مقالة منهجية

السلوكيات حاسة الشم يعاير التي تتبع الكمبيوتر ذبابة الفاكهة في Olfactometer أربعة رباعي

DOI:

10.3791/54346

⸱

أغسطس 20, 2016

 ,  , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Center for Sensory Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2MRC Clinical Sciences Center, Imperial College London

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف هنا طريقة الإعداد السلوكي وتحليل البيانات لفحص الاستجابات الشمية لما يصل إلى 100 ذبابة خل (ذبابة الفاكهة السوداء). يمكن استخدام هذا النظام مع محفزات شمية مفردة أو متعددة ، وقابل للتكيف مع التنشيط البصري الوراثي أو إسكات المجموعات الفرعية العصبية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويكمن التحدي الرئيسي في بيولوجيا الأعصاب هو فهم كيف الدوائر العصبية تعمل لتوجيه سلوكيات الحيوان المناسبة. ذبابة الفاكهة هو نظام نموذجا ممتازا لمثل هذه التحقيقات بسبب سلوكياتها معقدة، تقنيات وراثية قوية، والجهاز العصبي المضغوط. وقد استخدمت مختبر فحوصات السلوكية طويلة مع ذبابة الفاكهة لمحاكاة خصائص البيئة الطبيعية ودراسة الآليات العصبية الكامنة وراء السلوكيات المقابلة (على سبيل المثال انجذاب ضوئي، الكيميائي، والتعلم الحسية والذاكرة) 1-3. مع توافر الأخيرة من مجموعات كبيرة من خطوط ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا أن تسمية مجموعات فرعية العصبية محددة، وقد اتخذت المقايسات السلوكية على الدور البارز لربط الخلايا العصبية مع السلوكيات 4-11. نماذج متعددة وقابلة للتكرار، جنبا إلى جنب مع إجراءات الحسابية الأساسية لتحليل البيانات، لا غنى عنها لاختبارات سريعة لخطوط الطيران مرشح مع مختلف genotypوفاق. ولا سيما مفيدة هي الاجهزة التي تتسم بالمرونة في عدد الحيوانات المختبرة، ومدة التجارب وطبيعة المحفزات المقدمة. يجب فحص الاختيار أيضا توليد البيانات استنساخه التي هي سهلة للحصول على وتحليلها. هنا، نقدم وصفا مفصلا للنظام وبروتوكول لمعايرة الاستجابات السلوكية ذبابة الفاكهة الذباب في الساحة أربعة ميدانية كبيرة. يستخدم الإعداد هنا لفحص ردود الذباب لحافز الشم واحد؛ ومع ذلك، قد يتم تعديل نفس الإعداد لاختبار حاسة الشم متعددة، والمحفزات البصرية أو علم البصريات الوراثي، أو مزيج من هذه. الإعداد olfactometer يسجل النشاط السكان ذبابة الرد على الروائح، وتطبق الأساليب التحليلية الحسابية لتحديد السلوكيات الطاير. ويتم تحليل البيانات التي تم جمعها للحصول على قراءة سريعة التدريجي من شوط التجريبية، وهو أمر ضروري لجمع البيانات بكفاءة والاستفادة المثلى من الظروف التجريبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على التكيف والاستجابة للبيئة الخارجية هو أمر حاسم لبقاء جميع الحيوانات. يحتاج الحيوان إلى تجنب المخاطر، والسعي إلى الطعام وتجد زملائه، والتعلم من التجارب السابقة. تعمل أنظمة حسية لاستقبال مجموعة متنوعة من المحفزات، مثل البصرية والكيميائية وميكانيكية حسية، وترسل هذه الإشارات إلى الجهاز العصبي المركزي إلى أن تفسر وفك الشفرة. الدماغ ثم يوجه السلوكيات الحركية المناسبة تبعا لبيئة ينظر إليها، مثل بحثا عن الغذاء أو الهروب من الحيوانات المفترسة. فهم كيفية الكشف عن أنظمة حسية العالم الخارجي، وكيف يترجم المخ ويوجه القرارات، تحديا كبيرا في علم الأعصاب.

ذبابة الفاكهة هو نظام نموذج قوي للتحقيق في كيفية العصبية السلوكيات الدوائر دليل. وبالإضافة إلى كونها بسيطة وغير مكلفة للحفاظ على، ذبابة الفاكهة المعرض العديد من السلوكيات المتنوعة والمعقدة النمطية، ولكن القيام بذلك مع COMPACر الجهاز العصبي من حوالي 100،000 الخلايا العصبية. وتوجد تقنيات وراثية قوية لمعالجة جينوم ذبابة الفاكهة، والآلاف من خطوط المعدلة وراثيا قد تولدت أن تسمية انتقائي وبتكاثر نفس مجموعات فرعية من الخلايا العصبية 10-13. هذه خطوط المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم للتلاعب بشكل انتقائي على نشاط الخلايا العصبية المسماة (تنشيط أو تثبيط)، وهذه المعالجات يمكن استخدامها للتحقق من مدى العصبية السلوكيات وظائف دليل.

