نصف هنا نظاما يستخدم كتلة بروتين خاصة بالموقع وقابلة للانعكاس في الجسم الحي لإيقاف وطي شوكات النسخ المتماثل في الإشريكية القولونية. يتم تقييم إنشاء كتلة النسخ المتماثل عن طريق المجهر الفلوري ويتم استخدام الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز ثنائي الأبعاد المحايد المحايد لتصور المواد الوسيطة للنسخ المتماثل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الأمر الذي أدى إلى انسداد النسخ المتماثل الموقع المحدد في
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العقبات موجودة على الحمض النووي، بما في ذلك البروتينات بإحكام والآفات المختلفة، يمكن أن تمنع بشدة تطور ماكينات النسخ المتماثل الخلية. وتوقف لجسيم مكرر يمكن أن يؤدي إلى التفكك لها من كروموسوم، سواء في جزء أو مجملها، مما أدى إلى انهيار شوكة النسخ المتماثل. الشفاء من هذا الانهيار هو ضرورة للخلية لبدقة كاملة ازدواج الكروموسومات وتقسيم وقت لاحق. آليات متنوعة لذلك، عند حدوث الانهيار، الخلية تطورت التي تجري لاستعادة شوكة الحمض النووي والسماح النسخ المتماثل إلى أن تكتمل مع الدقة العالية. سابقا، وقد تم دراسة هذه المسارات إصلاح تكرارها في البكتيريا باستخدام أضرار الأشعة فوق البنفسجية، والتي لديها عيب عدم المترجمة إلى موقع معروف. توضح هذه المخطوطة على نظام يستخدم نظام الإسفار كاظمة المشغل (FROS) لإنشاء كتلة البروتين في مواقع محددة يمكن أن تحفز المماطلة وانهيار تكرار FOركس في القولونية. البروتوكولات بالتفصيل كيفية وضع النسخ المتماثل يمكن تصور في الخلايا الحية واحدة باستخدام المجهر مضان وتكرار الحمض النووي وسيطة يمكن تحليلها من قبل 2-الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز. ويمكن إدراج درجة الحرارة المسوخ الحساسة من مكونات جسيم مكرر (على سبيل المثال DnaBts) في النظام للحث على انهيار متزامن من تكرار الشوك. وعلاوة على ذلك، فإن الأدوار من البروتينات إعادة التركيب وhelicases التي تشارك في هذه العمليات يمكن دراستها باستخدام بالضربة القاضية الجينية داخل هذا النظام.
المقدمة
خلال تكرار الحمض النووي، وجسيم مكرر يواجه عقبات على الحمض النووي التي تعيق تقدمه. الحمض النووي من التلف بما في ذلك الآفات والثغرات فضلا عن الهياكل الشاذة يمكن أن تمنع جسيم مكرر من المضي 1. في الآونة الأخيرة، فقد وجد أن البروتينات منضمة إلى الحمض النووي هي المصدر الأكثر شيوعا للإعاقة على النسخ المتماثل تطور شوكة 2. معرفة الأحداث التي أعقبت لقاء للجسيم مكرر مع كتلة البروتين النووي قد سبق محدودة بسبب عدم القدرة على إحداث مثل كتلة في الكروموسوم من خلية حية في مكان معروف. في المختبر تحليل عززت فهمنا للسلوك الحركي من جسيم مكرر نشطة عندما تجتمع انسداد البروتين النووي 3، فضلا عن تفاصيل الآلية للجسيم مكرر نفسها 4،5. ويتم الاضطلاع الفهم الحالي للإصلاح النسخ المتماثل عادة مع الأشعة فوق البنفسجية وكيلا ضررا وتدرس باستخدام الحمض النووي البلازميد في الجسم الحي 6-8 . في حين أن البروتينات التي يمكن أن تشارك في إصلاح الحمض النووي بعد أنه واجه في الجسم الحي كتلة البروتين النووي مفهومة عموما من هذه الدراسات ما إذا كانت هناك اختلافات في الأحداث الجزيئية ضمن مسارات الإصلاح نظرا لسبب واضح في كتلة تكرارها لا يزال حتى الآن يحدد لاحقا.
