مقالة منهجية

الإنتاجية العالية جين توصيف في

DOI:

10.3791/54342

⸱

أغسطس 12, 2016

 ,  , 
1Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد إضافة علامة إلى البروتين طريقة قوية لاكتساب نظرة ثاقبة لوظيفته. هنا ، نصف بروتوكولا لوضع علامات داخلية على المئات من بروتينات المثقبية البروسية بالتوازي بحيث يمكن تحقيق علامات مقياس الجينوم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدت التحسينات في قياس الطيف الكتلي والتسلسل والمعلوماتية الحيوية إلى إنشاء مجموعات بيانات كبيرة من الجينات التي يحتمل أن تكون مثيرة للاهتمام. يمكن أن يعطي وضع علامات على هذه البروتينات نظرة مستقبلية حول وظيفتها من خلال تحديد توطينها داخل الخلية وتمكين تحديد شريك التفاعل. لقد نشرنا مؤخرا طريقة سريعة وقابلة للتطوير لتوليد خطوط خلايا المثقبية البروسية التي تعبر عن بروتين موسوم من الموضع الداخلي. استندت الطريقة إلى البلازميد الذي أنشأناه والذي ، عندما يقترن ب PCR التمهيدي الطويل ، يمكن استخدامه لتعديل جين لتشفير بروتين تم وضع علامة عليه في أي من النهاية. يسمح ذلك بوضع علامات على العشرات من بروتينات المثقبيات بالتوازي ، مما يسهل التحقق على نطاق واسع من الجينات المرشحة ذات الأهمية. يمكن استخدام هذا النظام لتمييز البروتينات للتوطين (باستخدام بروتين فلوري أو علامة حاتمة أو علامة مجهر إلكتروني) أو الكيمياء الحيوية (باستخدام علامات للتنقية ، مثل علامة TAP (تنقية التقارب الترادفي)). هنا ، نصف بروتوكولا لإجراء PCR التمهيدي الطويل والتثقيب الكهربائي في ألواح 96 بئرا ، مع استرداد واختيار المثقبيات المعدلة وراثيا التي تحدث في ألواح 24 بئرا. مع سير العمل هذا ، يمكن تمييز مئات البروتينات بالتوازي. هذا هو التحسين من حيث الحجم لبروتوكولنا السابق وأصبح وضع علامات على مقياس الجينوم ممكنا الآن.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المثقبية البروسية هو طفيلي المسبب trypanosomasis افريقيا البشرية وناغانا في الماشية. ت. البروسية هو كائن حي مثالية لتحليل وظيفة البروتين بسبب مزيج من العوامل الوراثية ذات جودة عالية، والعديد من البروتينات ومجموعات البيانات transcriptomics والأدوات الجزيئية متطورة 1-3. وقد أدى التقدم في البروتينات والتسلسل في مجموعات كبيرة من البيانات التي تبرز يحتمل أن تكون جينات مثيرة للاهتمام 4-6. ومع ذلك، فإن العديد من الجينات لديهم الحد الأدنى من المعلومات المرتبطة بها في قواعد البيانات الموجودة. ولذلك هناك حاجة إلى طريقة الإنتاجية العالية للمساعدة توصيف وظيفي البروتين.

التعبير عن بروتين الموسومة يمكن أن تعطي تعدد الرؤى إلى وظيفة البروتين و. على سبيل المثال، وهو بروتين الموسومة ب بروتين فلوري أو حاتمة يمكن أن تكون مترجمة بواسطة المجهر مضان، الذي يعطي معلومات عن مكان وجود بروتعين يمكن ممارسة التأثير البيولوجي. بدلا من ذلك، وهو بروتين ذات الكلمات الدلالية مع TAP 7، 8 HaloTag أو علامة يمكن ان يكون له تنقيته لفحوصات الكيمياء الحيوية وتحديد الشركاء تفاعلها.