وقد وضعت المقايسات سلوكية متعددة لدراسة مختلف السلوكيات ذبابة الفاكهة. ذبابة الفاكهة، مثل العديد من الحيوانات، واستخدام حاسة الشم لتوجيه العديد من الخيارات السلوكية، مثل إيجاد الغذاء، وإيجاد الاصحاب، وتجنب المخاطر. لذا الشم هو نظام الحسي جيد للتحقيق في كيفية الكشف عن المؤثرات الخارجية وتفسيرها من قبل الجهاز العصبي للحيوان لتوجيه الخيارات المناسبة. على هذا النحو، وقد وضعت عددا من المقايسات لinvestigaتينغ اليرقات والسلوكيات حاسة الشم الكبار. تقليديا، كانت يعاير السلوكيات حاسة الشم في ذبابة الفاكهة عن طريق الاختيار اثنين النموذج T-متاهة، والتي يمكن أن تستخدم لمعايرة الفطرية وتعلم السلوكيات حاسة الشم 3. في هذا الاختبار، يتم منح حوالي 50 الذباب الاختيار بين اثنين من أنابيب: أنبوب واحد يحتوي على رائحة في مسألة والآخر يحتوي على الرائحة التحكم (عادة المذيب رائحة). وترد الذباب فترة معينة من الوقت لاتخاذ خيار، ثم عدد من الذباب التي هي في غرف مختلفة تحسب. على الرغم من أن T-متاهة هو فحص بسيط للعديد من التجارب، وهناك العديد من القيود. على سبيل المثال، يتم قياس السلوكيات حاسة الشم عند نقطة مرة واحدة فقط، ويتم التخلص منها خيارات مختلفة ألقاه أمام هذه نقطة زمنية. وبالمثل، فإن إهمال السلوكيات الفردية من الذباب في أوساط السكان. بالإضافة إلى ذلك، T-متاهة يتطلب العد والفرز اليدوي من الذباب، والتي قد إدخال أخطاء. وأخيرا، لأن هناك خيارين فقط مدروسة، وهذايقلل من القدرة الإحصائية في كثير من الأحيان المطلوبة للكشف عن التغيرات السلوكية خفية. بديل للاختيار من اثنين T-متاهة هو أربعة رباعي (أربعة الحقل) olfactometer 14-18. في هذا الاختبار، والحيوانات استكشاف الساحة التي شغل في كل من الزوايا الأربع من الساحة مع مصدرا محتملا للهواء odorized. الساحة ديها شكل نجمة مجعد لتحقيق أقصى قدر من تشكيل أربعة أجزاء رائحة محددة تجريبيا. إذا تم توفير رائحة في واحدة من زوايا ثم يرد عليه فقط في هذا الربع واحد. يمكن تتبع سلوكيات الحيوانات لأنها تدخل وترك الربع رائحة، وبسهولة مقارنة سلوكهم في الأرباع الثلاث لمراقبة. وبالتالي olfactometer فحص أربعة رباعي السجلات استجابة سلوكية المكانية والزمانية للمنبهات رائحة على الساحة التجريبية كبيرة.

