مقالة منهجية

عزل مجمعات RNA والبروتينات وما شابه ذلك من الخلايا عن طريق شطف موجهة قليل النوكليوتيد-

DOI:

10.3791/54391

⸱

يناير 16, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المخطوطة نهجا لعزل RNPs المماثلة المختارة المتكونة في الخلايا حقيقية النواة عبر تخصيب محدد موجه بقليل النوكليوتيدات. نوضح قابلية تطبيق هذا النهج من خلال عزل RNP المماثل المرتبط بالمنطقة غير المترجمة 5 بوصات التي تتكون من DHX9 / RNA helicase A.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توجه جزيئات البروتين النووي الريبي التكوين الحيوي وتنظيم ما بعد النسخ لجميع mRNAs من خلال مجموعات مميزة من بروتينات ربط الحمض النووي الريبي. وهي تتكون من عناصر الحمض النووي الريبي المعتمدة على الموضع والتي تعمل على رابطة الدول المستقلة ومجموعات فريدة من بروتينات ربط الحمض النووي الريبي. يعد تحديد تكوين RNP معين أمرا ضروريا لتحقيق فهم أساسي لتنظيم الجينات. إن عزل RNP المحدد يشبه العثور على إبرة في كومة قش. هنا ، نوضح نهجا لعزل RNPs المرتبطة بمنطقة 5 'غير المترجمة من mRNA محدد في الخلايا غير المتزامنة المنقولة. لقد ثبت أن RNP المماثل ضروري لترجمة فيروسات مختارة وجينات الاستجابة للإجهاد الخلوي.

بروتوكول الترسيب المشترك لبروتين الحمض النووي الريبي المثبت مناسب للتحليل النهائي لمكونات البروتين من خلال التحليلات البروتينية أو البقع المناعية أو فحوصات تحديد الكيمياء الحيوية المناسبة. يوضح هذا البروتوكول التجريبي أن DHX9 / RNA helicase A يتم إثرائه عند الطرف 5 'من الحمض النووي الريبي القهقر المماثل ويوفر معلومات أولية لتحديد ارتباطه ب huR المرتبط بإجهاد الخلية و mRNAs المماثلة junD.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وينظم التعبير الجيني في مرحلة ما بعد النسخي على وجه التحديد، بدءا من النسخ الحمض النووي في النواة. التي يسيطر عليها الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية)، مرنا نشوء حيوي والتمثيل الغذائي تحدث في جزيئات بروتين نووي ريبوزي ديناميكية للغاية (RNPs)، التي الزميلة وفصل مع مرنا الركيزة السلائف خلال تطور من الحمض النووي الريبي الأيض 1-3. التغيرات الديناميكية في الأداء الملاحي المطلوب مكونات تؤثر على مصير ما بعد النسخي من مرنا وتوفير ضمان الجودة أثناء معالجة النصوص الأساسية، والاتجار النووي والترجمة، ونشاطهم كقوالب مرنا للترجمة، ودوران في نهاية المطاف من mRNAs ناضجة.

وتتم تسمية العديد من البروتينات كما الممارسات التجارية التقييدية بحكم مجالاتهم الأحماض الأمينية الحفظ، بما في ذلك فكرة الاعتراف RNA (RRM) والحمض النووي الريبي RNA المزدوج نطاق ملزم (RBD)، وتمتد من مخلفات الأساسية (على سبيل المثال، أرجينين، ليسين، والجلايسين) 4. الممارسات التجارية التقييدية بشكل روتينيعزل باستراتيجيات مناعي ويتم فحص لتحديد الرنا الخاصة وما شابه ذلك. بعض الممارسات التجارية التقييدية شارك في تنظيم مسبقا من mRNAs التي ترتبط وظيفيا، تسمى regulons RNA 5-8. هذه الممارسات التجارية التقييدية، من mRNAs المشابهة لها، وأحيانا غير الترميز الحمض النووي الريبي، تشكل RNPs الحفازة التي تختلف في تكوينها. طابعها الفريد ويرجع ذلك إلى مجموعات مختلفة من العوامل المرتبطة بها، وكذلك لالزمنية تسلسل، والموقع، ومدة تفاعلاتها 9.

