مقالة منهجية

مقارنة التبغ طرق إزالة المضيف بروتين الخلية من قبل السلق النباتات سليمة أو عن طريق المعالجة الحرارية من مقتطفات

8.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54343

⸱

أغسطس 8, 2016

 ,  , 
1Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 3Department of Biomolecular Separation Engineering, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

في هذه المقالة

ملخص

ثلاثة الحرارة وتعرض أساليب هطول الأمطار التي تزيل بشكل فعال أكثر من 90٪ من بروتينات الخلية المضيفة (HCPs) من التبغ المستخلصات قبل أي خطوة تنقية أخرى. محطة HCPs تتجمع بشكل لا رجعة فيه في درجات حرارة أعلى من 60 درجة مئوية.

الملخص

النباتات ليس فقط توفير الغذاء والعلف والمواد الخام للبشر، ولكن وضعت أيضا كنظام إنتاج اقتصادي للبروتينات الصيدلانية البيولوجية، مثل الأجسام المضادة، والمرشحين لقاح والانزيمات. هذه يجب تطهيره من الكتلة الحيوية النباتية ولكن تعوقهم الخطوات اللوني من تركيزات عالية من البروتينات الخلية المضيفة (HCPs) في المستخلصات النباتية. ومع ذلك، فإن معظم HCPs تتجمع بشكل لا رجعة فيه في درجات حرارة أعلى من 60 درجة مئوية تسهيل تنقية اللاحقة للبروتين الهدف. هنا، يتم تقديم ثلاث وسائل لتحقيق هطول حرارة HCPs التبغ في أي من الأوراق سليمة أو مقتطفات. وابيضاض الأوراق سليمة يمكن بسهولة دمجها في العمليات القائمة ولكن قد يكون لها تأثير سلبي على خطوات الترشيح لاحقة. العكس هو الصحيح لهطول الأمطار الحرارة من مستخلصات أوراق في وعاء أثار، التي يمكن أن تحسن أداء عمليات المصب ولكن مع تغييرات كبيرة في تصميم المعدات التكنولوجية، مثلهندسة الخالط. وأخيرا، الإعداد مبادل حراري ويتميز بشكل جيد من حيث شروط نقل الحرارة وسهلة الحجم، ولكن التنظيف يمكن أن يكون من الصعب، وربما يكون هناك تأثير سلبي على قدرة المرشح. أسلوب التصميم من بين التجارب يمكن استخدامها لتحديد معالم عملية الأكثر أهمية التي تؤثر إزالة المندوبية والانتعاش المنتج. هذا يسهل تطبيق كل طريقة في التعبير منصات أخرى، وتحديد الأسلوب الأكثر مناسبة لوضع استراتيجية تنقية معين.

المقدمة

تعتمد أنظمة الرعاية الصحية الحديثة بشكل متزايد على البروتينات الصيدلانية البيولوجية 1. إنتاج هذه البروتينات في النباتات هو مفيد نظرا لعبء الممرض منخفض وزيادة قابلية مقارنة بالأنظمة التقليدية التعبير 2-4. ومع ذلك، فإن التجهيز النهائي (DSP) من الأدوية المشتقة من النباتات يمكن أن يكون تحديا لأن إجراءات استخراج التخريبية تؤدي إلى عبء جسيم عالية، مع turbidities تتجاوز 5000 وحدة nephelometric التعكر (NTUs)، وبروتين الخلية المضيفة (المندوبية) تركيزات غالبا ما يتجاوز 95 ٪ [م / م] 5،6.

ويلزم توضيح إجراءات معقدة لإزالة جزيئات متفرقة 7-9، ولكن المعدات اللوني هو اقل كلفة للعمل في وضع مأزق، وأزل خلال الانتعاش المنتجات الأولية إذا كان هناك خطوة سابقة لإزالة فعالة من HCPs 10،11. ويمكن تحقيق ذلك إما عن طريق ترسيب البروتين الهدف باستخدام flocculالنمل 12 أو منخفضة الحموضة 13،14، وكذلك عن طريق التسبب في HCPs لتجميع. تجميع انتقائي من ريبولوز-1،5-bisphosphate كربوكسيلاز / أوكسيجيناز (RuBisCO)، والمندوبية الأكثر وفرة في النباتات الخضراء مثل التبغ (النيكوتين تبغ)، يمكن تعزيز بإضافة البولي ايثيلين جلايكول 15، ولكن هذا غير مكلفة وغير متوافقة مع كبير التصنيع -scale. وقد تبين أن المعالجة الحرارية لتفسد ويعجل أكثر من 95٪ من HCPs التبغ، في حين تبقى المرشحين لقاح الملاريا البروتين مثل Vax8 مستقر في حل 16-18.