وضعنا مؤخرا منهجية وضع علامات قوية لT. البروسية 9. تستخدم هذه التمهيدي طويلة PCR لتوليد الحمض النووي لترنسفكأيشن ويسمح وضع علامات على العشرات من البروتينات في موازاة - تحسنا كبيرا على البروتوكولات الحالية. ونحن قد تحسنت الآن قابلية هذا البروتوكول في أشكال procyclic بأمر من حجمها. هنا، نقدم طريقة لدينا حيث أننا أداء PCR وترنسفكأيشن في لوحات 96-جيدا، مع انتعاش واختيار تحدث في 24 لوحات جيدا. كما يمكن الآن الموسومة مئات من البروتينات بشكل متواز وهذه الطريقة توفر وسيلة فعالة من حيث التكلفة وقابلا للعلامات الجينوم المثقية بأكمله.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 96-جيدا طويل التمهيدي PCR

  1. قبل تجميد 96-جيدا PCR برودة في الثلاجة -80 درجة مئوية.
  2. في أنبوب 10 مل، وإعداد ميكس ماجستير A: 2100 ميكرولتر ده 2 O، و 105 ميكرولتر PCR الصف DMSO، 105 ميكرولتر 10 ملي dNTPs و 105 ميكرولتر pPOT قالب (25 نانوغرام / ميكرولتر) 9، عن حجم ما مجموعه 2،415 ميكرولتر لكل لوحة .
  3. قسامة 23 ميكرولتر في كل بئر من لوحة 96-جيدا PCR.
  4. إضافة 2 ميكرولتر من 100 ميكرومتر المجمعة الاشعال لكل محملة جيدا باستخدام P20 12 قناة متعددة ماصة. ختم مع فيلم، ومكان لوحة على برودة PCR قبل المبردة والسماح لتجميد مدة لا تقل عن 20 دقيقة في -80 درجة مئوية.
  5. في أنبوب 10 مل، وإعداد ميكس ماجستير ب: 2048 ميكرولتر ده 2 O، 525 ميكرولتر العازلة 10X، 52.5 البلمرة ميكرولتر لإجمالي حجم 2626 ميكرولتر لكل لوحة.
  6. إزالة لوحة وPCR برودة من الفريزر -80 درجة مئوية.
  7. مع لوحة لا تزال على برودة PCR، إضافة 25 ميكرولتر ميكس ماجستير B على رأس جمدتن ميكس ماجستير ولحجم رد الفعل ما مجموعه 50 ميكرولتر. هذا هو الوقت الحرج، ويجب أن تكتمل قبل ميكس A يمكن أن ذوبان الجليد. ختم لوحة مع الفيلم.
  8. تعيين cycler الحرارية على النحو التالي: 94 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها فترة التمديد النهائي من 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق .
  9. تحميل لوحة PCR بعد أن بلغ كتلة 94 درجة مئوية.

2. التحقق من صحة 96-جيدا طويل التمهيدي PCR

  1. يلقي كبيرة 1٪ (ث / ت) هلام الاغاروز في تريس خلات EDTA (تاي) العازلة على التوالي مع أمشاط 4 × 28-جيدا لإعطاء جل مع 4 صفوف من الآبار. محاذاة أسنان بديلة للمشط مع نصائح من 12 قناة متعددة ماصة. بعناية غمر جل في تاي العازلة على التوالي بعد أن يتم تحميل الممرات.
  2. تحميل 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي في شارع 1 و 28 بئر من كل صف.
  3. باستخدام P20 12 قناة ماصة الأقنية، ونقل 2 ميكرولتر من دير المنتج PCRectly إلى كل حارة من هلام (الشكل 1A). القيام بذلك بسرعة للحد من إمكانية تلوث amplicons.
    1. تحميل منتجات PCR من الصف ألف من لوحة PCR في الممرات الوتر من الصف 1st من هلام (A1 - حارة 3، A2 - حارة 5 ...... A11 - حارة 23، A12 - حارة 25) وتحميل المنتجات PCR من الصف B من لوحة PCR في الممرات حتى مرقمة من الصف الحادي 1 من هلام (B1 - حارة 4، A2 - حارة 6 ...... B11 - حارة 24، B12 - حارة 26).
    2. تحميل منتجات PCR من الصف C و D من لوحة PCR باستخدام نفس النمط كما هو موضح أعلاه، مع صف C في الممرات مرقمة والصف D الغريب في الممرات زوجية. يستمر هذا النمط التحميل حتى يتم تحميل كل بئر من لوحة PCR على هلام. ليس مطلوبا عازلة الحمض النووي التحميل لتحميل هذا الجل.
  4. وضع الجل في خزان تشغيل وملء خزان مع تاي العازلة تشغيل حتى يتم المغمورة هلام. تشغيل في 100 فولت لمدة 30 دقيقة وتصور باستخدام الأشعة فوق البنفسجية نقل transilluminator. انظر الشكل 1B لهلام سبيل المثال.
    ملاحظة: منتجات PCR يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع قبل ترنسفكأيشن