RNA مناعي (رض) هي تقنية قوية لعزل RNPs من الخلايا والتعرف على النصوص المرتبطة باستخدام تحليل تسلسل 10-13. الانتقال من مرشح لالجينوم على نطاق الفحص ممكنا من خلال RIP جنبا إلى جنب مع تحليل ميكروأري 14 أو التسلسل الإنتاجية العالية (RNAseq) 15. وبالمثل، يمكن تحديد البروتينات عجل شارك الطيف الكتلي، وإذا كانت وفيرة بما فيه الكفاية وفصل من-عجل شارك الأجسام المضادة 16،17. هنا، نحن معالجة منهجية لعزل مكونات الأداء الملاحي المطلوب من الحمض النووي الريبي وما شابه ذلك محدد من الخلايا البشرية المستزرعة، على الرغم من أن هذا النهج هو قابل للتغيير للست] القابلة للذوبان من خلايا النبات والفطريات والفيروسات والبكتيريا. وتشمل التحليلات التحويلية للمواد تحديد مرشح والتحقق من طخة مناعية، مطياف الكتلة، والكيمياء الحيوية فحص الأنزيمية، RT-QPCR، ميكروأري، وRNAseq، كما هي ملخصة في الشكل 1.

ونظرا للدور الأساسي للRNPs في السيطرة على التعبير الجيني في مرحلة ما بعد النسخي، وتعديلات في التعبير عن الممارسات التجارية التقييدية المكونة أو إتاحتها للالمشابهة الرنا يمكن أن يكون ضارا للخلية وترتبط مع عدة أنواع من الاضطرابات، بما في ذلك مرض عصبي 18. DHX9 / RNA هيليكاز ألف (رحه) ضروري لترجمة من mRNAs مختارة من أصول الخلوية وفيروسات 6. هذه الرنا وما شابه ذلك يحمل عناصر رابطة الدول المستقلة المفعول ذات الصلة هيكليا داخل بهم5 'UTR، التي اعتبرت بمثابة عنصر تحكم ما بعد النسخي (PCE) 19. النشاط رحه-PCE ضروري لكفاءة الترجمة التي تعتمد على الحد الأقصى من العديد من الفيروسات، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية-1، والجينات التنظيمية النمو، بما في ذلك جند 6،20،21. المشفرة بواسطة الجينات الأساسية (dhx9)، رحه أمر ضروري لتكاثر الخلايا والتنظيم وصولا ليقضي على بقاء الخلية 22. التحليل الجزيئي للرحه-PCE RNPs هو خطوة أساسية لفهم لماذا النشاط رحه-PCE ضروري للسيطرة على انتشار الخلايا.

