House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) هو أحد خطوط الخلايا السمعية القليلة للفأر المتوفرة حاليا لأغراض البحث. يصف هذا البروتوكول كيفية العمل مع خلايا HEI-OC1 للتحقيق في التأثيرات السامة للخلايا للأدوية الدوائية بالإضافة إلى الخصائص الوظيفية لبروتينات الأذن الداخلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العمل مع الخلايا السمعية مؤسسات التعليم العالي-OC1
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
HEI-OC1 هي واحدة من خطوط الخلايا السمعية القليلة المتاحة لأغراض البحث. تم اقتراح هذه الخلايا في الأصل كنظام في المختبر لفحص الأدوية السامة للأذن ، وقد تم استخدامها للتحقيق في مسارات موت الخلايا المبرمج المنشط بالأدوية ، والالتهام الذاتي ، والشيخوخة ، وآلية حماية الخلايا ، والاستجابات الالتهابية ، وتمايز الخلايا ، والتأثيرات الجينية والجينية للأدوية الدوائية ، وآثار نقص الأكسجة ، وإجهاد الشبكة المؤكسدة والإندوبلازمية ، والتعبير عن القنوات الجزيئية والمستقبلات. من بين العديد من العلامات المهمة الأخرى لخلايا شعر القوقعة ، تعبر خلايا HEI-OC1 داخليا عن البريستين ، وهو البروتين الحركي النموذجي لخلايا الشعر الخارجية. وبالتالي ، يمكن أن تكون مفيدة جدا لتوضيح الجوانب الوظيفية الجديدة لهذا البروتين السمعي المهم. خلايا HEI-OC1 قوية جدا ، وعادة لا تسبب ثقافتها مضاعفات كبيرة. ومع ذلك ، فإنها تتطلب بعض الشروط الخاصة مثل تجنب استخدام الكوكتيلات الشائعة المضادة للبكتيريا التي تحتوي على الستربتومايسين أو المضادات الحيوية الأخرى وكذلك الحضانة عند 33 درجة مئوية لتحفيز تكاثر الخلايا وحضانة الخلايا عند 39 درجة مئوية لتحفيز تمايز الخلايا. هنا ، نصف كيفية زراعة خلايا HEI-OC1 وكيفية استخدامها في بعض المقايسات النموذجية ، مثل تكاثر الخلايا ، وقابليتها للحياة ، والموت ، والالتهام الذاتي ، والشيخوخة ، بالإضافة إلى كيفية إجراء قياسات السعة غير الخطية والمشبك الرقعة.
المقدمة
منزل الأذن معهد-الجهاز كورتي 1 تستمد (HEI-OC1) خلايا من الجهاز السمعي من 1،2 الماوس المعدلة وراثيا. حضانة أي خلية من هذا الفأر وراثيا في 33 ° C / 10٪ CO 2 (شروط متساهلة) يستحث تعبير عن الجينات تخليد الذي يقوم بتشغيل دي التمايز وتسارع انتشار. تحريك الخلايا إلى 39 ° C / 5٪ CO 2 (ظروف غير متساهلة) تؤدي إلى انخفاض انتشار، والتمايز، وعلى الأقل في حالة من مؤسسات التعليم العالي-OC1، موت الخلايا 2،3.
تم استنساخ خلايا التعليم العالي-OC1 وتميزت في المختبر لدينا منذ أكثر من عشر سنوات، وأشارت الدراسات الأولية أنها تعبير عن علاما....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. خلية ثقافة
ملاحظة: جميع البروتوكولات الخلية زراعة يجب أن يؤديها باستخدام تقنيات زراعة الخلايا السليمة (للاشارة رؤية 3 الفصول الأولى من بيولوجيا الخلية: دليل المختبر، المجلد الأول 10). خلايا التعليم العالي-OC1 لا تتطلب أي طلاء إضافي أو العلاج من الأطباق ثقافة الخلية لتمسك السليم والنمو. هام جدا: لا تستخدم الأطباق الزجاجية لأغراض زراعة الخلايا. والنمط الظاهري والاستجابة البيولوجية للخلايا للعقاقير الدوائية تغيير (G & F Kalinec Kalinec، غير منشورة). ينصح أطباق زراعة الخلايا البلاستيكية التقليدية (انظر جدول المواد / المعدات). إيلاء اهتمام خاص لتقنيات ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في بضع من المنشورات الحديثة أبلغنا مجموعة شاملة من الدراسات التي تهدف إلى تقييم استجابة الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 لعدة عقاقير الدوائية التي يشيع استخدامها وكذلك التحقيق في وظيفة prestin 8،9. في هذه الدراسات التي قطعناها على أنفسنا استخدام جميع البروتوكولات المذكورة في الأقسام السابقة.
كان واحدا من نتائج هذه الدراسات السابقة أن ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا التقرير وصفنا كيفية الثقافة خلايا التعليم العالي-OC1 واستخدامها لتقييم آليات للخلايا المخدرات التي يسببها والتحقيق في الخصائص الفنية للprestin، المحرك الجزيئي للقوقعة OHCs. الإجراءات الفنية، ومع ذلك، فإن العام بما فيه الكفاية لتتكيف بسهولة مع مختلف الدراسات.
إن جميع البروتوكولات المذكورة هنا الاستخدام الصحيح للتقنيات زراعة الخلايا راسخة 10. كما هو الحال مع أي خط الخلية الأخرى، والعمل مع خلايا ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب قائم أو محتمل في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة R01-DC010146 و R01-DC010397. ويقع على عاتق المؤلفين وحدهم ومحتواه ولا يمثل بالضرورة الرأي الرسمي للمعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| HEI-OC1 | جميع مجموعات الفحص والمعدات & nbsp ؛ | ||
| خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية | شركة بيكر | Sterilgard | III والشركات المشار إليها في |
| جهاز الطرد المركزي المبرد | Eppendorf | 5810R | العمودين السابقين هما فقط |
| المجهر المقلوب | Zeiss | Axiovert 25 | أمثلة ، ويمكن استخدام أي منتج آخر |
| مماثل لحمام الماء | Stovall | HWB115 | . |
| عداد الخلية | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| حاضنات خلية اثنان (2) ، واحدة عند 33 درجة ؛ C / 10٪ CO2< / sub> وغيرها عند 39 درجة ؛ C / 5٪ CO2< / sub> | Forma Scientific | 3110 | |
| ، PS ، 100 مم × 20 مم مع فتحات | جراينير Bio-One | 664-160 | |
| أطباق زراعة الخلايا ، PS ، ؛ 60 مم × 15 مم مع فتحات تهوية ؛ | قوارير Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar لزراعة الأنسجة 250 مل | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur قوارير 550 مل | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 لوحة ثقافة خلية جيدة ، مع غطاء Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| لوحة زراعة الأنسجة الدقيقة ، 96 بئر ، قاع مسطح مع غطاء | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate ، Chimmey ، 96 جيدا أبيض ، قاع شفاف | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبيلين مع غطاء Cellstars | Becton Dickinson & nbsp ؛ | 352070 | |
| 15 مل أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبلين مع غطاء-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | لايف تكنولوجيز | 10010-023 | |
| دولبكو s النسر المعدل s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| L-15 Medium ، لا يحتوي على فينول أحمر | Gibco / Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin ، 0.25٪ ؛ | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT مجموعة فحص انتشار الخلايا | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| مجموعة فحص انتشار الخلايا BrdU | الخلية | 6813 | |
| حل تفكك الخلايا غير الأنزيمي | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| مجموعة فحص السمية الخلوية الخضراء ذات | الخلوية Promega | ؛ G8741 | |
| أداة FACSAriaIII | BD Biosciences | FACSAriaIII | مع إثارة 488 نانومتر (ليزر أزرق) |
| ماسح ضوئي رقمي للبقع | LI-COR | C-DiGit | |
| الرحلان الكهربائي والنشاف | وحدة Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 قارئ لوحة مع Soft Max Pro 5.2 برامج | الأجهزة الجزيئية | SpectraMax 5 | |
| مكبر للصوت | HEKA | EPC-10 | |
| Puller للتحضير أقطاب التصحيح | Sutter | P-97 |
المراجع
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell li....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