3. ترنسفكأيشن 96-جيدا

  1. استخدام T. البروسية procyclic خط الخلية شكل SMOXP9 10 لهذا الإجراء وتنمو في SDM-79 وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ FCS 10.
  2. استخدام 1 × 10 7 خلايا لكل ترنسفكأيشن (ما مجموعه 1.1 × 10 9 خلايا) عندما وضع علامات على محطة N من البروتين و 2 × 10 7 خلايا لكل ترنسفكأيشن (ما مجموعه 2.2 × 10 9 خلايا) عندما وضع علامات على محطة C من البروتين. الحفاظ على الخلايا في منتصف سجل (1.2 × 10 6 -1 × 10 7 خلية / مل) لعدة أيام قبل ترنسفكأيشن وحصاد الخلايا لترنسفكأيشن في مناطق ذات كثافة من 5-8 × 10 6 خلية / مل.
  3. تسمح للمنتجات PCR المجمدة لترنسفكأيشن لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة.
  4. عد الخلايا باستخدام هيمocytometer أو مكافحة الخلايا التلقائي.
  5. بيليه العدد المطلوب من الخلايا في أنابيب متعددة 50 مل في 800 x ج لمدة 10 دقيقة.
  6. بعد طاف الطرد المركزي تجاهل وresuspend الخلايا في 10 مل cytomix المعدلة (0.8 ملي EGTA، 24 ملي بوكل، 0.15 ملي CaCl 2 و 10 ملي فوسفات البوتاسيوم العازلة pH7.6، 25 ملي HEPES-كوه pH7.6، 2.6 ملي MgCl 2، 0.5٪ (ث / ت) الجلوكوز، 100 ميكروغرام / مل BSA، 1 ملم هيبوزانتين، 144 ملي السكروز) في أنبوب. نقل عن حلول الخلية إلى أنبوب واحد وتدور مرة أخرى في 800 x ج لمدة 10 دقيقة.
  7. بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف و resuspend الخلايا في 23 مل من cytomix تعديل لتركيز النهائي من 5 × 10 7 خلية / مل.
  8. في حين أن الخلايا هي الغزل، إضافة 1 مل من SDM-79 وسائل الإعلام إلى كل بئر من لوحات زراعة الأنسجة 4 × 24 أيضا. تسمية لوحات م ورسم حلقة حول جيدا A1 على كل لوحة في علامة دائمة للمساعدة في توجيه لوحة.
  9. ربط معالج لوحة لelectroporator. على electroporaتعيين وحدة تور الجهد إلى 1500 V، وطول النبض إلى 100 μsec وعدد النبضات إلى 12 والفترة النبض إلى 500 مللي ثانية. على معالج لوحة، وتعيين عدد النبض إلى 1. وهذا يضمن أن هذا electroporator سيتم تطبيق نبضة واحدة على كل من 12 عمودا من لوحة Electroporation لل.
  10. باستخدام P200 12 قناة ماصة الأقنية، ونقل ردود الفعل PCR من لوحة PCR إلى لوحات Electroporation للتصرف 96-جيدا، والفجوة 4 مم.
  11. عندما تم نسج الخلايا ومعلق على التركيز النهائي 5 × 10 7 خلية / مل (الخطوة 3.7)، ونقل إلى خزان كاشف. ماصة 200 ميكرولتر من محلول خلية في كل بئر من لوحة Electroporation للاستخدام P200 12 قناة متعددة ماصة، مع مزيج من المنتجات PCR من قبل pipetting.
  12. باستخدام الأنسجة إزالة أي قطرات من الجزء العلوي من لوحة لتجنب قصيرة الدوائر.
  13. تطبيق هذا الفيلم ختم المقدمة في التعبئة والتغليف لوحة إلى الجزء العلوي من لوحة Electroporation لل، ونقاط البيعitioning عليه وذلك لترك فتحات للأقطاب التي تم اكتشافها في الجزء العلوي والسفلي من كل عمود. تجنب تغطي النقاط التي أثيرت تستخدم لتوجيه الفيلم.
  14. تحميل لوحة Electroporation للفي معالج لوحة وإغلاق الغطاء. اضغط على "نبض" على وحدة electroporator.
  15. بعد Electroporation لل، بسرعة نقل الخلايا من لوحة Electroporation لل96-جيدا لوحات زراعة الأنسجة 4 × 24-جيدا. لنقل الخلايا، واستخدام P200 12 قناة متعددة ماصة مع كل طرف الآخر مفقود من هذا القبيل أن 6 نصائح المتبقية تصطف مع 6 صفوف في لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا. نقل الخلايا electroporated في لوحات electroporations 96-جيدا في نمط محدد مسبقا إلى لوحات زراعة الأنسجة 24-جيدا (الشكل 2A).
  16. إعداد نصائح ماصة P200 - لكل 96-جيدا ترنسفكأيشن إعداد 2 صناديق من 96 نصائح مع كل عمود آخر إزالتها.
    1. نقل الآبار A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 على لوحة Electroporation لل96-جيدا للوحة صف ألف من لوحات زراعة الأنسجة 24-جيدا، B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 في صف وB، C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 في صف وC وD1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 في صف وD. بعد نقل كل مجموعة من 6 آبار من لوحة 96-جيدا لوحة 24-جيدا، ثم يتم غسلها الآبار في لوحة 96-جيدا مع وسائل الإعلام من الآبار المقابلة في 24- جيد ثم يتم نقلها لوحة وغسل العودة إلى بئر في 24 لوحة جيدا.