هنا، نحن تصف النظام الذي يسمح للكتلة البروتين النووي التي ستنشأ في مكان معين من الكروموسوم باستخدام كاظمة نظام التشغيل نيون (FROS). علينا الاستفادة من سلالة من E. القولونية التي تمت زيارتها مجموعة من 240 مواقع تيتو دمجها في كروموسوم 9. كل موقع TETO ضمن مجموعة لديه 10 نقطة أساس تسلسل عشوائي المرافقة لزيادة استقرار مجموعة عن طريق منع إعادة التركيب بوساطة RECA داخل المصفوفة. هذه المجموعة، والاختلافات منه، واستخدمت أصلا لفهم E. القولونية ديناميات كروموسوم 10،11 ولكن تم بعد ذلك تكييفها لpreveالإقليم الشمالي في الجسم الحي تكرار 12. تم العثور على مجموعة إلى الحفاظ عليها بشكل مستقر ولمنع ما يقرب من 100٪ من الشوك النسخ المتماثل عند ملزمة TetR 10،12. وقد وجدت استخدام مجموعة LACO مماثلة في المختبر عدد قليل من كانت 22 موقعا كافية لمنع 90٪ من التكرار، على الرغم من أن هذه المجموعة أقصر كانت أقل فعالية في الجسم الحي 13. للتكيف مع مجموعة لإنشاء انسداد البروتين النووي، والبروتين كاظمة يجب أن يفرط إنتاجها للغاية في ظل الظروف الأمثل حيث أنه بعد ذلك بربط مجموعة لإنشاء حاجز. تشكيل انسداد، والإفراج لاحقا، يمكن رصدها من خلال استخدام المجهر مضان إذا تم استخدام البديل الموسومة fluorescently من قامع تيت. يشار إلى حالة تكرارها في كل خلية من قبل عدد من البؤر ينظر، حيث نقطة محورية واحدة تعني نسخة واحدة فقط من مجموعة موجودة داخل الخلية وبؤر متعددة تدل على تكرار النشط. هذا إعادة النشطةيتم تمكين الثني عندما يتم عكس انسداد البروتين النووي من خلال إضافة محفز مبرر له أن يقلل من تقارب ملزمة من TetR للموقع المشغل بما فيه الكفاية لجسيم مكرر على المضي قدما من خلال مجموعة. بروتين كاظمة لا يزال قادرا على ربط الحمض النووي مع قابلية عالية بما فيه الكفاية أن النسخ الآن متعددة من مجموعة يمكن تصور.
يمكن اكتشاف تفاصيل أكثر تعقيدا من الأحداث في انسداد البروتين النووي باستخدام محايد محايد ثنائي الأبعاد الاغاروز الكهربائي للهلام والتهجين الجنوبي 14-16. هذه التقنيات تسمح للتحليل الهياكل الحمض النووي عبر السكان. وسيطة النسخ التي يتم تشكيلها خلال هذا الحدث، وربما لا تزال دون اصلاح، يمكن تصور. من خلال تغيير انزيم التقييد وتحقيق الاستفادة منها، وسيطة يمكن تصور ليس فقط في المنطقة ولكن أيضا مجموعة من المنبع مجموعة عندما يرتد شوكة تكرار 17،18. الالانحدار يقام لاحقا إلى التفكك جسيم مكرر. فروع الوليدة الرائدة والمتخلفة منفصلة عن مسارات قالب ويصلب لبعضها البعض كما فروع قالب بالتزامن إعادة يصلب، مما أدى إلى بنية الحمض النووي رباعية (أ تقاطع هوليداي).
باستخدام هذا النظام فقد تبين أن شوكة تكرار غير مستقر عندما يواجه هذه الكتلة 18. وبالإضافة إلى ذلك، ودرجة الحرارة المشتقات الحساسة من مكونات جسيم مكرر يمكن استخدامها لمنع إعادة الشوكة تكرارها بعد أن يكون قد انهارت. مرة واحدة يتم تأسيس كتلة، سلالة يمكن تحويل إلى درجة حرارة غير متساهلة لضمان التعطيل متزامن من جسيم مكرر والوقاية التي تتحكم فيها من إعادة شحن. هذا التعطيل الناجم عن الحرارة يضمن كل من الشوك في أوساط السكان قد انهار في وقت معين، ويسمح تقييم ما يحدث عندما ينهار جسيم مكرر، وكيف يتم معالجة الحمض النووي، وما هو المطلوب لإعادةبدء عملية تكرار الحمض النووي.