تم تطوير olfactometer أربعة رباعي أول مرة من قبل بيترسون وآخرون. 15 والطبيب البيطري وآخرون. 17 للتحقيق في رأالاستجابات السلوكية مصنع من غشائيات الأجنحة الطفيلية الفردية. Faucher وآخرون. 18 وSemmelhack وانغ 16 تكييفها الإعداد لرصد ردود حاسة الشم الفردية ذبابة الفاكهة. وolfactometer أربعة رباعي حساسة بالتساوي على الردود جذابة ومثيرة للاشمئزاز، والسماح لمجموعة واسعة من عطر اختبار والشروط. تتبع البرامج الطيران العرف مكتوب، التي وضعتها أليكس Katsov 19 ويحتفظ بها حاليا من قبل جوليان براون (المفصل في المواد)، قدم مزايا إضافية لمزيد من تطبيقات الأخيرة من olfactometer أربعة رباعي 14،20-23. أصبح من الممكن الآن لفحص ما يصل الى 100 الذباب في وقت واحد في مكانية عالية (27.5 بكسل / سم) والزمنية (30 لقطة في الثانية) القرار الذي يسمح استخراج معايير مختلفة، مثل موقف والسرعة والتسارع من الذباب في أي نقطة زمنية. وهذا يتيح التحقيقات في ديناميات الاستجابات السلوكية الذباب "لالروائح 20 . وتجدر الإشارة إلى أنه، مع ذلك، أن هوية الذباب الفردية ضمن السكان خلال الفترة تتبع كامل لم يتم المحافظة. بدلا من ذلك، يتم تسجيل كل مسار الطيران لطالما مسارين ذبابة لا تتقاطع. وعند هذه النقطة، يتم تعيين مسارات جديدة بعد تتباعد الذباب. من خلال دمج البرامج الأخرى التقاط الفيديو (المفصلة في الجدول المواد)، وهو نفس التكوين يسمح فترات تتبع مرنة ويمكن استخدامها لتتبع الذباب لمدة تصل إلى 24 ساعة من التقاط الصور في انخفاض معدل الإطار. وقد استخدم هذا الخيار لدراسة السلوكيات وضع البيض من الذباب ومقارنة أوضاع الجسم مع تفضيلات ovipositional 14. ويمكن أيضا أن تستخدم olfactometer أربعة المجال لدراسة الردود على المتعدد الوسائط (مثل حاسة الشم والبصرية) المحفزات، أو الجمع بين علم البصريات الوراثي 9 أو توليد الحرارة 21 التحفيز مع العروض من المحفزات الحسية. وعلاوة على ذلك، يسمح القرار زمنية عالية استخراج مسارات FOص كل ذبابة الفردية في مجموعة البيانات الفرقة. وبالتالي، يسمح للطريقة التحقيق في سلوك السكان حاسة الشم الموجهة، وكذلك التفاعلات الاجتماعية الفردية. البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الاختبار هي قوية وقابلة للتكرار للغاية، مما يسمح للاستخدام olfactometer أربعة الميداني للشاشات السلوكية.

نحن هنا وصف التجمع الإعداد لolfactometer أربعة رباعي. علينا مواصلة التظاهر استخدامها في معايرة جذب حاسة الشم ردا على خل التفاح والتنافر ردا على بروبيونات إيثيل عالية التركيز. وأخيرا، نحن تصف وتوفير رمز المثال لتحليل البيانات تتبع الطيران المسجلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الجمعية

  1. تصنيع الساحة على شكل نجمة (19.5 سم في 19.5 سم في 0.7 سم) من تترافلوروإيثيلين (PTFE) وفقا للالمقدمة رسم (المواد التكميلية، SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). يمكن تصنيعها الساحة التي كتبها تجاري أو مرفق مخصص.
  2. الحصول على لوحين من الزجاج (20.25 سم في 20.25 سم بسمك 2 ملم)، وحفر حفرة (~ 0.7 سم في القطر) على وجه التحديد في قلب واحدة من لوحات الزجاج باستخدام مثقاب المغلفة الماس.
  3. تصنيع مربع السلوك ضوء محكم للالساحة السلوكية. أيضا تصنيع كاميرا مربع ضوء محكم للكاميرا CCD فيديو الأشعة تحت الحمراء وفقا للرسومات المقدمة (المواد التكميلية، SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). ويمكن تصنيع صناديق كتبها تجاري أو مرفق مخصص.
  4. تركيب وحدة تكييف الهواء على الجدار الخلفي والمصفوفات LED على الجدران الجانبية من مربع السلوك. وضع التحقيق في درجة الحرارةفي مربع السلوك من خلال ثقب الجانب في الوقت الحقيقي ردود الفعل درجة الحرارة والتعديل (انظر الشكلين 1 و 2 لمزيد من التفاصيل).
  5. إرفاق فلتر الأشعة تحت الحمراء والمستقطب الدائري للكاميرا، وجبل التجميع في مربع الكاميرا. يتم فصل مربع السلوك وصندوق الكاميرا من خلال نافذة زجاجية لتحسين التحكم في درجة الحرارة من مربع سلوك (أنظر الشكلين 1 و 2 لمزيد من التفاصيل).
  6. قم بتوصيل كاميرا CCD الأشعة تحت الحمراء لمحول الكاميرا. قم بتوصيل محول الكاميرا إلى محول USB. قم بتوصيل محول USB إلى منفذ USB على جهاز الكمبيوتر للحصول على البيانات.
  7. تثبيت برنامج التشغيل لتحويل الفيديو على الكمبيوتر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. اختياريا، تثبيت برامج معالجة الصور المقدمة من قبل الشركة المصنعة للمحول USB فيديو للوصول إلى مجموعة واسعة من إعدادات الكاميرا والمعلمات الاستحواذ.
  8. قم بتوصيل وحدة تكييف الهواء (من خلال "الانتاج"على الجزء الخلفي من وحدة تحكم في درجة الحرارة) والتحقيق في درجة الحرارة (من خلال" الحرارية "على الجزء الخلفي من وحدة تحكم في درجة الحرارة) للتحكم في درجة الحرارة. ضع التحقيق في مربع السلوك.
    ملاحظة: نظام التحكم في درجة الحرارة في التخطيط لدينا هي قادرة على الحفاظ على درجة حرارة مربع ما بين 18 درجة مئوية و 30 درجة مئوية. يمكن أن يكون ارتفاع درجات الحرارة المحيطة أو أقل مفيدة لتوليد الحرارة (dTrpA1، TrpM8 أو shibire نهاية الخبر) تجارب على التعامل مع نشاط الخلايا العصبية أو منع انتقال متشابك. بالنسبة لمعظم التجارب، والحفاظ على درجة الحرارة عند 25 درجة مئوية.
  9. تجميع نظام تسليم رائحة في الخطوات التالية (يرجى الاطلاع على الشكل 1B لالخطط التفصيلية والتجهيزات اتصال):
    1. استخدام منظم ضغط الهواء للسيطرة على إدخال الهواء من نظام الهواء المركزية. توصيل فلتر الهواء الكربون (مليئة الفحم) إلى منظم الضغط لتنقية الهواء من والمركزينظام الأشعة تحت الحمراء.
    2. تجميع نظام التحكم في التدفق تتكون من قنوات متعددة تنظمها أنابيب الجريان عالية الدقة.
    3. وصل الناتج من فلتر الهواء الكربون في أنابيب الجريان عبر متعددة كما هو مبين في الشكل 1B و2F. توجيه الإخراج من أنابيب الجريان من خلال التحكم به إلكترونيا 3 في اتجاه الملف اللولبي الصمامات لتنظيم إذا تم طرد الهواء النظيف تاركا مقاييس التدفق إلى الغرفة أو دخل إلى غرف رائحة حسب الطلب (24).
    4. تثبيت وحدة تحكم صمام الملف اللولبي وفقا لدليل الشركة المصنعة.
  10. تثبيت متر تدفق الهواء الإلكتروني من خلال توصيله إلى جهاز الحصول على البيانات (دق)، وإمدادات الطاقة وفقا لدليل الشركة المصنعة. تثبيت البرنامج واجهة دق للتحقق من معدلات تدفق متساوية في كل رباعي من الساحة قبل كل تجربة.