تم استخدام ثلاثة أساليب مختلفة لتحقيق هطول الأمطار الناجمة عن الحرارة من HCPs التبغ: (ط) ابيضاض، أي غمر أوراق سليمة في السائل الساخن، (ب) درجة الحرارة التي تسيطر عليها أثار السفينة، و (iii) مبادل حراري ( الشكل 1) 16. لأوراق سليمة، وابيضاض حقق هطول السريع والفعال للHCPs وكان أيضا من السهللزيادة ومتوافقة مع عمليات التصنيع على نطاق واسع القائمة التي تتضمن الخطوة الأولى لغسل الكتلة الحيوية النباتية 19. في المقابل، سفن التحكم في درجة حرارته متاحة بالفعل في بعض العمليات، ويمكن استخدامها لعلاج الحرارية من المستخلصات النباتية 20، ولكن قابلية وسرعة نقل الطاقة محدودة لأن نسبة الدبابات السطح إلى الحجم تخفض تدريجيا و يصبح غير مناسب في نطاق العملية. مبادل حراري هو بديل من الناحية الفنية واضحة المعالم لتسخين الأوعية أثار ولكن يتطلب وفرة من التدفئة ووسائل الإعلام التبريد، على سبيل المثال، البخار والماء البارد، وكذلك معدل التدفق الحجمي لرقابة مشددة أن يتكيف مع هندسة مبادل حراري و خصائص وسائل الإعلام، على سبيل المثال، القدرة حرارة معينة. يوضح هذا المقال كيف أن كل الطرق الثلاث يمكن استخدامها لهطول الأمطار الناجمة عن الحرارة من HCPs التبغ، وHCPs النبات بشكل عام. إنشاء وتشغيل مجموعة شرق افريقياطريقة ساعة في إعداد مختبر يمكن استخدامها لتقييم مدى ملاءمتها لعمليات واسعة النطاق. التحدي الرئيسي هو تحديد نماذج مصغرة لأسفل الكافية والظروف الترشح لكل عملية تشبه الأجهزة والظروف التي استخدمت خلال عملية التصنيع على نطاق و. البيانات المقدمة هنا تشير إلى التجارب التي أجريت مع نباتات التبغ المعدلة وراثيا معربا عن مرشح لقاح الملاريا Vax8 والبروتين الفلوري عن dsRed 16، ولكن تم أيضا طبقت طريقة بنجاح إلى N. النباتات benthamiana يعبرون عن عابر البروتينات الصيدلانية البيولوجية الأخرى 21.

والتجارب التصميم من (وزارة الطاقة) نهج 22 يمكن أن تسهل عملية التنمية، والمرسب 23 ويمكن أيضا أن تكون مفيدة في هذا السياق كما هو موضح سابقا 8. والفرق الرئيسي بين ابيضاض والأوعية الساخنة والمبادلات الحرارية هو أن يتم تطبيق ابيضاض لأوراق سليمة في وقت مبكر من عملية في حين أن التمديديتم تطبيق لها على المستخلصات النباتية (الشكل 1).

figure-introduction-1
الشكل 1: مخطط تدفق عملية يوضح تنفيذ ثلاثة طرق مختلفة للتبغ المندوبية الحرارة الهطول يغسل المواد النباتية والمتجانس قبل توضيح وتنقية. يمكن بسهولة أن تضاف المعدات اللازمة لخطوة ابيضاض (أحمر) إلى الآلية القائمة. في المقابل، وذلك باستخدام سفينة أثار (برتقالي) وخصوصا مبادل حراري (الأزرق) يتطلب واحد أو عدة أجهزة إضافية والأنابيب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. زراعة نباتات التبغ

  1. طرد كل كتلة الصوف المعدني مع 1-2 لتر من الماء منزوع الأيونات وفي وقت لاحق مع 1 لتر من 0.1٪ [ث / ت] حل الأسمدة. وضع بذور التبغ واحد في كل كتلة الصوف المعدني وتدفق بلطف مع 0.25 لتر من محلول السماد دون تجرف البذور 16.
  2. زراعة نباتات التبغ لمدة 7 أسابيع في دفيئة مع الرطوبة النسبية 70٪، وهو الضوئية 16 ساعة (180 مكرومول ثانية - 1 م - 2، λ = 400-700 نانومتر) و25/22 درجة مئوية ضوء / نظام درجة الحرارة الظلام.
  3. حصاد جميع الأوراق باستثناء الأوراق فلقة أربعة، والتي تقع في قاعدة ساق نبات.