ميزة من النظام المذكور هنا هو أن كتلة البروتين النووي هو عكسها تماما. وبالتالي فإن قدرة الخلايا على التعافي من كتلة البروتين النووي هي قادرة على أن يتبع. وإضافة إلى anhydrotetracycline الخلايا تخفيف الربط ضيق من كاظمة، والسماح لشوكة النسخ المتماثل إلى المضي قدما من خلال والخلية لاستعادة قدرتها على البقاء. تخفيف من انسداد يمكن تصور بواسطة محايد محايد ثنائي الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز بعد 5 دقائق، وبواسطة المجهر في غضون 10 دقيقة. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل الجدوى تكشف عن قدرة سلالة للتعافي من انسداد التكرار والاستمرار لتتكاثر.
عن طريق تغيير الخلفية الوراثية للسلالات المستخدمة في إجراء التجارب وصفها هنا، مسارات إصلاح لهذا النوع من انسداد يمكن إجمال.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. حجب النسخ المتماثل مع FROS
- تحريض انسداد النسخ المتماثل
- تمييع ثقافة بين عشية وضحاها جديدة من E. كولاي سلالة تحمل مجموعة وتيتو وpKM1 18 إلى OD ل 600Nm = 0.01 في المتوسط تمييع المعقدة (0.1٪ تريبتون، 0.05٪ مستخلص الخميرة، 0.1٪ كلوريد الصوديوم، 0.17 M KH 2 PO 4، 0.72 MK 2 هبو 4) مع المضادات الحيوية كما هو مطلوب للاختيار.
ملاحظة: لا تقم بإضافة التتراسيكلين لاختيار لأنه غير متوافق مع هذا النظام. جعل حجم الثقافة أي ما يعادل 10 مل لكل عينة المطلوبة. على سبيل المثال، وحجم ثقافة التصميم التجريبي في الشكل رقم 1 هو 60 مل. - ينمو بمعدل 30 درجة مئوية مع الهز حتى OD 600 نانومتر = 0،05-،1. إزالة عينة 10 مل لتكون بمثابة سيطرة uninduced وإضافة 0.1٪ الارابينوز للثقافة المتبقية للحث على إنتاج TetR-YFP من pKM1. تستمر في النمو على حد سواء uninduced والتي يسببهاالثقافات. بعد 1 ساعة، والتحقق من وجود نقطة اتصال واحدة داخل كل خلية من الثقافة التي يسببها باستخدام المجهر مضان (انظر القسم 2).
- وإذا تأكدت منعت الخلايا المستحثة (أكثر من 70٪ من الخلايا لديها تركيز واحد)، سجل ل 600Nm OD واتخاذ 7.5 مل عينة لتحليلها من قبل المواد الهلامية 2-D (انظر القسم 3). أخذ عينة ما يعادلها من ثقافة السيطرة uninduced.
- تمييع ثقافة بين عشية وضحاها جديدة من E. كولاي سلالة تحمل مجموعة وتيتو وpKM1 18 إلى OD ل 600Nm = 0.01 في المتوسط تمييع المعقدة (0.1٪ تريبتون، 0.05٪ مستخلص الخميرة، 0.1٪ كلوريد الصوديوم، 0.17 M KH 2 PO 4، 0.72 MK 2 هبو 4) مع المضادات الحيوية كما هو مطلوب للاختيار.
- الافراج عن انسداد النسخ المتماثل
- الافراج عن كتلة التكرار، إضافة 100 نانوغرام -1 مل من محفز anhydrotetracycline مبرر (AT) لعينة 10 مل من الخلايا المحظورة. تستمر في النمو عند 30 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وأخذ عينات للكثافة الخلية (1 مل)، والتحليل المجهري (10 ميكرولتر) ومحايد محايدة المواد الهلامية الاغاروز 2-الأبعاد (7.5 مل).
