X-100سيجما ألدريتشT8787
اليورياسيجما ألدريتشU-1250
السكروزسيجما ألدريتش84097
الجلسرينسيجما ألدريتشG8773
تاموكسيفينسيجما ألدريتشT5648
زيت بذور عباد الشمسسيجما ألدريتشS5007
توين 20سيجما ألدريتشP1379
PECAM (CD31)BD Pharmingen 550274
Alexa Fluor 647   ؛InvitrogenA-21247
DAPI وصمة عار نوويةSigma AldrichD9542
37o< / sup>C حاضنةعلمية حرارية FischerHeratherm ، حاضنات
48 لوحة بئرمعالجة الخلية229148
الميزان التحليليMetler ToledoPB153-S / FACT
Confocal مجهرزايسزايس 510 مجهر
مجهرUnitronZ850
مجهر فلوريزايسأوبزرفر. Z1
Germinator 500 معقم حبة زجاجيةCellPoint ScientificGER-5287-120V
مصدر الضوءSCHOTTACE I
زوج من أدوات العلومالدقيقةللمقص 14084-08
طبق بتري 60 مم × 15 مم & nbsp ؛TPP تكنو المنتجات البلاستيكية AG93060
الروك II  منصة الروكBoekel Scientific260350
أنابيب متلألئةFischer Scientific 03-337-26
ماصة نقلSamco Scientific202
ملاقطأدوات العلوم الدقيقة11251-20
ميكروبيولوجية مدمجةمتحد البؤر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
  2. Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
  3. Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
  4. Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
  5. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
  6. Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  8. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  9. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916(2012).
  10. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  11. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  13. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  14. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  15. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  16. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  17. Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
  18. Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
  19. Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
  20. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  21. Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
  22. Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
  23. Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , Academic Press. London. (1992).
  24. Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
  25. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
  26. Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
  27. Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
  28. Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
  29. Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
  30. Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Developement. 127, 1607-1616 (2000).
  31. Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
  32. Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
  33. Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
  34. Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
  35. Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ScaLe CUBIC

مقالات ذات صلة