2. الاختياري: الحرارة الهطول التي كتبها السلق

ملاحظة: إجراء الخطوات الموضحة في الخطوات 2،1-2،12 لتسريع HCPs التبغ ابيضاض. تخطي المقطع بالكامل 2، إذا كان سيتم عجل HCPsفي وعاء ساخن (القسم 4) أو باستخدام مبادل حراري (القسم 5).

  1. جانبا 50 غرام من المواد النباتية وتنفيذ استخراج دون ابيضاض (القسم 3). أخذ عينة من هذا المستخلص باعتبارها الرقابة الداخلية خلال تحليلها لاحقا (المادة 7).
  2. انشاء حمام 8-L حجم العمل المياه، على سبيل المثال، 50 × 40 × 40 سم، في معزولة حراريا دلو من البوليستيرين أو ما شابه ذلك. جبل الحرارة قابل للتعديل على حمام مائي لمدة التحكم في درجة الحرارة لاحقة (الخطوة 2.7).
  3. نقل التجمع كله على طبق من ذهب تحريك مغناطيسي ووضع شريط مغناطيسي في حمام مائي. تأكد من أن المجال المغناطيسي قوي بما فيه الكفاية لتدوير بقضيب.
  4. تحيط بقضيب مع أربعة على الأقل البلاط الدعم التي تقوم عليها سلة البولي بروبلين (الخطوة 2.6) سيتم وضعها في وقت لاحق أثناء إجراء ابيضاض. تأكد من أن البلاط دعم مصنوعة من مادة غير مغناطيسية (على سبيل المثال، سبائك الصلب غير القابل للصدأ تحتوي على النيكل) وأنهمأعلى من بقضيب (الشكل 2).
  5. إضافة 8 لتر من الماء منزوع الأيونات إلى حمام الماء.
    ملاحظة: استخدام منطقة عازلة، على سبيل المثال، 50 ملي فوسفات الصوديوم (7.5 درجة الحموضة)، ويمكن تحسين غلة البروتين الهدف إذا ما كان انخفاض هطول الأمطار ودرجة الحموضة قضية.
  6. وضع 23 × 23 × 23 سم سلة البولي بروبلين على البلاط الدعم وتأكد من أن السلة لا تتداخل مع دوران بقضيب وأنها مغمورة تماما في السائل. إذا لزم الأمر، إضافة كميات إضافية من الماء / عازلة حتى يتم المغمورة سلة تماما، ثم إزالة سلة مرة أخرى.
    تنبيه: جميع الخطوات اللاحقة تصل إلى 2.12 تنطوي على التعامل مع السائل الساخن. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة بما في ذلك القفازات معزولة حراريا.
  7. استخدام الحرارة قابل للتعديل لجعل حمام الماء إلى 70 درجة مئوية (أو درجة الحرارة المطلوبة للتجارب). انتظر 15 دقيقة على الأقل بعد الوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة لضمان تجميع كامل قد وصلت إلى محطات الطل التوازن.
  8. إعداد 150 غ قسامات من أوراق التبغ المقطوع. ضع قسامة واحدة في سلة مع تجنب ضغط لا رجعة فيه والأضرار التي لحقت الأوراق، على سبيل المثال، من خلال تمزيق. تجنب الملئ سلة مع المواد النباتية أو التعبئة الكثيفة لهذه الأخيرة.
  9. بعناية ولكن سرعان ما يغرق سلة في السائل الساخن ووضعه على البلاط الدعم. وضع كتلة الفولاذ المقاوم للصدأ على قمة السلة لمنع التعويم.
  10. احتضان يترك لمدة 5 دقائق في السائل ابيضاض، أو حدد وقتا تناسب التصميم التجريبي. رصد درجات الحرارة السائلة خلال فترة الحضانة بأكملها.
  11. بعناية إزالة سلة من السائل ابيضاض والسماح نزيف السائل المتبقي من الأوراق لمدة 30 ثانية. ثم أخذ أوراق النبات من سلة، نقلها إلى الخلاط وتبدأ على الفور استخراج (القسم 3).
    ملاحظة: النباتات يمكن أن تبقى لفترات طويلة من الزمن بعد ابيضاض وقبل بدء عشراستخراج ه، على سبيل المثال، تم اختبار أكثر من 30 دقيقة على الجليد أو تجميدها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لعدة أسابيع بنجاح. ومع ذلك، استقرار المنتج قد تنخفض مع زيادة تخزين مرات، وبالتالي ينصح معالجته فورا.
  12. كرر الخطوات من 2،8-2،11 مع المواد رقة جديدة حتى تتم معالجة الكتلة الحيوية حصادها بأكملها.