2. إعداد المحفزات الشم

  1. إعداد 5 رائحةغرف النمل 24 التي تتكون من وعاء الخارجي من البلاستيك والزجاج الحاوية الداخلية، وحسب الطلب السليكوون غطاء إدراج، غطاء حاوية الأصلي مع الجزء المركزي إزالتها، واثنين من صمامات ذات اتجاه واحد.
    ملاحظة: حي يا خاتم حول الغطاء PTFE يمكن أن تستخدم لمنع تسرب الهواء من الغرفة رائحة خلال نضح رائحة. انظر الشكل رقم 1 لالتخطيطي والشكل 2 للحصول على صور للغرف.
  2. استخدام أربع غرف الرائحة لعناصر المذيبات، وغرفة واحدة لالرائحة الاختبار. ملء العبوات الزجاجية مع 1000 ميكرولتر من تمييع المذيبات أو الرائحة (عطر اختبار + المذيبات المناسبة، تخلط جيدا قبل التجارب)، ضع إناء زجاجي داخل غرفة البلاستيك المقابلة (لا تمتد إلى السائل إلى غرفة البلاستيك) وإحكام الغطاء . تأكد دائما استخدام غرفة نظيفة للالرائحة اختبار والضوابط المذيبات.
    ملاحظة: قد تكون ناجمة جذب الشمي من 1/16 التخفيف من خل التفاح (5٪ الحموضة) في ثالعاطر. في المقابل، قد تدرس سلوك التنافر حاسة الشم باستخدام تخفيف 10٪ من بروبيونات الإيثيل في الزيوت المعدنية. المحفزات تحكم في هذه الحالات هي غرف رائحة مع الزيوت المعدنية النقية.

3. إعداد يطير

  1. الذباب الخلفي على وسط الذرة القياسية. وضع 30 من الذكور و 30 من الإناث الذباب الوالدين في زجاجة القياسية، والسماح لهم وضع البيض لمدة 5 أيام في درجة حرارة 25 مئوية أو درجة حرارة الغرفة.
  2. لكل تجربة، وجمع eclosed حديثا (<1 يوم من العمر) 25 من الذكور و 25 من الإناث الذباب تحت وجيزة CO 2 التخدير.
  3. إبعاد الذباب في قارورة مع المتوسط ​​ذبابة القياسية لمدة 2-4 أيام.
  4. 40-42 ساعة قبل التجربة، ونقل الذباب دون CO 2 التخدير   إلى قارورة مع ~ agarose هلام 10 مل 1٪. هذا وسوف تبقي الذباب مرطب بدون الطعام، مما يساعد على زيادة النشاط الحركي لها.
    ملاحظة: أكثر من 90٪ من الذباب يجب أن تنجو من الموت جوعا. بعض التراكيب الوراثية هي أقل شفاءخاصتك وقد لا تجعل من خلال التجويع 40 ساعة. في هذه الحالات، وفترات أقصر مثل 24-28 ساعة مقبولة ولكن يجب أن تبقى هي نفسها لجميع الظروف التجريبية ويكرر.