توصيف دقيق لمكونات الأداء الملاحي المطلوب رحه-نفقات الاستهلاك الشخصي في حالة مستقرة أو عند اضطراب الفسيولوجية للخلية يتطلب تخصيب انتقائية والقبض على RNPs رحه-PCE في وفرة كافية لتحليل المصب. هنا، كانت المعلمة فيروسات PCEgag RNA مع 6 نسخ من الموقع RNA رابطة الدول المستقلة المفعول ملزم للبروتين معطف MS2 (CP) في إطار القراءة المفتوح. البروتين معطف MS2 كان إكسوgenously المشارك أعرب مع PCEgag الحمض النووي الريبي ترنسفكأيشن البلازميد لتسهيل تجميع الأداء الملاحي المطلوب في نمو الخلايا. تم immunoprecipitated RNPs التي تحتوي على البروتين معطف MS2 مع المعلمة MS2-وما شابه ذلك PCEgag الحمض النووي الريبي من استخراج الخلايا والقبض على حبات مغناطيسية (الشكل 2A). لالتقاط انتقائي مكونات الأداء الملاحي المطلوب منضمة إلى نفقات الاستهلاك الشخصي، والمحتضنة في الأداء الملاحي المطلوب ثبتوا مع قليل النوكليوتيد مكملة لتسلسل البعيدة لنفقات الاستهلاك الشخصي، وتشكيل الهجين RNA-DNA الذي هو الركيزة للنشاط ريبونوكلياز H. منذ يتم وضع نفقات الاستهلاك الشخصي في "محطة من 5 '5 المنطقة غير المترجمة، وكان قليل النوكليوتيد مكملة لتسلسل الحمض النووي الريبي المتاخمة للفيروسات الموقع ترجمة البدء (أسكت بداية كودون). ريبونوكلياز H انشقاق قرب بدء هفوة كودون صدر مجمع UTR 5 'من الأداء الملاحي المطلوب يجمد، والتي تم جمعها كما شاطف. بعد ذلك، تم تقييم العينة RT-PCR لتأكيد القبض على PCEgag وSDS PAGE وطخة مناعية لتأكيد captuإعادة البروتين معطف MS2 الهدف. والتحقق من الحمض النووي الريبي ملزمة البروتين المرتبط نفقات الاستهلاك الشخصي، DHX9 / RNA هيليكاز A، ثم تم القيام بها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
عازلة التراكيب
غسل العازلة:
50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4
150 مم كلوريد الصوديوم
3 ملي MgCl2
منخفض الملح العازلة:
20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5
10 ملي كلوريد الصوديوم
3 ملي MgCl2
2 ملي DTT
1X مثبط البروتياز كوكتيل خالية من EDTA
ريبونوكلياز خارج 5 ميكرولتر / مل (ريبونوكلياز المانع)
حشوية الاحتياطي تحلل:
0.2 M السكروز
1.2٪ تريتون X-100
NETN-150 مخزن اغسل:
20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4
150 ممكلوريد الصوديوم
0.5٪ NP-40
3 ملي MgCl2
10٪ الجلسرين
ملزمة العازلة:
10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.6
40 ملي بوكل
3 ملي MgCl2
2 ملي DTT
5٪ الجلسرين

الجدول 2: التراكيب العازلة.

1. إعداد خلايا ومصفوفة الانجذاب

  1. ثقافة خط خلية من الاهتمام إلى التقاء الفرعي (80٪) في صحن 10 سم. استخدام 10 سم لوحات لimmunoprecipitations المستقلة (IP) لNLS-MS2 بروتين معطف الموسومة FLAG. أداء IP باستخدام أمصال مضادة لعلامة FLAG-حاتمة. عندما معربا عن MS2 بروتين معطف البلازميد الموسومة FLAG، transfect الخلايا 24-48 ساعة قبل الحصاد 20.
    ملاحظة: الأداء الملاحي المطلوب معين قد يكون المخصب من الطاقة النووية أو السيتوبلازملست] جيم أو مستحضر كيميائي حيوي، مجزأة، مثل أجزاء من التدرج السكروز. فمن المستحسن لحصاد المحللة من خلايا غير transfected بالتوازي مع تأسيس عنصر تحكم سلبية إضافية.
  2. نقل 60 ميكرولتر في الملكية الفكرية للبروتين G حبة المغناطيسي الطين إلى أنبوب 1.7 مل microcentrifuge ل.
  3. وضع أنبوب على رف جذب للأنابيب microcentrifuge لفصل حبات من حلول التخزين.
  4. إزالة حل التخزين عن طريق رسم بعناية حتى مع micropipette.
  5. إزالة أنبوب من رف المغناطيس.
  6. غسل وتتوازن حبات مع 600 ميكرولتر (10 مرات الحجم المستخدم من الخرز) من 1X غسل العازلة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 3 ملي MgCl 2، و 150 مم كلوريد الصوديوم) ونهاية الإفراط في نهاية التناوب لمدة 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. وضع أنبوب على الرف المغناطيس وإزالة غسل العازلة.
  8. إضافة 10 مجلدات (600 ميكرولتر) من العازلة 1X غسل وimmunoprecipitating الأجسام المضادة FLAG إلى العلاقات العامة معايرتهاotein G حبات مغناطيسية (وفقا لكمية الموصى به من قبل الشركة المصنعة للمناعي) وتناوب نهاية الإفراط في نهاية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل لتصريف الأجسام المضادة immunoprecipitating. استخدام مفتش نمط إسوي المقابلة كوسيلة لمراقبة سلبية الأجسام المضادة مناسبة.
  9. وضع أنبوب على الرف مغناطيس لجمع الخرز وإزالة طاف.
  10. إزالة أنبوب من رف المغناطيس وتغسل حبات الضد مترافق مع 10 مجلدات (600 ميكرولتر) من غسل العازلة 1X وتناوب لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة مرتين.
  11. وضع أنبوب على الرف المغناطيس وإزالة غسل العازلة.