3. البروتين استخراج من أوراق التبغ

تنبيه: الخطوات المقبلة تشمل الخلاط مع شفرات دوارة. لا تعمل في دلو خلاط في حين يتم تركيبه على محرك خلاط.

  1. وضع 150 غ (الكتلة الرطبة) من حصاد (الخطوة 1.3) أو المقشر (الخطوة 2.11) يترك في الخلاط وإضافة 450 مل من استخراج العازلة (50 ملي فوسفات الصوديوم، 500 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي disulfite الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0).
    ملاحظة: تكوين استخراج العازلة يعتمد على البروتين ليكون استخراجه، وبالتالي يمكن أن تتطلب التعديل، على سبيل المثال، استخدام الرقم الهيدروجيني آخر أو العازلة مكون مثل آرهو.
  2. التجانس ويترك لمدة 3 × 30 نبضات في الثانية مع 30 ثانية تتخللها فترات راحة. تأكد من أن الأوراق هي متجانسة ولا تسد دلو خلاط. وقف خلاط ورفع الأوراق لمنع انسداد إذا لزم الأمر، ومن ثم مواصلة التجانس.
  3. أخذ عينة 1 مل من كل مستخلص التي يتم إنتاجها لتحليلها لاحقا (المادة 7). إذا تم المقشر المواد النباتية، تابع إلى القسم 6. مواصلة إلا مع هطول الأمطار الحرارة في وعاء (القسم 4) أو مبادل حراري (القسم 5)، اعتمادا على المنهج التجريبي المحدد.

4. اختياري: الحرارة الهطول في سفينة حرك

ملاحظة: إجراء الخطوات الموضحة في الأقسام 4،2-4،11 لتسريع HCPs التبغ في وعاء أثار. تخطي المقطع بالكامل 4، إذا تم عجلت HCPs من ابيضاض (القسم 2) وإلا سيتم عجلت باستخدام مبادل حراري (القسم 5).

  1. إنشاء شركتين 8 لتر ماء حجم العملالحمامات، وعلى سبيل المثال، 50 × 40 × 40 سم، في رغوة البوليسترين العازلة حراريا أو ما شابه ذلك. في الحمام الأول، جبل الحرارة قابل للتعديل التحكم في درجة حرارة اللاحقة (الخطوة 4.6). في الثانية، إضافة 5 لترات من الماء منزوع الأيونات و 2 كجم من الثلج لتبريد لاحق (الخطوة 4.9).
  2. نقل حمام الماء الأول على لوحة تحريك مغناطيسي، ووضع 2-L سفينة الفولاذ المقاوم للصدأ في حمام مائي بحيث يكون مركز للسفينة هو الانحياز إلى وسط لوحة ضجة.
  3. وضع شريط مغناطيسي في وعاء الفولاذ المقاوم للصدأ. تأكد من أن المجال المغناطيسي قوي بما فيه الكفاية لتدوير بقضيب.
  4. املئي حوض الاستحمام بالماء مع الماء منزوع الأيونات إلى 5 سم تحت الحافة العلوية للسفينة الفولاذ المقاوم للصدأ. ثم ملء الوعاء مع استخراج العازلة. وضع غطاء رغوة البوليسترين على متن السفينة.
    تنبيه: جميع الخطوات اللاحقة تصل إلى 4.9 تنطوي على التعامل مع السائل الساخن. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة بما في ذلك الوظائف حرارياقفازات ulated.
  5. إدراج مقياس الحرارة في الإناء الصلب غير القابل للصدأ من خلال ثقب تناسب في الغطاء رغوة البوليسترين. ضبط درجة حرارة حمام الماء إلى 78 درجة مئوية، واحتضان التجمع بأكمله لمدة 15 دقيقة للوصول إلى التوازن الحراري. تأكد من أن درجة الحرارة في السفينة 70 درجة مئوية، ما يقرب من 8 درجة مئوية أقل من نقطة مجموعة من حمام الماء.
  6. إذا كانت درجة الحرارة في السفينة الفولاذ المقاوم للصدأ تختلف من 70 درجة مئوية، وضبط درجة الحرارة في حمام مائي وفقا لذلك، والسماح للنظام تتوازن لمدة 15 دقيقة أخرى. كرر هذه الخطوة حتى درجة الحرارة في السفينة 70 درجة مئوية أو على النحو المطلوب لهذه التجربة، وتفريغ السفن من الصلب غير القابل للصدأ.
  7. صب 300 مل من مستخلص (الخطوة 3.2) في الإناء الفولاذ المقاوم للصدأ حين انها لا تزال في حمام مائي وبدء الموقت. تحريك استخراج في 150 دورة في الدقيقة واحتضان لمدة 5 دقائق. تأكد من أن استخراج يصل إلى درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة على الأقل خلال هذه الفترة الحضانة.
  8. إزالة حمام الماء الساخن من محرك مغناطيسي، واخراج السفينة الفولاذ المقاوم للصدأ ووضعه في دلو الجليد الباردة. وضع هذا الأخير على محرك مغناطيسي وإزالة الغطاء رغوة البوليسترين.
  9. تأكد من أن جناسة المصنع هو تحريكها جيدا في 150 دورة في الدقيقة، ووضع ميزان الحرارة في استخراج واحتضان حتى يصل إلى درجة حرارة 20 درجة مئوية أو درجة الحرارة المحددة من قبل التصميم التجريبي.
  10. كرر الخطوات من 4،7-4،9 لجميع قسامات. أخذ عينة 1 مل من كل حرارة عجلت استخراج بمجرد أن وصلت درجة الحرارة النهائية، ثم المضي قدما في القسم 6.

