وتقليد من المكروية ورم: طريقة بسيطة لتوليد بالسكان خلية المخصب والتحقيق بين الخلايا الاتصالات

Summary

< p class = 'jove_content'> قمنا بتكييف غشاء صغير يسهل اختراقه لتقليد البيئة المكروية للورم (TME). يتكون النموذج من ثقافة خلايا مختلطة ، ويسمح بتوليد مبسط لمجموعات الخلايا الفردية عالية الإثراء دون استخدام علامات الفلورسنت أو فرز الخلايا ، ويسمح بدراسة الاتصال بين الخلايا داخل TME في ظل الظروف العادية أو الإجهاد.

Abstract

فهم التفاعلات غيروي مبكرة بين الخلايا السرطانية والمحيطة سدى غير سرطانية المهم في توضيح الأحداث التي أدت إلى تفعيل انسجة وإنشاء المكروية الورم (TME). عدة في التجارب المختبرية والنماذج الحية من TME تم تطويرها. ومع ذلك، في عام هذه النماذج لا تسمح بسهولة عزل السكان الخلية الفردية، في ظل ظروف غير تكدير، لمزيد من الدراسة. للتحايل على هذه الصعوبة، ونحن قد استخدمت في المختبر نموذج TME باستخدام الركيزة نمو الخلايا تتكون من نفاذية إدراج غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها تسمح الجيل بسيط من السكان الخلية التخصيب نمت بشكل وثيق، ولكن بشكل منفصل، على جانبي غشاء إدراج لتعاون موسع مرات ğ ثقافة. من خلال استخدام هذا النموذج، ونحن قادرون على توليد المخصب إلى حد كبير الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) السكان من العادية الخلايا الليفية الإنسان مضاعفا يليشارك في ثقافة (120 ساعة) مع خلايا سرطان الثدي النقيلي الإنسان إلى حد كبير، من دون استخدام العلامات الفلورية و / أو فرز الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، عن طريق تحوير حجم المسام من إدراج، يمكننا السيطرة على الوضع من الاتصالات بين الخلايا (على سبيل المثال، الاتصالات تقاطع الفجوة، والعوامل يفرز) بين اثنين من السكان الخلية مغاير، الذي يسمح التحقيق في الآليات الكامنة وراء تطور TME، بما في ذلك دور نفاذية الفجوة تقاطع. ويقدم النموذج بوصفه أداة قيمة في تعزيز فهمنا للأحداث الأولية مما أدى إلى بدء السرطان سدى، وتطور في وقت مبكر من TME، وتأثير تحوير للسدى على استجابات الخلايا السرطانية الى العوامل العلاجية.

Introduction

المكروية الورم (TME) هو نظام معقد للغاية يتكون من خلايا سرطان أن تتعايش وتتطور جنبا إلى جنب مع سدى المضيف. يتكون هذا المكون انسجة عادة من الخلايا الليفية، myofibroblasts، والخلايا البطانية، ومختلف مكونات جهاز المناعة، وكذلك المصفوفة خارج الخلية ^1. والمكونة كبير، في كثير من الأحيان أن غالبية هذه سدى، والخلايا الليفية تفعيلها، وكثيرا ما يشار إلى الخلايا الليفية المرتبطة السرطان أو الخلايا الليفية المرتبطة سرطان (CAF) ^2،3. على عكس الخلايا الليفية الطبيعي، وعدم تفعيلها، تساهم مقاهي لبدء الورم، التقدم، الأوعية الدموية، والغزو، ورم خبيث، وتكرار ^4-11 في مجموعة واسعة من السرطانات بما فيها سرطان الصدر وا....

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام الثقافة والخلايا

1. إعداد 500 مل من الدنيا والمتوسطة النسر الضروري أن تستكمل مع 12.5٪ (المجلد / المجلد) للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-ألانيل-L-الجلوتامين، و 100 وحدة من البنسلين و 100 ميكروغرام من الستربتومايسين لكل مل.
   ملاحظة: متوسطة النمو وملحق (ق) يمكن تبادلها بسهولة لمتطلبات نمو سلالات الخلايا الأخرى أو خطوط الخلايا.
2. إعداد 70 ميكرولتر من مستنبت خلية لكل إدراج (6 جيدا شكل إدراج): الأساسية الدنيا والمتوسطة النسر تستكمل مع 50٪ (المجلد / المجلد) FBS....