4. الاستجابات السلوكية للعطور جذابة وطارد

  1. التبديل على وحدة تحكم في درجة الحرارة وتعيينه إلى 25 درجة مئوية.
  2. ربط غرف الرائحة (مراقبة واختبار عطر) عن طريق إدخال أنبوب إلى مخرج الغرفة الرائحة ودفع إلى ربط المناسب في مربع السلوك.
  3. تحقق معدل التدفق في كل رباعي باستخدام متر تدفق الهواء للتأكد من أن السيطرة وairstreams الرائحة تساوي 100 مل / دقيقة.
  4. تنظيف الساحة PTFE الطاير ولوحات الزجاج مع 70٪ من الإيثانول 2-3 مرات والسماح لهم تماما الهواء الجاف (~ 3-4 دقيقة).
  5. يضعوا لوحات الزجاج إلى الساحة مع المشابك.
  6. نقل الذباب دون CO 2 التخدير في الساحة من خلال ثقب في واحدة من لوحات الزجاج. الخلفإيه نقل، ووضع شبكة دائرية على الفتحة لمنع الذباب من الهرب.
    ملاحظة: وقد تبين CO 2 التخدير للتأثير على السلوك ذبابة الفاكهة 25 و لا ينبغي أن تستخدم خلال 24 ساعة من تجربة سلوكية.
  7. وضع الساحة مع الذباب في غرفة ضوء ضيق، وربط مجاري الهواء أربعة السيطرة من خلال ربط الأنابيب التي تعلق على الضغط وربط المناسب في مربع السلوك إلى زوايا الساحة، أغلق باب الغرفة وانتظر 10- 15 دقيقة للسماح للالذباب التأقلم مع البيئة الجديدة. إذا كان ذلك ممكنا، تبديل الأنوار في الغرفة حيث يتم تنفيذ التجارب، لتفادي وقوع تسرب ضوء الحد الأدنى الذي قد يؤثر على نتائج تجريبية.
  8. تشغيل التجربة السيطرة 5-10 دقيقة، والذي يتعرض الذباب لتيارات الهواء 4 السيطرة.
  9. تحليل البيانات مباشرة (انظر القسم تحليل البيانات أدناه) للتأكد من أن الذباب تتوزع بشكل موحد في الساحة، والجذب مؤشر قريبإلى 0. هذه الخطوة ضرورية، كما أنه يتحقق من عدم وجود مصادر غير المنضبط الأفضلية أو تجنب داخل الساحة (على سبيل المثال على ضوء ما تسرب من الخارج، وتوزيع درجات الحرارة متفاوتة، الساحة متفاوتة، التلوث رائحة، وما إلى ذلك). إذا وزعت الذباب بشكل غير متساو أو النشاط الحركي لهم منخفض، تجاهل الذباب، وتنظيف الساحة من جديد (الخطوة 4.4) واستخدام دفعة جديدة من الذباب لتكرار التجربة.
  10. ربط غرفة الاختبار الرائحة إلى الإعداد عن طريق التحول على 3 في اتجاه والصمامات أو إعادة توصيل-الأنابيب الموصل.
  11. تشغيل التجربة اختبار لمدة 5-10 دقيقة وتحليل البيانات كما هو مبين في المادة 5 أدناه (انظر أيضا المرجع 14) والشكل (3). تسجيلات أطول من 20 دقيقة يمكن أن يؤدي إلى ملفات البيانات التي قد يكون من الصعب عملية حسابيا. وإذا رغبت التسجيلات يعد التجريبية، ووقف بسرعة وإعادة بدء برنامج التتبع. وهذا يؤدي إلى وجود فجوة ثانية ~ 10 بين التسجيلات التجريبية.
  12. Discarالذباب د.
  13. نظيفة الساحة والزجاج لوحات مع 70٪ من الإيثانول (الخطوة 4.4)، واستبدال أنابيب موصل داخل العلبة الخفيفة محكم. لتسريع التجارب، ساحة نظيفة جديدة يمكن استخدامها، والساحة القذرة تنظيفها أثناء أداء التشغيل التجريبي.
  14. تشغيل تجربة أخرى مع دفعة جديدة من الذباب، وإذا لزم الأمر. إذا تم تشغيل العديد من التجارب في نفس اليوم، واتخاذ الحذر الشديد لضمان عدم ترك أي الرائحة في النظام من تشغيل الاختبار السابق. هذا هو عادة لا مشكلة مع تركيزات منخفضة من عطر أو مع CO 2، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى محفزات لمركزة للغاية تصل إلى فجوة 24 ساعة بين التشغيل التجريبي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن جميع الأنابيب بعد تدفق أنابيب يمكن استبدال إذا اشتبه التلوث الرائحة خلال التجارب السيطرة. تترك دائما الهواء الجاف على بين التجارب لطرد المستمر للنظام