5. اختياري: الحرارة الهطول في المبدل الحراري

ملاحظة: إجراء الخطوات الموضحة في الأقسام 5،2-5،12 لتسريع HCPs التبغ باستخدام مبادل حراري. تخطي المقطع بالكامل 5، إذا تم عجلت HCPs من ابيضاض (القسم 2) أو في وعاء ساخن (القسم 4).

  1. إنشاء شركتين حجم العمل 8-Lحمامات المياه، على سبيل المثال، 50 × 40 × 40 سم، في الدلاء رغوة معزول حراريا البوليستيرين أو ما شابه ذلك. في الحمام الأول، جبل الحرارة قابل للتعديل التحكم في درجة حرارة اللاحقة (الخطوة 5.3). في الثانية، إضافة 5 لترات من الماء منزوع الأيونات و 2 كجم من الثلج لتبريد لاحق (الخطوة 5.10).
    تنبيه: جميع الخطوات اللاحقة تصل إلى 5.9 تنطوي على التعامل مع السائل الساخن. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة بما في ذلك القفازات معزولة حراريا.
  2. املئي حوض الاستحمام بالماء الأول مع 8 لتر ماء منزوع الأيونات. ضبط درجة الحرارة إلى 74.5 درجة مئوية باستخدام الحرارة. احتضان الجمعية لمدة 15 دقيقة للوصول إلى التوازن الحراري.
  3. إعداد عاء تخزين معزول عن طريق وضع كوب من البلاستيك 0.5 L إلى 1-L كوب من البلاستيك وملء الفجوات مع القطن والصوف. بدلا من ذلك، استخدم مخصصة سفينة معزول حراريا مع حجم العمل 0.5 لتر.
  4. ربط مبادل حراري لمضخة تحوي في نهاية واحدة وإلى خرطوم منفذ على تنقية المياهص إنهاء استخدام L / S 24 الأنابيب. وضع كل من أنابيب ينتهي جنبا إلى جنب مع ميزان حرارة في وعاء تخزين معزولة وملء مع 300 مل استخراج العازلة (الشكل 2).
  5. وضع مبادل الحرارة في حمام الماء الساخن وبدء ضخ تحوي بمعدل 300 مل دقيقة -1. تأكد من أن درجة الحرارة مما أدى إلى السفينة 70 درجة مئوية، وحوالي 4.5 درجة مئوية أقل من نقطة مجموعة من حمام الماء، وبعد 3 دقائق.
  6. إذا كانت درجة الحرارة في الأوعية الدموية معزول تختلف من 70 درجة مئوية، وضبط درجة الحرارة في حمام مائي وفقا لذلك، والسماح للنظام تتوازن لمدة 15 دقيقة أخرى. كرر هذه الخطوة حتى درجة حرارة زيادات استخراج العازلة من المحيط إلى 70 درجة مئوية في أقل من 3 دقائق، أو ما يعادل ذلك المطلوب لهذه التجربة، وتفريغ السفينة الفولاذ المقاوم للصدأ.
  7. تجاهل استخراج العازلة من السفينة معزولة وإعداد قسامات 300 مل من مستخلصات نباتية. ملء وعاء معزول مع قسامة واحدة.
  8. ضخ مستخلصات نباتية (القسم 3.3) من خلال مبادل حراري في 300 مل دقيقة -1 لمدة 5 دقائق. تأكد من أن استخراج درجة الحرارة 70 درجة مئوية بعد 3 دقائق، أو تساوي درجة الحرارة المحددة في التصميم التجريبي.
  9. بعد 5 دقائق، ضع مبادل الحرارة في حمام الماء المثلج في حين لا يزال يجري ضخها للاستخراج. احتضان في هذا الإعداد حتى تصل درجة الحرارة بالضبط 20 درجة مئوية، أو درجة الحرارة المحددة في التصميم التجريبي.
  10. إزالة خرطوم مدخل متصلة مضخة تحوي من السفينة معزولة ومواصلة ضخ لجمع المتبقي عجلت الحرارة مستخلصات نباتية من داخل مبادل حراري. ثم توقف المضخة.
  11. كرر الخطوات من 5،7-5،10 لجميع قسامات. أخذ عينة 1 مل من كل مستخلص عجلت الحرارة بمجرد أن وصلت درجة الحرارة النهائية، ثم تمر على مقتطفات إلى حقيبة الترشيح (المادة 6).
    ملاحظة: بعد الدورة الأولى الخطوات من خلال 5،7 حتي 5،10 لن يكون هناك استخراج العازلة لتجاهل في الخطوة 5.7.