Results

نحن هنا تكييفها لنفاذية غشاء إدراج الصغيرة التي يسهل اختراقها لتطوير نظام خلايا شارك في ثقافة مغاير في المختبر الذي يحاكي في الجسم الحي المكروية ورم (الشكل 1). يسمح هذا النظام لاثنين من السكان مختلفة من الخلايا التي يمكن زراعتها على جانبي غشاء مسامي إدراج لفترات طويلة من الزمن (تصل إلى 120 ساعة، في استخدامنا). والأهم من هذا النظام هو قادرة على الحفاظ على نقاء السكان الخلية، على النحو الذي يحدده تصفيح GFP الموسومة .......

Discussion

بروتوكول الموصوفة هنا هي بسيطة، قابلة للتكيف في إجراء المختبر (الشكل 1) التي تستخدم منفذ الصغيرة التي يسهل اختراقها إدراج غشاء لتوليد التخصيب السكان الخلية الفردية من شارك في ثقافة من خلايا غيروي. إلى حد كبير، وهذا النموذج هو مناسبة للتحقيق في مختلف وسائل الاتصال بين الخلايا. وتشمل الخطوات الحاسمة اختيار إدراج حجم المسام المناسب لمصلحة تجريبية محددة (ق)، وبذر سكان الخلية الأولى على الجانب السفلي من إدراج في المتوسط ​​تستكمل مع 50٪ FBS، بذر سكان ا.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<قوي>لثقافة الخلايا< / قوي>
AG01522 (i.< / em> ، AG1522) الخلايا الليفية ثنائية الصبغيات	البشرية Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 خط خلايا سرطان الثدي الغدي	PerkinElmer	119261	الخط الأبوي: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231 / GFP خط خلايا سرطان الثدي	الغدي Cell Biolabs	AKR-201
الوسط الأساسي من إيجل (MEM)	مصل كورنينج سيلجرو	15-010-CV
للجنين البقري (FBS) ، مكمل		F6178-500 مل
(200 ملي ل-ألانيل-إل-جلوتامين)	محلول كورنينج سيلجرو	25-015-Cl
بنسلين ستربتومايسين ، 100x	Corning Cellgro	30-002-Cl
إدراج Transwell (i.< / em> ، إدراج غشاء صغير يسهل اختراقه) (0.4 & mu ؛ م المسام)	Costar	3450
Transwell Insert (i.< / em> ، إدراج غشاء صغير يسهل اختراقه) (1 & mu ؛ م المسام)	Greiner bio-one	657610
Transwell Insert (i.< / em> ، إدراج غشاء صغير يسهل اختراقه) (3 & mu ؛ م المسام)	كوستار	3452
6 آبار لوحة ثقافة	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 سم 2< / sup> قارورة زراعة الخلايا	CellStar	658 170
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 1x	Corning Cellgro	21-040-CV	بدون الكالسيوم والمغنيسيوم
0.25٪ (حجم / حجم) التربسين ، 2.21 ملي مولار EDTA ، 1x	Corning Cellgro	25-053-Cl
15 مل أنبوب الطرد المركزي	CellTreat	229411
35 مم × 10 مم طبق ثقافة الخلية	Greiner bio-one	627 160
Name	Company	Catalog Number	Comments
for immunofluorescent المجهر المجهريمختبرات نقل التنبيغ < >
الفأر المضادة للكافيولين 1		BD 610406	In situ < / em> التألق المناعي - 1: 5,000
مضاد ثانوي مضاد للماعز IgG (H + L) ، Alexa Fluor 488 مترافق	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ< / em> التألق المناعي - 1: 2,000
ألبومين مصل البقر - الكسر الخامس	روكلاند	BSA-50	خالي من الغلوبولين المناعي والبروتياز
16٪ (بالوزن / الحجم) محلول الفورمالديهايد	ThermoFisher Scientific	28908	مخفف إلى 4٪ مع 1x PBS
Premium Cover Glass (22 مم × 22 مم رقم 1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
كاشف SlowFade Gold المضاد للبهتان مع DAPI	Invitrogen	S36938
<قوي>الاسم	<قوي>الشركة	رقم الكتالوج	Comments
لتحليل قياس التدفق الخلوي
calcein، مجسات جزيئية AM		C3100MP
محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS)	Gibco	14025-076
<قوي>الاسم	Company	Catalog Number	Comments
For Western Blow Analysis
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction	Laboratories 610406	Western Blot - 1: 1,000
Tween-20	BioRad	170-6531
غشاء النيتروسليلوز (0.2 & mu; م)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein	Assay BioRad	500-0116
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)	BioRad	161-0302
أحادي هيدرات الديوكسي كولات الصوديوم (DOC)	سيجما	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
30٪ محلول أكريلاميد / مكرر ، 37.5: 1	BioRad	161-0158