يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وتقليد من المكروية ورم: طريقة بسيطة لتوليد بالسكان خلية المخصب والتحقيق بين الخلايا الاتصالات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فهم التفاعلات غيروي مبكرة بين الخلايا السرطانية والمحيطة سدى غير سرطانية المهم في توضيح الأحداث التي أدت إلى تفعيل انسجة وإنشاء المكروية الورم (TME). عدة في التجارب المختبرية والنماذج الحية من TME تم تطويرها. ومع ذلك، في عام هذه النماذج لا تسمح بسهولة عزل السكان الخلية الفردية، في ظل ظروف غير تكدير، لمزيد من الدراسة. للتحايل على هذه الصعوبة، ونحن قد استخدمت في المختبر نموذج TME باستخدام الركيزة نمو الخلايا تتكون من نفاذية إدراج غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها تسمح الجيل بسيط من السكان الخلية التخصيب نمت بشكل وثيق، ولكن بشكل منفصل، على جانبي غشاء إدراج لتعاون موسع مرات ğ ثقافة. من خلال استخدام هذا النموذج، ونحن قادرون على توليد المخصب إلى حد كبير الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) السكان من العادية الخلايا الليفية الإنسان مضاعفا يليشارك في ثقافة (120 ساعة) مع خلايا سرطان الثدي النقيلي الإنسان إلى حد كبير، من دون استخدام العلامات الفلورية و / أو فرز الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، عن طريق تحوير حجم المسام من إدراج، يمكننا السيطرة على الوضع من الاتصالات بين الخلايا (على سبيل المثال، الاتصالات تقاطع الفجوة، والعوامل يفرز) بين اثنين من السكان الخلية مغاير، الذي يسمح التحقيق في الآليات الكامنة وراء تطور TME، بما في ذلك دور نفاذية الفجوة تقاطع. ويقدم النموذج بوصفه أداة قيمة في تعزيز فهمنا للأحداث الأولية مما أدى إلى بدء السرطان سدى، وتطور في وقت مبكر من TME، وتأثير تحوير للسدى على استجابات الخلايا السرطانية الى العوامل العلاجية.
المقدمة
المكروية الورم (TME) هو نظام معقد للغاية يتكون من خلايا سرطان أن تتعايش وتتطور جنبا إلى جنب مع سدى المضيف. يتكون هذا المكون انسجة عادة من الخلايا الليفية، myofibroblasts، والخلايا البطانية، ومختلف مكونات جهاز المناعة، وكذلك المصفوفة خارج الخلية 1. والمكونة كبير، في كثير من الأحيان أن غالبية هذه سدى، والخلايا الليفية تفعيلها، وكثيرا ما يشار إلى الخلايا الليفية المرتبطة السرطان أو الخلايا الليفية المرتبطة سرطان (CAF) 2،3. على عكس الخلايا الليفية الطبيعي، وعدم تفعيلها، تساهم مقاهي لبدء الورم، التقدم، الأوعية الدموية، والغزو، ورم خبيث، وتكرار 4-11 في مجموعة واسعة من السرطانات بما فيها سرطان الصدر وا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد وسائل الإعلام الثقافة والخلايا
- إعداد 500 مل من الدنيا والمتوسطة النسر الضروري أن تستكمل مع 12.5٪ (المجلد / المجلد) للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-ألانيل-L-الجلوتامين، و 100 وحدة من البنسلين و 100 ميكروغرام من الستربتومايسين لكل مل.
ملاحظة: متوسطة النمو وملحق (ق) يمكن تبادلها بسهولة لمتطلبات نمو سلالات الخلايا الأخرى أو خطوط الخلايا. - إعداد 70 ميكرولتر من مستنبت خلية لكل إدراج (6 جيدا شكل إدراج): الأساسية الدنيا والمتوسطة النسر تستكمل مع 50٪ (المجلد / المجلد) FBS....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نحن هنا تكييفها لنفاذية غشاء إدراج الصغيرة التي يسهل اختراقها لتطوير نظام خلايا شارك في ثقافة مغاير في المختبر الذي يحاكي في الجسم الحي المكروية ورم (الشكل 1). يسمح هذا النظام لاثنين من السكان مختلفة من الخلايا التي يمكن زراعتها على جانبي غشاء مسامي إدراج لفترات طويلة من الزمن (تصل إلى 120 ساعة، في استخدامنا). والأهم من هذا النظام هو قادرة على الحفاظ على نقاء السكان الخلية، على النحو الذي يحدده تصفيح GFP الموسومة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بروتوكول الموصوفة هنا هي بسيطة، قابلة للتكيف في إجراء المختبر (الشكل 1) التي تستخدم منفذ الصغيرة التي يسهل اختراقها إدراج غشاء لتوليد التخصيب السكان الخلية الفردية من شارك في ثقافة من خلايا غيروي. إلى حد كبير، وهذا النموذج هو مناسبة للتحقيق في مختلف وسائل الاتصال بين الخلايا. وتشمل الخطوات الحاسمة اختيار إدراج حجم المسام المناسب لمصلحة تجريبية محددة (ق)، وبذر سكان الخلية الأولى على الجانب السفلي من إدراج في المتوسط تستكمل مع 50٪ FBS، بذر سكان ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة أو المتصارعة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا البحث من خلال منح من لجنة نيوجيرسي لأبحاث السرطان (زمالة ما قبل الدكتوراه DFHS13PPCO17) ، والمعاهد الوطنية للصحة (CA049062) ، والإدارة الوطنية للملاحة الجوية والفضاء (NNX15AD62G).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>لثقافة الخلايا< / قوي> | |||
| AG01522 (i.< / em> ، AG1522) الخلايا الليفية ثنائية الصبغيات | البشرية Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 خط خلايا سرطان الثدي الغدي | PerkinElmer | 119261 | الخط الأبوي: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231 / GFP خط خلايا سرطان الثدي | الغدي Cell Biolabs | AKR-201 | |
| الوسط الأساسي من إيجل (MEM) | مصل كورنينج سيلجرو | 15-010-CV | |
| للجنين البقري (FBS) ، مكمل | F6178-500 مل | ||
| (200 ملي ل-ألانيل-إل-جلوتامين) | محلول كورنينج سيلجرو | 25-015-Cl | |
| بنسلين ستربتومايسين ، 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| إدراج Transwell (i.< / em> ، إدراج غشاء صغير يسهل اختراقه) (0.4 & mu ؛ م المسام) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.< / em> ، إدراج غشاء صغير يسهل اختراقه) (1 & mu ؛ م المسام) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.< / em> ، إدراج غشاء صغير يسهل اختراقه) (3 & mu ؛ م المسام) | كوستار | 3452 | |
| 6 آبار لوحة ثقافة | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 سم 2< / sup> قارورة زراعة الخلايا | CellStar | 658 170 | |
| ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | بدون الكالسيوم والمغنيسيوم |
| 0.25٪ (حجم / حجم) التربسين ، 2.21 ملي مولار EDTA ، 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 مل أنبوب الطرد المركزي | CellTreat | 229411 | |
| 35 مم × 10 مم طبق ثقافة الخلية | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for immunofluorescent المجهر المجهريمختبرات نقل التنبيغ < > | |||
| الفأر المضادة للكافيولين 1 | BD 610406 | In situ < / em> التألق المناعي - 1: 5,000 | |
| مضاد ثانوي مضاد للماعز IgG (H + L) ، Alexa Fluor 488 مترافق | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ< / em> التألق المناعي - 1: 2,000 |
| ألبومين مصل البقر - الكسر الخامس | روكلاند | BSA-50 | خالي من الغلوبولين المناعي والبروتياز |
| 16٪ (بالوزن / الحجم) محلول الفورمالديهايد | ThermoFisher Scientific | 28908 | مخفف إلى 4٪ مع 1x PBS |
| Premium Cover Glass (22 مم × 22 مم رقم 1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| كاشف SlowFade Gold المضاد للبهتان مع DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| <قوي>الاسم | <قوي>الشركة | رقم الكتالوج | Comments |
| لتحليل قياس التدفق الخلوي | |||
| calcein، مجسات جزيئية AM | C3100MP | ||
| محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| <قوي>الاسم | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blow Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction | Laboratories 610406 | Western Blot - 1: 1,000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| غشاء النيتروسليلوز (0.2 & mu; م) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein | Assay BioRad | 500-0116 | |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| أحادي هيدرات الديوكسي كولات الصوديوم (DOC) | سيجما | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30٪ محلول أكريلاميد / مكرر ، 37.5: 1 | BioRad | 161-0158 |
المراجع
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009)....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