6. حقيبة الترشيح من مستخلصات نباتية

  1. جبل مرشح حقيبة في سلة الدعم المقابلة التي يتم تركيبها في السكن مرشح ويقدم الدعم الميكانيكي للمواد التصفية مرنة. وضع وعاء 1-L تحت السلة، وتطبيق استخراج قسامات (قسم 3.3، 4.10 أو 5.11 اعتمادا على المعالجة الحرارية مختارة) للكيس بمعدل 150 مل دقيقة -1.
  2. بعد الترشيح، وقياس العكارة من 1:10 التخفيف من الترشيح في استخراج العازلة باستخدام مقياس العكر.
  3. أخذ عينة 1 مل ومعالجة كيس الترشيح على النحو المحدد في التصميم التجريبي، على سبيل المثال، والترشيح العمق و7،10 اللوني.

تحليل 7. عينة

  1. قياس كمية البروتين الكلي للذوبان (TSP) باستخدام طريقة برادفورد 24،25.
    1. في ثلاث نسخ، ماصة 2.5 ميكرولتر من كل عينة في الآبار واحدة منلوحة 96-جيدا. تشمل ثمانية معايير ألبومين المصل البقري (BSA) في ثلاث نسخ تغطي مجموعة 0 - 2000 ميكروغرام مل -1.
    2. إضافة 200 ميكرولتر برادفورد الكاشف إلى كل بئر ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا ولكن بلطف بما يكفي لتجنب تشكيل فقاعات.
    3. احتضان لمدة 10 دقيقة في 22 درجة مئوية، وقياس الامتصاصية في 595 نانومتر في معمل. حساب تركيز TSP في العينات على أساس منحنى القياسية من خلال نقاط مرجعية جيش صرب البوسنة.
  2. تحديد Vax8 من مأكل سطح الرنين الطيفي 26.
    1. إعداد السطح مأكل صدى الصك مع 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) العازلة تشغيل (10 ملي HEPES، 3 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، 1500 ملي كلوريد الصوديوم، 0.05٪ ت / ت بوليسوربات 20، ودرجة الحموضة 7.4) وجبل شريحة سطح ديكستران carboxymethylated في الجهاز. استخدام وظيفة أساسية للقضاء على النظام وبدء تشغيل اليدوي مع معدل التدفق من 30ميكرولتر دقيقة -1 على تدفق الخلايا 1 و 2. حقن 30 ملي كلوريد الهيدروجين مرتين لمدة 60 ثانية مع 60 ثانية حقن يتخلل من هيدروكسيد الصوديوم 25 ملم.
    2. إعداد 200 ميكرولتر من 500 ميكروغرام مل -1 ماب 5.2 حل في 10 ملي خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 4.0). ذوبان الجليد 1-إيثيل-3- (3-dimethylaminopropyl) هيدروكلوريد carbodiimide (EDC) وN -hydroxysuccinimide (NHS) قارورة وأجهزة الطرد المركزي لهم في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة. مزيج 70 ميكرولتر من EDC مع 70 ميكرولتر من NHS ونقل إلى قارورة بلاستيكية 7 ملم.
    3. تفعيل carboxymethylated ديكستران سطح رقاقة سطح عن طريق حقن خليط EDC / NHS على تدفق الخلايا 1 و 2 لمدة 10 دقيقة مع معدل التدفق من 10 ميكرولتر دقيقة -1.
    4. تعيين مسار تدفق في التدفق الخلوي 2 فقط. زوجان ماب 5.2 عن طريق حقنه لمدة 15 دقيقة بمعدل 10 -1 دقيقة ميكرولتر.
    5. تبديل مسار التدفق إلى تدفق الخلايا 1 و 2 و حقن إيثانولامين لمدة 7 دقيقة بمعدل 5 ميكرولتر دقيقة -1 إلى تنشيط السطح. تالدجاجة حقن 30 ملي كلوريد الهيدروجين مرتين لمدة 60 ثانية مع 60 ثانية حقن يتخلل 25 ملي هيدروكسيد الصوديوم.