تحليل 5. البيانات

ملاحظة: ذبابة اقترح اكتساب تتبع سوفتواريه (المفصل في المواد)، ويتتبع الذباب في الوقت الحقيقي خلال الاستحواذ، ويحفظ الطابع الزمني وإحداثيات كل الذباب الكشف في شكل دات *. لقد قمنا بتطوير حسب الطلب مطلب روتين لتحويل البيانات إلى تنسيق ماتلاب، وتحليل البيانات. وقدمت أمثلة التعليمات البرمجية في المواد التكميلية، ولكن تفاصيل التنفيذ تعتمد على البرمجيات المستخدمة للحصول على البيانات.

  1. تحميل البيانات الخام. إنشاء قناع المكاني الذي يلي معالم الساحة وتطبيق قناع للبيانات الأولية لإزالة كافة نقاط البيانات التي تقع خارج الساحة لأنها تمثل الضوضاء (الشكل 4A، التكميلية كود MaskSpatialFiltering.m، Score.m، DrawCircularMask. م).
  2. إزالة كافة نقاط البيانات التي تتحرك بسرعة أقل من 0.163 سم / ثانية لمدة أطول من 3S، حيث من المحتمل أن يكون الضجيج أو المتولدة عن طريق الذباب غير متحركة (الشكل 4B، التكميلية كود TemporalFiltering.m) هذه البيانات.
  3. تصور البيانات المتبقيةنقاط من خلال التآمر بها في كل مرة أو مسارات واحدة (الشكل 3، وقانون التكميلية SingleTrajectoryViewer.m).
    ملاحظة: موقع الحدود رائحة في مجال أربع سنوات على الأرجح يعتمد على عدد من العوامل، مثل خصائص كل الرائحة ومعدلات تدفق الهواء المستخدمة. على سبيل المثال، سوف عطر شديدة التقلب المحتمل ملء الربع رائحة بشكل كامل من عطر أقل تقلبا. وبالتالي فمن المحتمل أن كل الرائحة قد تظهر حدود رائحة مختلفة قليلا. استخدام جهاز الكشف عن التأيين الضوى لقياس حدود رائحة يمكن أن يكون مشكلة لأنه يستخدم فراغ لأخذ عينات الهواء من نقطة محددة، وذلك يعطل تركيز الرائحة في تلك البقعة. ومع ذلك، حدود رائحة يمكن تقدير بسرعة على أساس البيانات السلوكية ذبابة. على سبيل المثال، حدود رائحة بناء على مسارات الطيران المتراكمة ردا على الروائح المختلفة يمكن ملاحظتها بوضوح في أرقام 3C و 3D.
  4. كالculate مؤشر جذب لتحديد ما إذا كانت تجارب السيطرة تولد أي رد تفضيل، وأيضا للوصول إلى استجابة إلى الرائحة (أو علم البصريات الوراثي 9) التحفيز. لحساب الجذب مؤشر (منظمة العفو الدولية)، استخدم 5 دقائق الأخير من عنصر تحكم أو تسجيل الاختبار. للحصول على قياس الجاذبية التي تقع بين +1 (جذب المطلق) و-1 (التنافر المطلق)، يتم استخدام المعادلة التالية لحساب منظمة العفو الدولية:
    figure-protocol-1
    حيث N الاختبار هو عدد نقاط البيانات في الربع اختبار ومراقبة N هو متوسط ​​عدد نقاط البيانات في الأرباع الثلاث لمراقبة. هذا الإجراء هو بديهية كما هو مبين أي تفضيل من القيم تقترب من الصفر. ومع ذلك، فإنه لا يشير بشكل صحيح نسبة من إجمالي عدد الذباب التي تقع في الربع الرائحة. للحصول على هذا الإجراء، وهو مؤشر النسبة المئوية (PI) يمكن استخدامها:
    figure-protocol-2 حيث N الاختبار هو عدد نقاط البيانات في الربع اختبار، وN المجموع هو عدد نقاط البيانات في جميع الأرباع الأربعة. وتنص هذه الصيغة وهو الإجراء الذي يقع بين 0 و 1، مع 0.25 الموافق أي تفضيل السلوكي (الشكل 3E و4C، التكميلية كود AttractionIndex.m).
  5. تشغيل 5-10 يكرر كل حالة تجريبية، وذلك باستخدام مجموعة جديدة من الذباب عن كل تكرار. مقارنة مؤشرات جذب بين الظروف أو ضد الرقابة باستخدام كولموجوروف-سميرنوف غير حدودي الاختبار (الشكل 3F، وظيفة kstest2 في Matlab).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أربعة رباعي olfactometer سجلات فحص وتحليل أنشطة قريبة من العديد من الذباب على مساحة السلوكي كبير. ويمكن إدخال عطور في تيارات الهواء التي تدخل واحد، اثنان، ثلاثة، أو كل أربعة أجزاء. في حالة عدم وجود الروائح الكريهة، والذباب التحرك بحرية بين جميع الأرباع الأربعة. هذا السلوك هو أمر حاسم لمراقبة كما يشير التي لم يتم إدخال التحيز غير العمدية إلى الفحص. ويمكن لهذه التحيزات تشمل ضوء، التقلبات في درجات الحرارة، والاختلافات في تدفق الهواء، أو الملوثات رائحة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وolfactometer أربعة الميدانية الموصوفة هنا هو نظام السلوكي تنوعا لدراسة ردود حاسة الشم لوجود أعداد كبيرة من النوع البري ومتحولة ذبابة الفاكهة الذباب. يأخذ كل تجربة ~ 1 ساعة (بما في ذلك الإعداد، التشغيل التجريبي، والتنظيف)، و4-6 التجارب لا يمكن أن يؤديها بشكل روتيني كل يوم. وفحص نموذجي باستخدام 40-50 الذباب لمدة 5 دقائق يولد ما يقرب من 450،000 تتبع نقاط البيانات لتحليلها. التكوين وصفها ويمكن أيضا أن تستخدم، مع تعديلات طفيفة، لرصد تحركات الحشرات الأخرى أو يرقات الحشرات ردا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر Terry Shelley على تصنيع ساحة الطيران والعلبة الضيقة ، و Liz Marr للمساعدة في صيانة مخزون الذباب ، و Xiaojing Gao و Junjie Luo للمساعدة في كود Matlab المستخدم لتحليل البيانات. نشكر يوهان لوندستروم في مركز Monell Chemical Senses لإظهار إعداد توصيل الرائحة. تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة وايتهول (CJP) والمعاهد الوطنية للصحة NIDCD (R01DC013070 ، CJP).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<نظام توصيل الهواء القوي > nbsp ؛ < / قوي >< قوي > (الكمية المطلوبة) < / قوي >