2. حصاد وRNPs

ملاحظة: إعداد RNPs خلال فترة حضانة بعد خطوة 1.8.

  1. إزالة مستنبت من خلايا بواسطة الطموح وغسل الخلايا مرتين مع 1-5 مل من الجليد الباردة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). استخدام مكشطة الخلية إلى طرد الرطب،الخلايا الملتصقة قبل جمع بواسطة الطرد المركزي في 226 x ج لمدة 4 دقائق على 4 درجات مئوية.
  2. إضافة 375 ميكرولتر من الجليد الباردة العازلة المنخفض الملح (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 3 ملي MgCl 2 و 10 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي DTT، 1X البروتياز المانع الكوكتيل، خالية من EDTA و 5 ميكرولتر / مل ريبونوكلياز المانع) إلى بيليه الخلية والسماح تورم بوضعه على الجليد لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: خياط حجم عازلة قليل الملح حسب حجم بيليه الخلية. 1.2 × 10 6 خلايا من لوحة 10 سم، 375 ميكرولتر من العازلة كافية.
  3. لجمع الخلايا المحللة حشوية، إضافة 125 ميكرولتر من تحلل العازلة الجليد الباردة (0.2 M السكروز / 1.2٪ تريتون X-100)، ثم قم بإجراء 10 السكتات الدماغية مع الخالط Dounce التي كانت قبل برود في دلو الجليد.
    ملاحظة: لجمع مجموع استخراج الخلايا، فمن المستحسن القياسية تحلل العازلة المعهد الملكي للالانحلال في جبلة النواة / لونين.
  4. تدور في microfuge في سرعة قصوى (16000 x ج) لمدة 1 دقيقة. هذا سيؤدي إلى مسح طاف من الحطام لنوى الثانية.
  5. طاف لنقل أنبوب microcentrifuge 1.7 مل الجديد الذي تم على الجليد. تحديد تركيز البروتين الكلي من مستوى، طريقة يفضل المختبر، مثل برادفورد الفحص 23. حجز قسامة لا يقل عن 10٪ للحصول على تحليل لطخة غربية، لاستخدامها كعنصر تحكم الإدخال. استخدام الخلايا المحللة تحصد فورا للمناعي أو تخزينه في -80 درجة مئوية لتحليل المستقبل.
    ملاحظة: في تجربتنا، هذه العينات يمكن تخزينها واستخدامها في وقت لاحق عدة أشهر لتحليل مناعي دون حل وسط من النزاهة.

3. مناعي

  1. إضافة الحجم المطلوب من الخلايا المحللة حصادها، استنادا إلى تركيز البروتين في تحديد الخطوة 2.5، إلى حبات الضد مترافق الهدف. عن طريق غسل العازلة 1X، ليصبح الحجم الكلي يصل إلى 600 ميكرولتر وتناوب نهاية الإفراط في نهاية مدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: هذه الفترة الزمنية غير كافية لتوليدعزلة قوية من المجمعات RNP عالية تقارب مع تقليل غير محددة وملزمة. تمييع مصادر RNP بديلة، مثل أجزاء من التدرج السكروز، لا يقل عن 1: 1 مع غسل العازلة 1X، ثم احتضان لهم مجمعات للحبة الضد معدة مسبقا، على النحو المذكور أعلاه.
  2. بعد 90 دقيقة من الحضانة، ووضع أنبوب IP على الرف مغناطيس لجمع الخرز. حجز طاف كما التدفق من خلال.
    ملاحظة: هذه أول التدفق من خلال هو عينة السيطرة الهامة لقياس كفاءة IP. ومقايسة طخة مناعية توفر مؤشرا على كفاءة الملكية الفكرية، فضلا عن خصوصية التفاعلات التحقيق. فمن المستحسن أن تبقي هذه طاف للتحليل المصب.
  3. غسل والخرز الضد مترافق محددة الأداء الملاحي المطلوب مع 10 مجلدات (600 ميكرولتر) من NETN-150 غسل العازلة الجليد الباردة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، 3 ملي MgCl 2؛ 0.5٪ NP40، و 10٪ الجلسرين) تحت دوران لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوة 3 مرات.
    ملاحظة: هذه عازلة يختلف عن تحلل العازلة وبشكل فعال يقلل من الجمعيات ضعيفة أو غير محددة.
  4. بعد غسل النهائي، resuspend والمجمعات الأداء الملاحي المطلوب ثبتوا في 60 ميكرولتر من 1X العازلة الجليد الباردة ملزمة (10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.6 و 40 ملي بوكل، 3 ملي MgCl 2، 5٪ الجلسرين، و 2 ملي DTT) والاحتياطي 10٪ من الخرز المعقدة ثبتوا لطخة غربية و 20٪ لعزل الحمض النووي الريبي.

4. شطف

  1. ضبط مستوى الصوت المتبقية إلى 100 ميكرولتر مع العازلة ملزمة 1X المثلج وحرارة الأنبوب في 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  2. لعزل المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين وما شابه ذلك، إضافة ~ 30 الإقليم الشمالي النوكليوتيد الحمض النووي أنه مكمل لل3 'تسلسل الحدود من الحمض النووي الريبي من الفائدة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف (100 نيوتن متر من النوكليوتيد يكفي).
    ملاحظة: النوكليوتيد هو العقاقير إلى بقايا النوكليوتيدات المتاخمة للترجمة بدء موقع بناء PCE استخدامها بوصفها الامثلهه في هذا البروتوكول. يتم توفير المناسب تسلسل التكامل من قبل ~ محتوى GC 40٪. تصميم النوكليوتيد العقاقير لتهجين كفاءة في المنطقة التكميلية الحد الأدنى من الحمض النووي الريبي الهدف.
  3. إضافة 5-10 وحدة من ريبونوكلياز H إلى أنبوب ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ليلتصق الحمض النووي الريبي من الحمض النووي الريبي: هجين الحمض النووي. نقل طاف لأنبوب 1.7 مل microcentrifuge لمعقمة. تحتوي هذه العينة المجمعات الأداء الملاحي المطلوب القبض المصالح.
    ملاحظة: هذا يتوقف على إمكانية الحصول على الحمض النووي الريبي وما شابه ذلك، واثنين أو أكثر جولات من العلاج ريبونوكلياز H قد يكون مفيدا لزيادة وفرة عينة للتحليل المصب.
  4. استخدام 20٪ من شطافة في لطخة غربية للبروتينات المرتبطة المعروف و 20٪ من شطافة لعزل الحمض النووي الريبي تليها RT QPCR. 60٪ المتبقية يمكن استخدامها لقياس الطيف الكتلي أو لتحديد مكونات البروتين.
  5. في موازاة ذلك، إخضاع قسامة من الخلايا المحللة محفوظة لعزل الحمض النووي الريبي وتحليل RT-PCR. هذا ASSEيوفر ssment مؤشرا لتخصيب RNA داخل مجمع الأداء الملاحي المطلوب.
    ملاحظة: استخدم إعداد البروتين المعزول في طخة غربية مراقبة للتأكد من أن الانقسام ريبونوكلياز H كان فعالا في الإفراج عن الأداء الملاحي المطلوب من مجمع immunuoprecipitated.

5. البروتين التحليل الكهربائي والغربية وصمة عار

  1. تخضع حوالي 10-20٪ من إجمالي العينة إلى SDS-PAGE وتحليل طخة مناعية وفقا لبروتوكول المختبر القياسية.
    ملاحظة: هذه الخطوة تخدم للتحقق من كفاءة الملكية الفكرية والخصوصية قبل تحليل الحمض النووي الريبي المصب. ويمكن أيضا أن تستخدم لتقييم تكوين البروتين في مجمع RNP معزولة.

6. مجموعة من Immunoprecipitated RNA

ويمكن أن يتم عزل الحمض النووي الريبي عن طريق أسلوب Trizol أو بعد بروتوكول وصف: ملاحظة.

  1. نصف و resuspend من إجمالي العينة في 750 ميكرولتر من حمض كاشف guanidinium ثيوسيانات واحتضان في تي الغرفةemperature لمدة 5 دقائق قبل استخراج الحمض النووي الريبي من المجمعات PCE-الأداء الملاحي المطلوب القبض عليه.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم إلى أنبوب، هزة بقوة لمدة 10 ثانية، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
  3. بعد الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، وجمع المرحلة المائية في أنبوب من جديد وإضافة حجم مساو من الأيزوبروبانول. تخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة على الأقل. إضافة 1 ميكرولتر من جلايكول الأزرق إلى العينة وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في الفريزر لهطول الأمطار أو معالجة فعالة في وقت لاحق.
  4. أنبوب الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعناية جمع والتخلص من طاف وذلك لعدم تعكير صفو بيليه RNA. من المستحسن استخدام micropipette غيض ف 200 لتسهيل هذه العملية.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من الايثانول 75٪ لكل أنبوب، الدوامة، وأنابيب الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. بعناية جمع والتخلص من طاف كما في الخطوة 6.4. الجويتجفيف بيليه لمدة 2-3 دقائق و resuspend في 100 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه.
    ملاحظة: لا تطيل الوقت الذي بيليه يجف الهواء من أجل تجنب مشكلة مع إعادة تعليق.
  6. تطبيق 100 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي إلى عمود تنظيف الحمض النووي الريبي. معالجة باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة. أزل الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه ومخزن في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
    ملاحظة: هذا الحمض النووي الريبي معزولة هو مناسبة لتحليل المصب بواسطة RT-PCR الوقت الحقيقي (QPCR)، ميكروأري، وتسلسل الحمض النووي الريبي. اعتمادا على وفرة من الأداء الملاحي المطلوب والكفاءة التي يتم عزل الأداء الملاحي المطلوب من الاهتمام، لا يجوز إخضاع نفس المحللة إلى اثنين أو أكثر من جولات الملكية الفكرية لتوليد RNA كافية للتطبيق لتحليل المصب.

7. الحمض النووي الريبي النسخ العكسي والتضخيم من [كدنا بواسطة PCR

  1. إخضاع الحمض النووي الريبي معزولة على عكس النسخ التي كتبها التمهيدي عشوائي مع عكس ذات جودة عالية الناسخ (RT)، وفقا لmanufaتعليمات cturer ل.
  2. لتضخيم الحمض النووي الريبي من الفائدة، تصميم التمهيدي العقاقير جينات محددة ضمن تسلسل انشقاق ريبونوكلياز H. استخدام كميات مماثلة من النوكليوتيد العقاقير، وهو أول كتاب عشوائي، أو التمهيدي بنسبة ضئيلة من DT (انظر الجدول المواد).
    ملاحظة: التمهيدي بنسبة ضئيلة من DT ومرنا-adenylated بولي توفر ردود الفعل مراقبة إيجابية لردود الفعل RT-PCR.
  3. احتياطي 5٪ من رد فعل RT (1 ميكرولتر) لQPCR إعدادي به جنبا إلى جنب مع سيطرة سلبية المحللة الملكية الفكرية وعينات من الحمض النووي للسيطرة الإيجابية لتحديد قطع وإنتاج منحنى القياسية. إذا كانت قيمة المقطعية للQPCR إعدادي هي خارج نطاق منحنى قياسي، يخفف من رد فعل RT في متتالية 1: 5 التخفيفات وكرر الخطوة 7.2.
    ملاحظة: للحصول على تسلسل الحمض النووي الريبي وتقنية مطياف الكتلة، الرجاء مراجعة ملف الطريقة التكميلي. الرجاء الضغط هنا رس عرض هذا الملف الطريقة التكميلي. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حددت النتائج RIP السابقة الرنا هفوة فيروسات وتحديد الرنا الخلوية التي تشارك في راسب مع DHX9 / رحه، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية-1 6، جند 6 وحور (فريتز وبوريس-لوري، غير منشورة). وقد أظهرت فيروسات 5 'UTR للمشاركة في يعجل مع DHX9 / رحه في النواة وللمشاركة في عزل في السيتوبلازم على polyribosomes. يتم تعريف فريد على أنها رابطة الدول المستقلة -acting عنصر تحكم ما بعد النسخي (PCE) 6. لعزل المجمعات بروتين ن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العزلة الأداء الملاحي المطلوب واستراتيجية تحديد الحمض النووي الريبي وما شابه ذلك وصفت هنا هي وسيلة انتقائية التحقيق في تفاعل معين RNA والبروتينات واكتشاف البروتينات مرشح شارك في تنظيم والأداء الملاحي المطلوب معين في الخلايا.

وميزة استخدام الموجه النوكليوتيد ريبونوكلياز H الانقسام لعزل RNPs هي القدرة على التقاط وتحليل الأداء الملاحي المطلوب المفعول رابطة الدول المستقلة عنصر RNA على RNPs غير متجانسة ملزمة المصب إلى...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب الامتنان الدعم من قبل المعاهد الوطنية للصحة P50GM103297، P30CA100730 والشامل للسرطان P01CA16058.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Dynabeads Protein AInvitrogen10002D
Dynabeads Protein GInvitrogen10004D
الأجسام المضادة المضادة FLAGSigmaF3165
الأجسام المضادةالمضادة FLAG SigmaF7425
الأجسام المضادة RHAVaxronPA-001
TRizol LS كاشفتقنيةالحياة10296-028
RNase HAmbionAM2292
الكلوروفورمفيشر العلميBP1145-1
الأيزوبروبانولفيشر ScientificBP26184
RNaسهل عمود التنظيفQiagen74204
النسخ العكسي متعدد الحروفQiagen205113
RNase OutInvitrogen10777-019
كوكتيل مثبط البروتيازروش5056489001
تريتون X-100سيجماX100
NP-40سيجما98379
جلسرينفيشر Scientific17904
بادئات سداسية عشوائيةInvitrogenN8080127
Oligo-dT بادئاتInvitrogenAM5730G
بادئات PCRIDTالجين الاشعال الخاصة ل   تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل
قليل النوكليوتيد ل RNase H الانقسام بوساطةIDTالتمهيدي المضاد للإحساس للRNA المستهدف
تقنية TrypsinGibco Life25300-054
DMEM زراعة الأنسجة المتوسطةتقنية Gibco Life11965-092
مصل الأبقار الجنينيتقنية Gibco Life10082-147
قاعدة تريسفيشر العلميةBP152-5
كلوريد الصوديومفيشر ScientificS642-212
كلوريد المغنيسيومفيشر ScientificBP214
DTTفيشر ScientificR0862
السكروزفيشر ScientificBP220-212
غشاء النيتروسليلوزBio-Rad1620112
حامل مغناطيسيأنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل يحمل
رقائقيلزراعة الأنسجة الحيوانية
CO2< / sub>لزراعة الأنسجة الحيوانية
جهازفصل عينة البروتين
جهازالبروتين نقل عينة البروتين
جاهز للاستخدام المواد الهلامية البروتينية (4-15٪)عينة البروتين
جهازبيليه أسفل العينة دوار
سطح الطاولةامزج العينة من طرف إلى طرف
دوامةامزج العينات
غطاء حاضنة هلام البروتين نقل فصل الطرد المركزي أعلى الطاولة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
  2. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255(2008).
  3. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  4. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
  5. Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18(2006).
  6. Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
  7. Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
  8. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
  9. Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
  10. Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
  11. Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
  12. Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
  13. Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
  14. Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
  15. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  16. Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
  17. Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
  18. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
  19. Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
  20. Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
  21. Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
  22. Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
  25. Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
  26. Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA ImmunoprecipitationRNP IsolationFLAG tagged ProteinMagnetic Bead ConjugationCytoplasmic Lysate PreparationRNase H TreatmentRNA ExtractionWestern Blot AnalysisRT PCR Validation

مقالات ذات صلة