    6. حقن عينات وMSP1 - 19 المعايير بمعدل 30 دقيقة ميكرولتر -1 لمدة 180 ثانية. تأكد من أن تركيز Vax8 50 - 1000 نانوغرام مل -1. إعداد ما قبل التخفيفات في HEPES مخزنة المالحة التي تحتوي على EDTA وبوليسوربات 20 (HBSEP) إذا لزم الأمر.
    7. طرح ذروة إشارة من خلية تدفق 1 من ذلك من خلية تدفق 2 واستخدام الفرق لحساب تركيز Vax8 في عينات بناء على إشارة من حركة مجتمع السلم 1 - حقن 19 مع تركيز بروتين يعرف من 500 نانوغرام مل -1.
    8. تجديد سطح رقاقة بعد كل عينة أو MSP 1-19 حقن عن طريق التعرض إلى 30 ملي كلوريد الهيدروجين لمدة 60 ثانية بمعدل تدفق 30 دقيقة ميكرولتر -1.
  3. قياس عن dsRed التي كتبها الطيف مضان
    1. في ثلاث نسخ، ماصة 50 ميكرولتر من كل عينة في الآبار واحدة من أسود نصف AR-عصام 96-جيدا لوحة. تشمل ستة معايير عن dsRed تغطي مجموعة 0-225 ميكروغرام مل -1.
    2. قياس مضان في مكررة باستخدام 530 ± 30 نانومتر الإثارة فلتر و 590 ± 35 مرشح الانبعاثات نانومتر في معمل. حساب تركيز عن dsRed في العينات على أساس منحنى القياسية من خلال النقاط المرجعية عن dsRed.
  4. تحديد توزيع حجم الجسيمات
    1. غسل كفيت مع 1 مل الأيزوبروبانول ثم مع 2 مل من الماء منزوع الأيونات لإزالة جزيئات الغبار. ماصة 850 ميكرولتر من العينة إلى كفيت.
    2. ضع كفيت في زيتا المحتملة والجسيمات محلل حجم. فتح "البرنامج" وبدء القياس اليدوي مع "البروتين" كمادة و"PBS"، كما مشتتة. تحديد درجة حرارة 25 درجة مئوية، ووقت موازنة من 180 ثانية.
    3. اختيار "DTS0012" خلية والتدبير في 173 ° ارتدادي. التحقق من "السيارات" وظيأيون لمدة قياس وتحديد ثلاثة قياسات دون أي تأخير تتخللها.
    4. التحقيق في حجم الجسيمات ذروة التوزيع الشخصية مرة واحدة في قياس كاملة عن طريق تحديد القياسات ثلاثة من أفراد العينة في عرض التجربة. اختيار "حجم PSD" علامة التبويب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هطول حرارة بروتينات الخلية المضيفة التبغ ابيضاض
وقد استخدم الإجراء ابيضاض هو موضح في القسم 2. بنجاح لترسيب HCPs من أوراق التبغ مع 70 درجة مئوية، والحد من TSP بنسبة 96 ± 1٪ (ن = 3)، في حين يتعافى تصل إلى 51٪ من البروتين المستهدف Vax8، وبالتالي زيادة في نقاء من 0.1٪ إلى 1.2٪ قبل الفصل الكروماتوغرافي 16. كان من الممكن أيضا لاسترداد 83 ± 1٪ (ن = 3) من البروتين عن dsRed الفلورسنت، وزيادة نقاوتها من 3.3٪ إلى 64.1٪. تم دمج الإجر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الطرق الثلاثة لهطول الأمطار الحرارة المذكورة أعلاه يمكن أن تزيل بفعالية HCPs التبغ قبل أي تنقية خطوة الكروماتوغرافي 16،17. وهي تكمل غيرها من الاستراتيجيات التي تهدف إلى زيادة نقاء الأولي المنتج، على سبيل المثال، تعرق النبات 29، rhizosecretion 30 أو الطرد المركزي استخراج 31،32، والتي تقتصر على البروتينات يفرز. ومع ذلك، فإن أساليب تعتمد على الحرارة يمكن أن تستخدم إلا بطريقة مجدية إذا كان البروتين الهدف المراد تنقيتها يمكن أن تحمل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