< م >< قوي > الأنابيب والموصلات < / قوي >< / م >
لدن بالحرارة NPT (F) مشعباتكول بارمر ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكيةR-31522-311
عرافة التخفيض   ؛ الحلمة (1 / 4MNPT->1 / 8MNPT)ماكماستر كار ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية5232T3141
أنابيب ( ID: 1/8)McMaster-Carr ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية5108K4350
Ft Tubing (ID: 1/16)McMaster-Carr ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية52355K41100 Ft
Showbed Tubtub TتجهيزاتMcMaster-Carr ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية5117K711 حزمة
تجهيزات أنابيب الدفع للتوصيلMcMaster-Carr ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية5779K1024
تركيبات الأنابيب الشائكة (1 / 4MNPT->1 / 8BF)McMaster-Carr ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية5463K4391 عبوة (10)
تركيبات الأنابيب الشائكة (1/8MNPT->1/8BF)McMaster-Carr, IL, USA5463K4382 pack (10) 
تركيبات الأنابيب الشائكة (1/8MNPT->1/16BF)McMaster-Carr, IL, USA5463K42 pack (10) 
تركيبات الأنابيب الشائكة (1 / 4MNPT->1 / 4BF)ماكماستر كار ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية& nbsp ؛ 5670K841
سداسية الرأس التوصيلماكماستر كار ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية48335K1521
<قوي >منظم ضغط الهواء ، فلتر الهواء ومقاييس التدفق< / قوي >< / م ><قوي> (الكمية المطلوبة) < / وحدة
تجفيف غاز قوية > معمليةW A HAMMOND DRIERITE CO LTD ، OH ، الولايات المتحدة الأمريكيةالموديل: L68-NP-303 ؛ مخزون # 268401
إطارات متعددة الأنابيب لأنابيب التدفق 150 ممCole-Parmer ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكيةR03215-301
إطارات متعددة الأنابيب لأنابيب التدفق 150 ممCole-Parmer ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكيةR03215-761
150 مم أنابيب التدفقCole-Parmer ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكيةR-03217-159
خرطوشة صمامCole-Parmer ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكيةR-03218-729
منظم الهواء الدقيقMcMaster-Carr ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية6162K131
صمامات Soleniodأتمتة Scientific ، Berkeley ، CA02-10i4
وحدة تحكم صمام الملف اللولبيValveLink 8.2 ، أتمتة Scientific ، بيركلي ، كاليفورنيا01-181
مقياس التدفق الإلكترونيHoneywellAWM3100V1
DAQ (NI USB-6009 ، National Instruments) و A & nbsp ؛National InstrumentsNI USB-60091
مزود الطاقةExtech Instruments3822001
غرف الرائحة جرة
الفم العريض من مادة البولي بروبيلين 2 أونصة ؛ 60 ملNalgene562118-0002مطلوب ما لا يقل عن 5 لكل تجربة ، ولكن يلزم وجود غرفة منفصلة لكل تخفيف لكل رائحة. متوفر في متجر الحاويات ، الجزء # 635114)
غرفة الرائحة الزجاجية ، 0.25 أوقيةزجاجة SunburstLB4Bمطلوبة 5 على الأقل لكل تجربة   ؛
صمام "داخلي" لغرفة الرائحةSmart Products، Inc. ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية214224PB-0011S000-4074يتم استخدام 1 من هذه الأجزاء لكل غرفة رائحة ولكن يجب استبدالها بشكل متكرر
صمام "Out" لغرفة الرائحةProducts، Inc.، CA، الولايات المتحدة الأمريكية224214PB-0011S000-4074استخدام 1 من هذه الأجزاء لكل غرفة رائحة ولكن يجب استبدالها بشكل متكرر
O ringRT Dygert International ، مينيسوتا, الولايات المتحدة الأمريكيةAS568-029 Buna-N O-R1 حزمة (100)
<قوي>ساحة يطير ، الكاميرا وصناديق السلوك< / قوي>< / em><قوي>(الكمية المطلوبة)< / قوي>
مادة صندوق السلوك والكاميرابين الولايات، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكيةABS أسود مقذوف (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)1803 بوصة