    2. آبار نقل E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 على لوحة Electroporation لل96-جيدا ل24-جيدا لوحة B الصف A، F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 في صف وB، G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 في صف وC و H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 في صف وD. بعد نقل كل مجموعة من 6 آبار من لوحة 96-جيدا لوحة 24-جيدا، والآبار في ال 96 ثم تغسل لوحة -well مع وسائل الإعلام من الآبار المقابلة في 24 لوحة جيدا ويغسل ثم يتم نقلها إلى بئر في 24 لوحة جيدا.
    3. آبار نقل A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 على لوحة Electroporation لل96-جيدا ل24-جيدا لوحة C الصف A، B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 في صف وB، C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 في صف وC و D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 في صف وD. بعد نقل كل مجموعة من 6 آبار من 96 لوحة -well إلى 24 لوحة جيدا، ثم يتم غسلها الآبار في لوحة 96-جيدا مع وسائل الإعلام من الآبار المقابلة في 24 لوحة جيدا ويغسل ثم يتم نقلها إلى بئر في 24 لوحة جيدا.
    4. آبار نقل E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 على لوحة Electroporation لل96-جيدا ل24-جيدا لوحة D الصف A، F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 في صف وB، G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 في صف وC و H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 في صف وD. بعد نقل كل مجموعة من 6 آبار من لوحة 96-جيدا لوحة 24-جيدا، والآبار في ال 96 ثم تغسل لوحة -well مع وسائل الإعلام من الآبار المقابلة في 24 لوحة جيدا ويغسل ثم يتم نقلها إلى بئر في 24 لوحة جيدا.
  17. باستخدام النقيض من المرحلة المجهر المقلوب، فحص 1 جيدا من كل عمود للتحقق من الخلايا. سوف يكون هناك خليط من الخلايا الحية والميتة معكمية كبيرة من الحطام الخلية. الخلايا الحية يمكن تمييزها عن الخلايا الميتة لأنها سوف يكون مشرقا تحت المجهر مرحلة التباين وسوف تتحرك.
  18. وضع لوحات 24-جيدا في ذلك، مربع من البلاستيك نظيفة مع غطاء التي تشكل ختم ضيق. وضع مربع في 28 درجة مئوية الحاضنة.
  19. بين 6-8 ساعة في وقت لاحق، إضافة 1 مل من SDM-79 مع 10٪ FCS تحتوي على المضادات الحيوية الانتقائية 2X إلى كل بئر. في تجربتنا، وخطوط الخلايا حيث يتم وضع علامة على الجينات على محطة N مقاومة لتركيزات أعلى من المخدرات انتقائية. لذلك، وذلك باستخدام blasticidin على سبيل المثال، وضع علامات على محطة N يتطلب تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل blasticidin ووضع علامات على C محطة يتطلب تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل blasticidin.
    ملاحظة: خطوط الخلايا المعدلة وراثيا تصبح مرئية 9-10 أيام بعد ترنسفكأيشن.
  20. مرور ما لا يقل عن مرتين في المخدرات الطازجة وسائل الإعلام قبل التحليل. ويبين الشكل 2B النتائج من نموذجية حوالة 96-جيداction لوضع علامات على 96 البروتينات المختلفة على محطة N. تقييم كل بئر من قبل النقيض من المرحلة المجهر لتحديد ما إذا كان يحتوي على الخلايا السليمة، ومقاومة المخدرات. بئر صحي يحتوي في الغالب (<95٪) خلايا نشطة للغاية التي هي مشرق في المجهر عقد المرحلة. مطلوب تحليلها لاحقا بواسطة المجهر epifluorescence أو لطخة غربية لتحديد ما إذا كان البروتين تم وضع علامة عليها بنجاح.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا ترنسفكأيشن التمثيلي، وقد صممت الاشعال باستخدام البرنامج النصي TagIt بيرل 9 و تصنيعه تجاريا. تم إجراء 96-جيدا PCR والتحقق من صحتها كما هو موضح (الشكل 1A)؛ في هذا المثال، كانت 95/96 تقارير إنجاز المشروعات الناجحة (الشكل 1B). في تجربتنا، وتكرار ردود الفعل فشلت إما مع الاشعال الأصلية أو توليفها إعادة الاشعال لا يؤدي إلى PCR ناجحة.