- حمل انهيار جسيم مكرر
- إذا كانت الخلايا تحتوي على أليل درجة الحرارة حساسة مثل نهاية الخبر dnaB أو نهاية الخبر dnaC يتطلب deactivaنشوئها، نقل قارورة تحتوي على خلايا سدت إلى 42 درجة مئوية. أخذ عينات لتحليلها في نقاط زمنية المطلوبة (على سبيل المثال، 1 ساعة بعد الحضانة). بعد الخلايا والمحتضنة في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، وتحول الخلايا إلى 30 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (انظر الشكل 1).
ملاحظة: يمكن تحويل الخلايا إلى 30 درجة مئوية لتحليل الشوط الثاني.
- إذا كانت الخلايا تحتوي على أليل درجة الحرارة حساسة مثل نهاية الخبر dnaB أو نهاية الخبر dnaC يتطلب deactivaنشوئها، نقل قارورة تحتوي على خلايا سدت إلى 42 درجة مئوية. أخذ عينات لتحليلها في نقاط زمنية المطلوبة (على سبيل المثال، 1 ساعة بعد الحضانة). بعد الخلايا والمحتضنة في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، وتحول الخلايا إلى 30 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (انظر الشكل 1).
الشكل 1: لمحة عامة عن إجراء كتلة والإصدار التجريبي FROS النسخ المتماثل E. تزرع سلالات بكتيريا تحمل مجموعة تيتو عند 30 درجة مئوية. عندما تصل الخلايا ول 600Nm OD من فوق 0.05، والناجم عن إنتاج TetR-YFP مع الارابينوز (آرا؛ 0.1٪). تستمر في النمو جزء من السكان من الخلايا uninduced لتكون بمثابة الضوابط عند 30 درجة مئوية. ويتم تحليل عينة من الخلايا التي يسببها عبر المجهر مضان بعد 1-2 ساعة (انظر 2.1). إذا النسخ المتماثلوأكد أن يكون قد تم حظره، يتم أخذ عينات للتحليل هلام 2-D يتبين من أنابيب الاختبار (انظر 3.1) واختبارات الجدوى (اختياري). انسداد النسخ المتماثل يمكن إزالتها مع anhydrotetracycline (AT؛ 0.1 ميكروغرام / مل)، وخلايا تحليلها بعد 10 دقيقة. إذا كانت الخلايا تحمل أليل درجة الحرارة حساسة (مثل dnaB نهاية الخبر)، وهذا يمكن أن يكون المعطل عن طريق تحويل الخلايا سدت إلى 42 درجة مئوية لمدة التحليل المناسب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. الإسفار المجهر
- إعداد وحة agarose من قبل pipetting 500 ميكرولتر من الاغاروز المنصهر (1٪ في الماء) على شريحة المجهر. تراكب ساترة على الفور قبل أن يتصلب الاغاروز. تخزين الشريحة (ق) في الأنسجة الرطب في 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها.
- عندما وقد عززت الاغاروز، إزالة ساترة من لوحة الأغاروس وماصة 10 ميكرولتر من بكتيرياثقافة على وسط لوحة لمنع الحركة من الخلايا خلال التصور. مرة واحدة العينة قد جفت (حوالي 5 دقائق)، استبدال ساترة. وضع قطرة من زيت الغمر على انزلاق الغطاء ووضع الشريحة تحت البصريات.
- تصور الخلايا عن طريق الميكروسكوب المرحلة في 100X التكبير.
- في مربع الحوار اكتساب ضمن برامج التصوير، تعيين وقت التعرض إلى 100 مللي ثانية. التقاط الصور عن طريق اختيار اكتساب. لا تتحرك المرحلة. في مربع الحوار اكتساب، حدد YFP كما الإضاءة لمصراع خارجية تتصل الكاميرا. ضبط الوقت exporsure إلى 1000 ميللي ثانية. إيقاف ضوء المرحلة. التقاط صورة مضان عن طريق اختيار اكتساب.