مربعةتفلون لساحة الذبابة وإدراج غرفة الرائحة ، 3/8 "سميكة ، 12" × 12 "ماكماستر كار ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية8545K27   ؛1
ألواح زجاجية ، 1/8 بوصة سميكة ، 9 × 9 بوصةماكماستر كار ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية8476K191   ؛2
وحدة تحكم كهروحرارية مزدوجة العملWAtronix Inc ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةDA12V-K-01
IR LED صفيفإضاءة متقدمة ، روتشستر ، فاتو ، الولايات المتحدة الأمريكيةAL4554-88024 ، PS24-TL2 مصفوفات LED ووحدة مكيف هواء واحد لإمدادات الطاقة
Melcor Store  ؛ MAA280T-121
<قوي > نظام تصوير < / قوي >< / م ><قوي > (الكمية المطلوبة) < / قوي >
Cosmicar / بنتاكس C21211TH (12.5 مم F / 1.4) عدسة C-mountB AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكيةKP1
CCXC-12P05N كابل التوصيلالبيني B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكيةSOCCXC12P05N1
DC-700 محول الكاميراB AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية1
B + W 40،5 093 مرشح الأشعة تحت الحمراءB AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP ، NY ، USA65-0724421
TiFFEN 40.5 مم مستقطب دائريأمازون1
كاميرا فيديو IRمصدر الرؤية الصناعية ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكيةSony XC-EI50 (SY-XC-E150)1
محول فيديو USBThe Imagingsource ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكيةDFG / USB2-It1
iFlySpy2 (برنامج تتبع الذباب)جوليان براون ، ستانفورد ، كاليفورنيا: julianrbrown@gmail.comiFlySpy21
IC Capture 2.2 البرمجياتThe Imagingsource ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)
<م ><قوي>متفرقات< / قوي>< / م >< قوي > (الكمية المطلوبة) < / قوي >
أداة دوارة Dremel، راسين ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكيةDremel 8000-03   ؛1
لقم الثقب المطلية بالماس لقطع الزجاجمتوفرة من مختلف الموردين ؛ شركة MSC للتوريد الصناعي ، ميلفيل ، نيويورك906063281
Smart يتم البلاستيك PEC21211 SODC700

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
  2. Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
  3. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  4. Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
  5. Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
  6. Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
  7. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  8. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  9. Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580(2014).
  10. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  11. Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
  13. Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  14. Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
  15. Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
  16. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
  17. Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
  18. Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
  19. Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
  20. Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
  21. Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986(2015).
  22. Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
  23. Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
  24. Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
  25. Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
  26. Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
  27. Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
  28. Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
  29. Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci Rep. 2, 361(2012).
  30. Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
  31. Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
  32. Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Olfactory Behavior AssayDrosophila TrackingFour quadrant OlfactometerOdorant Chamber SetupFly Population AnalysisAirflow Rate VerificationData Analysis ScriptAttraction Index CalculationOlfactory Stimulus ResponseBehavioral Data Quantification

مقالات ذات صلة