تم نقل amplicons في لوحات Electroporation لل96-جيدا ل electroporation (الشكل 2A)، ثم نقل إلى لوحات ثقافة 24-جيدا للانتعاش والاختيار. بعد ما يكفي من الوقت للسماح التحديد إلى أن يحدث، وسجل الآبار من أجل البقاء قبل إجراء مزيد من التحليل. في هذا المثال، كانت 88/96 بئرا (92٪) إيجابية بعد اختيار 15 يوما.


الشكل 1: التحقق من التمهيدي طويلة PCR (A) نمط لنقل المنتجات PCR من 96-جيدا لوحة PCR على هلام الاغاروز للتأكد من صحة PCR. (ب) 96-PCR جيدا هلام التحقق من صحة التمثيل لوضع علامات على 95 الجينات على محطة N، و 1 amplicon التي لا تحتوي على 5 "التي تستهدف تناظر ليكون بمثابة سيطرة سلبية في ترنسفكأيشن. يتم تحميل العينات على 1٪ (ث / ت) هلام الاغاروز وحلها في 100 فولت لمدة 30 دقيقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-1
الشكل 2: 96-جيدا Electroporation للواختيار (A) نمط لنقل خلايا electroporated من 96 جيدا بلات Electroporation لل.ه لوحات زراعة الأنسجة 24-جيدا. (ب) رسم تخطيطي يظهر الحي / الميت التهديف نموذجي بعد 15 يوما من التحديد في 24 لوحات جيدا. يمثل اللون الأخضر على ترنسفكأيشن ناجحة، يمثل الرمادي جيدا مع الخلايا الميتة فقط. في هذا المثال، 88/96 (92٪) من الآبار الواردة الطفيليات transfected بنجاح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وفرت تحسينات كبيرة في حساسية البروتينات وطرق transcriptomics في 5-10 سنوات الماضية بيانات قيمة عن الآلاف من الجينات ومنتجاتها. ومع ذلك، فإن أدوات للتصدي لها وظيفة هذه البروتينات لا تواكب.

وضع علامات على بروتين يسهل العديد من التجارب لتحديد وظيفتها. على سبيل المثال، وهو بروتين يمكن أن تنصهر لبروتين فلوري في مجموعة متنوعة من الألوان المختلفة لتسهيل توطين وشارك في توطين الدراسات. الكلمات وضعت لالمجهر الإلكتروني، مثل APEX2 أو miniSOG 11،12، تسمح توطين التركيبية للبروتين الكلمات الدلالية. الكلمات الدلالية لالكيمياء الحيوية، مثل علامة TAP، وProtC-TEV-ProtA (PTP) علامة 7،13 تسمح تنقية المجمعات المرتبطة البروتين لتحديد الشركاء ملزمة أو في فحوصات البيوكيميائية في المختبر.

الخطوات المحددة التي تعتبر بالغة الأهمية لنجاح protocرأ هي: إدماج DMSO في مزيج PCR ماستر 1، تجميد PCR ميكس ماجستير 1 قبل إضافة ميكس ماستر 2، واستخدام البلمرة التجاري في ميكس ماجستير 2 وتعديل المخزن المؤقت cytomix Electroporation لل. في تجربتنا، فمن الضروري استخدام ضعف عدد الخلايا للC تعداء محطة العلامات بالنسبة للN تعداء محطة العلامات من أجل تحقيق نسبة مماثلة من الآبار إيجابية. لذلك، يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات كما هو موضح.

ومن المرجح فقط أن تكون ناجحة عندما transfecting والحشرات procyclic شكل المثقية هذه التقنية. أشكال مجرى الدم لديهم أقل كفاءة ترنسفكأيشن 14، وعلاوة على ذلك فهي عرضة للوفاة خلال اختيار نظرا لسمية التي تعتمد على كثافة أن لا علاقة للدواء انتقائية. وبالتالي، يمثل بروتوكول لدينا السابق أفضل التقنيات الحالية لوضع علامات على شكل المثقبيات مجرى الدم 9. ومن المرجح أيضا أن العابرةوكفاءة الخمج (العدوى) تختلف يعتمد على عزل المثقية محددة. وكان محسن هذا البروتوكول باستخدام 927 SMOX أشكال procyclic - سلالات أخرى قد تتطلب التحسين إضافية. التدابير التي قد تزيد من احتمال النجاح وتشمل: زيادة كمية PCR amplicon، وزيادة عدد الخلايا المدرجة في ترنسفكأيشن.

ونحن نقدم وسيلة حيث مئات من البروتينات يمكن الموسومة بشكل متواز. وهذا سيسهل دراسات واسعة النطاق على توطين والتفاعل، واستكمال قواعد البيانات الكبيرة القائمة وتوفير معلومات لا تقدر بثمن للمجتمع. هي قوالب التمهيدي متوفرة عند الطلب وقائمة قوالب البلازميدات هو متاح من: http://www.sdeanresearch.com/

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SD مدعومة بزمالة السير هنري ويلكوم [092201 / Z / 10 / Z]. تم تمويل هذا العمل من خلال منح Wellcome Trust [WT066839MA] [104627 / Z / 14 / Z [108445 / Z / 15 / Z] للبروفيسور كيث جول. نود أن نشكر البروفيسور كيث جول على المحادثات والرؤى المفيدة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
OligonucleotideLifenadesalt فقط (لا تستخدم تنقية إضافية)
DMSORocheالمضمنة مع حزمة Expand HiFiيجب أن تكون بدرجة PCR
dNTPأي سمعة طيبة
Expand HiFi polymeraseRoche11759078001
BTX ECM830Harvard ApparatusElectroporator
HT-200 معالج الألواحهارفاردHT-200يتعامل مع الألواح الكهربائية ذات 96 بئرا
MOS 96 ELECTROPLATE 4 ممHarvard Apparatus45-0452Electroplate ل 96 بئر
Blasticidin S HydrochlorideMelford3513-03-9
Hygromycin b GoldInvivogenant-hg-1
PhleomycinMelfordP0187
225 سم قارورة TC ، رقبة معلقة ، غطاء فينوليAppletonwoodsBC006
24 لوحة ثقافة بئرAppletonwoodsBC017
Eppendorf & reg ؛ مبرد PCR ، نظام تخزين بارد بدون ثلج ل 96 لوحة بئر وأنابيب PCRSigma AldrichZ606634-1EA
96-well Multiply & reg ؛ لوحة PCR مع تنورة جانبيةSarstedt72.1979.203
تقنيات جهاز

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, S., Reed, J., et al. Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci. Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).
  2. Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).
  3. Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA. RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).
  4. Alsford, S., Turner, D. J., et al. High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome. Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).
  5. Alsford, S., Eckert, S., et al. High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance. Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).
  6. Mony, B. M., MacGregor, P., et al. Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei. Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).
  7. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology. Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  8. Los, G. V., Encell, L. P., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  9. Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids. Open biol. 5 (1), 140197(2015).
  10. Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor. Open biol. 2 (2), 110037(2012).
  11. Lam, S. S., Martell, J. D., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).
  12. Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS biology. , (2011).
  13. Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination. Eukaryotic Cell. , (2005).
  14. Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

96 TAP

مقالات ذات صلة