شكر وتقدير

نود أن نتوجه بالشكر إلى الدكتور توماس راديماخر وألكسندر بويس وفيرونيك بيس لتوفير بذور التبغ المعدلة وراثيا ، وإبراهيم العميدي لزراعة نباتات التبغ. يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور ريتشارد إم تويمان على المساعدة التحريرية وكذلك Güven Edgü على توفير مرجع MSP1-19. تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل منحة مجلس البحوث الأوروبي المتقدمة "Future-Pharma" ، الاقتراح رقم 269110 ، و Fraunhofer-Zukunftsstiftung (مؤسسة Fraunhofer Future Foundation) و Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs بموجب المنحة رقم . اجذب 125-600164.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2100P مقياس التعكر المحمولHach4650000التعكر
أمين اقتران كيتGE HealthcareBR100050 طقم اقتران رقاقة SPR
سلة التعقيمNalgene6917-0230سلة لتبييض الأوراق
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01جهاز SPR
محلل الخلايا الحيوية BCA 003 R & D مع 3D ORMSequipn.a.محللحجم الجسيمات
خلاطWaring800EGخلاط
BP-410Furh2632410001كيس مرشح
الطرد المركزي 5415DEppendorf5424 000.410
أنبوب الطرد المركزي 15 ملLabomedic2017106أنبوب
رد الفعل أنبوب الطرد المركزي 50 مل قائم بذاتهLabomedic1110504Reaction أنبوب
CM5 رقاقةGE HealthcareBR100012 رقاقة لقياسات SPR
كوفيت 10 × 10 × 45سارستيد67.754كوفيت لمزيعة زيتاسيزر نانو ZS
Design-Expert (R) 8Stat-Ease، Inc.برنامج n.a.DoE
فوسفات ثنائي الصوديومCarl Roth GmbH  4984.3 مكون الوسائط
Ferty 2 MegaKammlott5.220072سماد
فورما -86C فريزر ULTThermoFisher88400فريزر
دفيئةn.a.n.a.لزراعةالنباتات
مكعبات الصوف الصخري Grodan 10 × 10 سمGrodan102446كتلة الصوف الصخري
مبادل حراري Twentey-loop (طول 4.8 متر)n.a. (تصميم مخصص)n.a.heat مبادل
HEPESCarl Roth GmbH9105.3مكون الوسائط
K200P 60DPall5302303طبقة مرشح العمق
KS50P 60DPallB12486طبقة مرشح العمق
Lauda E300Lauda Dr Wobser GmbHZ90010ترموستات حمام مائي
L / S 24MasterflexSN-06508-24أنابيب
mAb 5.2مجموعة الثقافة من النوع الأمريكيHB-9148Vax8 جسم مضاد محدد
Masterflex L / SMasterflexHV-77921-75مضخة تمعجية
MiraclothLabomedic475855-1Rقماش مرشح
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020مقياس الأس الهيدروجيني / مقياس الموصلية
Osram أبيض بارد 36 واطOsram4930440مصدر الضوء
PhytotronIlka Zelln.a.لزراعةالنباتات
ثاني كبريفيت الصوديومCarl Roth GmbH8554.1مكون الوسائط
كلوريد الصوديومCarl Roth GmbHP029.2مكون الوسائط
وعاء من الفولاذ المقاوم للصدأ ؛ 0.7 كجم 2.0 لتر ؛ ارتفاع 180 مم ؛ قطر 120 ممNA (تصميم مخصص)n.a.حاويةلهطول الأمطار
الحرارية Synergy HTBioTekSIAFRTقارئ الألواح الفلورية والطيفية
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Filter Housing
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS قياس توزيع حجم الجسيمات
Zetasizer Software v7.11Malvernn.a.Softwareلتشغيل جهاز Zetasizer Nano ZS
مقياس

المراجع

  1. PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
  2. Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  3. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
  4. Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  9. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  11. Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
  12. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  13. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  14. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  15. Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
  16. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  17. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  18. Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
  19. Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
  20. Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
  21. Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
  22. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216(2014).
  23. Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940(2016).
  24. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
  25. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  26. Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
  27. Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
  28. Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
  29. Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
  30. Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
  31. Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
  32. Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
  33. Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
  34. Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
  35. Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
  36. Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
  37. Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
  38. Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
  39. Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
  40. Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336(2006).
  41. Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
  42. Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة