مقالة منهجية

قياس في المختبر أتباز آخر لالأنزيمية توصيف

DOI:

10.3791/54305

⸱

أغسطس 23, 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف بروتوكولا أساسيا لقياس نشاط ATPase في المختبر. يمكن تحسين هذا البروتوكول بناء على مستوى النشاط والمتطلبات الخاصة ب ATPase منقى معين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأدينوساين الإنزيمات hydrolyzing ثلاثي الفوسفات، أو ATPases، تلعب دورا حاسما في مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية. ويمكن لهذه البروتينات ديناميكية توليد الطاقة عن الأعمال الميكانيكية، مثل الاتجار البروتين وتدهور والنقل المذاب، والحركات الخلوية. بروتوكول الموصوفة هنا هو فحص أساسي لقياس النشاط في المختبر من ATPases تنقيته لتوصيف وظيفي. البروتينات يتحلل اعبي التنس المحترفين في رد الفعل الذي يؤدي إلى الإفراج الفوسفات غير العضوية، وكمية من الفوسفات تحرير ثم quantitated باستخدام مقايسة اللونية. هذا البروتوكول العالية للتكيف يمكن تعديلها لقياس النشاط أتباز في المقايسات الحركية أو نقطة النهاية. ويرد بروتوكول التمثيلي هنا على أساس النشاط ومتطلبات EpsE، تشارك AAA + أتباز في النوع الثاني إفراز في بكتيريا ضمة الكوليرا. كمية من البروتين النقي اللازمة لقياس النشاط ومدة الفحص وتوقيت وعدد من سافترات mpling، العازلة وتكوين الملح، ودرجة الحرارة، والعوامل المشتركة، والمنشطات (إن وجدت)، وما إلى ذلك قد تختلف عن تلك المذكورة هنا، وبالتالي بعض التحسين قد تكون ضرورية. يوفر هذا البروتوكول إطارا أساسيا لATPases تميز ويمكن أن يؤديها بسرعة وتعديلها بسهولة عند الضرورة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATPases هي إنزيمات متكاملة في العديد من العمليات في جميع ممالك الحياة. تعمل ATPases كمحركات جزيئية تستخدم طاقة التحلل المائي ATP لتشغيل تفاعلات متنوعة مثل الاتجار بالبروتين والكشف والتجميع. النسخ المتماثل والنسخ ؛ التمثيل الغذائي الخلوي حركة العضلات؛ حركة الخلية وضخ الأيونات1-3. بعض ATPases عبارة عن بروتينات عبر الغشاء تشارك في نقل المواد المذابة عبر الأغشية ، والبعض الآخر سيتوبلازم وقد يرتبط بغشاء بيولوجي مثل غشاء البلازما أو تلك الموجودة في العضيات.

تشكل فئة

AAA + ATPases (ATPases المرتبطة بالأنشطة الخلوية المختلفة) مجموعة كبيرة من ATPases التي تشترك في بعض التسلسل والحفظ الهيكلي. تحتوي هذه البروتينات على أشكال ربط النيوكليوتيدات المحفوظة مثل صناديق Walker-A و -B وتشكل قلات قليلة (بشكل عام سداسيم) في حالتهاالنشطة 1. تم تمييز التغيرات التوافقية الكبيرة في هذه البروتينات عند ارتباط النيوكليوتيدات بين أعضاء متنوعين من عائلة AAA +. EpsE هو AAA + ATPase وعضو في فصيلة فرعية من الإفراز البكتيري من النوع الثاني / الرابع من NTPases4-6. يعمل EpsE على إفراز النوع الثاني (T2S) في ضمة الكوليرا ، العامل المسبب للكوليرا. نظام T2S مسؤول عن إفراز مجموعة متنوعة من البروتينات ، مثل عامل الفوعة سم الكوليرا الذي يسبب الإسهال المائي الغزير عندما تستعمر الكوليرا الأمعاء الدقيقة البشرية7.

تتنوع تقنيات

تقنيات القياس الكمي في المختبر نشاط ATPase ، ولكنها تقيس عادة إطلاق الفوسفات باستخدام ركائز لونية أو فلورية أو مشعة8-11. نصف طريقة أساسية لتحديد نشاط ATPase في المختبر للبروتينات المنقاة باستخدام مقايسة لونية تعتمد على ركيزة تحتوي على أخضر الملكيت المتوفرة تجاريا والتي تقيس الفوسفات غير العضوي المحرر (Pi). عند درجة الحموضة المنخفضة ، يشكل الموليبدات الأخضر الملكيت مركبا مع Pi ويمكن قياس مستوى التكوين المعقد عند 650 نانومتر. يمكن استخدام هذا الاختبار البسيط والحساس لتوصيف ATPases الجديدة وظيفيا وتقييم أدوار المنشطات أو المثبطات المحتملة ، لتحديد أهمية المجالات و / أو المخلفات المحددة ، أو لتقييم تأثير علاجات معينة على النشاط الأنزيمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تنفيذ ATP الحلمأة رد الفعل مع البروتين النقي

  1. إعداد مخزونات جميع الكواشف اللازمة لحضانة مع البروتين النقي.
    1. إعداد عازلة 5X HEPES / كلوريد الصوديوم / الجلسرين (هنج) تحتوي على 100 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 8.5، 65 مم كلوريد الصوديوم، و 5٪ الجلسرين (أو عازلة فحص آخر حسب الاقتضاء).
    2. إعداد 100 ملي MgCl 2 (أو المعادن الأخرى، إذا أتباز يعتمد المعادن) في الماء.
    3. إعداد الطازجة 100 ملي اعبي التنس المحترفين في 200 ملي قاعدة تريس (لا ضبط درجة الحموضة مزيد) باستخدام عالية ATP النقاء. قسامة وتخزين الأوراق المالية اعبي التنس المحترفين في -20 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن بضعة أسابيع، كما ATP سوف تنهار مع مرور الوقت، والامتناع عن تجميد وذوبان الأسهم اعبي التنس المحترفين.
    4. بريمكس MgCl 2 و ATP في نسبة 1: 1 قبل وضع رد فعل التحلل اعبي التنس المحترفين.
  2. تحضير تسمية 1.5 مل أنابيب لجمع العينات على فترات منتظمة طوال رد فعل. إعداد أنابيب جمع العينات في وقت 0 وفي وقت 15، 30،45، و 60 دقيقة.
    ملاحظة: وكبديل، وجمع عينات فقط في وقت 0 ونقطة النهاية.
    1. إضافة 245 ميكرولتر العازلة 1X هنغ إلى كل أنبوب من أجل تمييع العينات التي تم جمعها من ردود الفعل المائي ATP 01:50.
  3. يعد حمام من الثلج الجاف والايثانول لتجميد بسرعة عينات لوقف التفاعل. في دلو المطاط الجليد أو آمنة الأخرى (غير البلاستيك) حاوية، إضافة عدة قطع من الثلج الجاف وتصب بعناية ما يكفي من 70-100٪ من الإيثانول لتغطية الثلج الجاف.
  4. تمييع البروتين النقي في المخزن هنغ 1X، حسب الاقتضاء (عادة 5-10 ميكرون)، والحفاظ على الجليد.
  5. إعداد ردود فعل التحلل اعبي التنس المحترفين.
    1. في منفصلة 0.5 مل أنابيب لكل عينة، إضافة الكواشف التالية (بالترتيب): H 2 O (تصل إلى الحجم النهائي من 30 ميكرولتر)، 6 ميكرولتر 5X هنغ أو عازلة آخرين، 3 ميكرولتر 100 ملي MgCl 2 -ATP الخليط، و،25-5 البروتين ميكرومتر.
    2. تشمل منطقة عازلة فقط حالة السيطرة السلبية التي لم تتم إضافة البروتين.
  6. إزالة 5 ميكرولتر من رد فعل في وقت 0، وتمييع 01:50 في أنبوب 1.5 مل استعداد تحتوي على 245 عازلة هنغ ميكرولتر، وتجميد فورا العينة في حمام الثلج / الايثانول الجاف.
  7. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية للسماح للاعبي التنس المحترفين المائي للتحدث لمدة 1 ساعة. في كل فترة (15، 30، 45، و 60 دقيقة)، وإزالة 5 مكل من التفاعل وإضافة إلى أنابيب العينات وصفت تحتوي عازلة هنغ كما في الخطوة 1.6.
  8. في نهاية التفاعل المائي ATP، نقل عينات المخفف إلى -80 درجة مئوية الثلاجة لمدة التخزين. لضمان تجميد جميع العينات تماما، انتظر على الأقل 10 دقيقة قبل المتابعة.

2. عينات احتضان يتضمن بي الحرة مع كشف الكاشف

  1. عينات ذوبان الجليد المخففة التي تحتوي على ATP قسامات رد فعل التحلل في كل نقطة زمنية (تم الحصول عليها من الخطوات 1.6 و 1.7) في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد لوحة 96-جيدا تحتوي على عينات والمعايير الفوسفات.
    1. في مل تو 0.5يكون، يخفف من مستوى الفوسفات (المتوفرة مع بي كشف كاشف) من 800 ميكرومتر إلى 40 ميكرومتر بإضافة 5.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت هنغ 800 ميكرومتر القياسية إلى 104.5 ميكرولتر. تخلط جيدا، وإضافة 100 ميكرولتر من هذا 40 ميكرومتر بي المعيار إلى ما A1 من لوحة 96-جيدا.
    2. إضافة العازلة هنغ 50 ميكرولتر من الآبار B1-H1 لل1: 1 التخفيفات التسلسلي للمعيار بي.
    3. إزالة 50 ميكرولتر من 40 ميكرومتر بي من A1 جيدا وإضافة إلى عازلة فحص 50 ميكرولتر في B1 جيدا، خلط، وإزالة 50 ميكرولتر من B1 جيدا وإضافة إلى ما C1، التخفيفات المستمر من خلال G1 جيدا. تجاهل 50 ميكرولتر من G1 جيدا بعد خلطه لضمان كل بئر لديه نفس الحجم. كذلك يجب أن تحتوي H1 عازلة الوحيد لخلق معيار بي 40-0 ميكرومتر.
      ملاحظة: إذا تمت إضافة عامل إضافي (مثل مثبطات) للعينات، وخلق منحنى القياسية التي تحتوي على هذا العامل للسيطرة على التغيرات في الافراج عن الفوسفات أو الامتصاصية في ظل هذه الظروف.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من كل عصيدةلو في نسختين لوحة. إضافة عينات من نقطة زمنية واحدة في الأعمدة عموديا (عينة 1 مرة 0 = A2، A3، عينة 2 مرة 0 = B2، B3) ونقاط زمنية مختلفة أفقيا. هذا يسمح لمدة تصل إلى 8 عينات و 5 نقاط الوقت لكل لوحة.
  3. استخدام الماصة العقيمة لإزالة ما يكفي من المرمر الأخضر / موليبدات بي كشف كاشف لإضافة 100 ميكرولتر إلى كل من الآبار التي تحتوي على عينات والمعايير (كاشف اللازمة (مل) = 0.1 × عدد العينات والمعايير) وإضافة إلى طبق لسهولة pipetting ل باستخدام الماصة متعدد القنوات. لا صب كاشف الكشف مباشرة في طبق، حيث من المحتمل أن يحدث تلوث بي.
  4. باستخدام الماصة متعدد القنوات، إضافة 100 ميكرولتر من كشف كاشف بي إلى كل بئر وتخلط بواسطة pipetting بعناية صعودا وهبوطا عدد ثابت من الأوقات دون فقاعات إدخال، ويفضل أن يكون في أمر من النقاط الزمنية الماضية إلى نقطة لأول مرة.
  5. احتضان لوحة لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، أو وفقا لأماهالاتجاهات nufacturer و.

3. النتائج Quantitate باستخدام قارئ صفيحة

  1. قراءة الامتصاصية من العينات في 650 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية الامتصاصية.
  2. جعل منحنى القياسية بي. باستخدام برنامج الرسوم البيانية، رسم بياني لقيم الامتصاصية للعينات بي القياسية مقابل تركيز من أجل إيجاد المعادلة المستخدمة في حل لكمية الفوسفات في كل عينة.
  3. حساب النشاط أتباز لكل عينة من معايرة مع معيار الفوسفات. الفوسفات صدر = (OD 650 - Y التقاطع) / المنحدر.
    1. متوسط ​​مجموع بي من التكرارات من كل عينة. طرح القراءة الامتصاصية سيطرة عازلة الوحيد من هذا الرقم. اضرب هذا من قبل عامل التخفيف (50 في مثالنا).
    2. تحديد بي نانومول صدر في البروتين مكرومول. يجب أن الرسوم البيانية هذه القيم لكل نقطة زمنية في مقايسة الحركية تسفر عن نوبات الخطية على الأقل R = 0.99 (الشكل 1). إذا كان nبعد التمديد، ويمكن تعديل مقايسة مع أكثر أو أقل من البروتين أو فترة حضانة أطول أو أقصر.
  4. تمثل النتائج على النحو نانومول بي / مكرومول بروتين / دقيقة (الشكلان 2 و 3)، أو البروتين نانومول بي / ميكروغرام / دقيقة إذا رغبت في ذلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النشاط في المختبر من T2S أتباز EpsE يمكن يحفزه copurification من EpsE مع المجال حشوية من EpsL (EpsE-cytoEpsL) وإضافة كارديوليين فوسفورية الحمضية 12. ومن الممكن أيضا لتحديد دور معين بقايا EpsE في اعبي التنس المحترفين المائي من خلال مقارنة النشاط من النوع البري (WT) لأشكال مغايرة من البروتين باستخدام هذا الاختبار. هنا، يتم قياس تأثير استبدال اثنين من مخلفات يسين في المجال ملزم الزنك EpsE بمقارنة النشاط أتباز من تنقية WT EpsE-cytoE...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا هو بروتوكول عام لقياس النشاط أتباز المختبر من البروتينات النقاء لتوصيف والكيمياء الحيوية. هذه الطريقة بسهولة الأمثل. على سبيل المثال، وضبط كمية من البروتين، العازلة والتراكيب الملح، ودرجة الحرارة، وتتراوح مدة الفحص وفترات (بما في ذلك زيادة عدد فترات) يمكن أن تحسن الكميات النشاط. متوفرة تجاريا الكواشف مقرها الخضراء المرمر حساسة للغاية، ويمكن الكشف عن كميات صغيرة من الفوسفات خالية (50 ~ بمول في 100 ميكرولتر). بسبب حساسية هذا الاختبار، فإنه لا بد من استخدام الأد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرغب المؤلفون في الاعتراف بالتمويل من منحة المعاهد الوطنية للصحة RO1AI049294 (إلى MS.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
عازلة HEPESفيشرBP310-500
كلوريد الصوديومفيشرBP358-212
كلوريد المغنيسيومفيشرBP214-500
أدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP)فيشرBP41325
ألواح 96 بئر (شفافة ، مسطحة القاع)VWR82050-760
BIOMOL GreenEnzo Life SciencesBML-AK111كاشف الكشف عن الفوسفات المفضل. تحذير: مهيج.
قارئBioTek Synergy أو
برنامجPrism 5
Microplate GraphPad المماثل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
  2. Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
  3. Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
  4. Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
  5. Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
  6. Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
  7. Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
  8. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
  9. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  10. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
  11. Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
  12. Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
  13. McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
  14. Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
  15. Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
  16. Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
  17. Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
  18. Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
  19. Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
  20. Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ATP

مقالات ذات صلة