ملاحظة: الوقت قد تختلف تبعا لمصدر الضوء، والمجهر والكاميرا المستخدمة. - تراكب مرحلة والصور الفلورسنت، وتحديد اللون الجمع من داخل قائمة العرض. في لون مربع الحوار الجمع، حدد الصورة YFP باعتبارها العنصر الأخضر وصورة المرحلة كما ازعنصر رق. انقر على اللون الجمع. تحديد ما إذا كان السكان قد كان تكرار سدت بنجاح من خلال تأسيس ما إذا كانت الغالبية العظمى من الخلايا لديها تركيز واحد لكل خلية.
ملاحظة: مقارنة على عينة من السيطرة من دون الارابينوز المضافة هي مفيدة لتحديد بصريا الفرق في الإنتاج EYFP.
- في مربع الحوار اكتساب ضمن برامج التصوير، تعيين وقت التعرض إلى 100 مللي ثانية. التقاط الصور عن طريق اختيار اكتساب. لا تتحرك المرحلة. في مربع الحوار اكتساب، حدد YFP كما الإضاءة لمصراع خارجية تتصل الكاميرا. ضبط الوقت exporsure إلى 1000 ميللي ثانية. إيقاف ضوء المرحلة. التقاط صورة مضان عن طريق اختيار اكتساب.
3. استخراج الحمض النووي / الاغاروز المقابس
- إضافة أزيد الصوديوم (تركيز النهائي من 0.1٪) للعينات ثقافة 7.5 مل من خطوات 1.1.3 و 1.2.1. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق على الأقل.
ملاحظة: أزيد الصوديوم هي سامة للغاية. الاطلاع على ورقة بيانات السلامة قبل بدء العمل وليس التعامل معها إلا بعد قراءة جميع احتياطات السلامة وفهمها. - الطرد المركزي الخلايا 5000 x ج لمدة 10 دقيقة لتكوير الخلايا. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر من PETT الرابع (التعريف الشخصية) العازلة (10 ملي تريس: حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 1 M كلوريد الصوديوم). microcentrifuge ل(13، 000 x ج لمدة 2 دقيقة) لتكوير الخلايا. ديscard طاف. في هذه المرحلة، وعملية الكريات أخرى أو مخزن في -20 درجة مئوية.
- resuspend الخلايا مع أقل كثافة الخلية في التعريف الشخصية 50 ميكرولتر ومكان عند 50 درجة مئوية. لجميع العينات الأخرى، وضبط كميات من التعريف الشخصية بحيث كثافة الخلية النهائية هي نفسها في كل أنبوب (على سبيل المثال نموذج 1 (OD ل 600Nm = 0.128) معلق في 50 ميكرولتر، نموذج 2 (OD ل 600Nm = 0.138) معلق في 54 ميكرولتر).
- إضافة حجم مساو من الطازجة حل الاغاروز 0.8٪ في التعريف الشخصية (اضرب النهائي 0.4٪؛ على سبيل المثال نموذج 1 50 ميكرولتر، نموذج 2 54 ميكرولتر). تأكد من أن العينات، الاغاروز والتعريف الشخصية هم فوق 50 درجة مئوية إلى منع التصلب.
- علاج شريحة المجهر مع 40 ميكرولتر من الزجاج بالماء طارد أو السيليكون الحل المناسب. فرك الشريحة بمنديل حتى يجف.
ملاحظة: يمكن ان يتم ذلك في وقت مبكر والشرائح تعامل تخزين على المدى الطويل في درجة حرارة الغرفة. - وضع 20 قطرات ميكرولتر من ركان تعليق خلية / الاغاروز على الشريحة لإنتاج المقابس التي هي نصف كروية.
ملاحظة: إن العينة الأولى (معلق في 50 ميكرولتر التعريف الشخصي) تنتج 5 شمعات على شريحة واحدة. - عندما توطد المقابس، وشريحة منهم بلطف إلى أنبوب microfuge وإضافة 1 مل العازلة خلية تحلل (10 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك [الحموضة 8]، 1 M كلوريد الصوديوم، 100 حمض ملي Ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، 0.2٪ deoxycholate الصوديوم، 0.5٪ N-Lauroylsarcosine ملح الصوديوم (Sarkosyl)، 100 ميكروغرام مل - 1 الليزوزيم، 50 ميكروغرام مل - 1 ريبونوكلياز A). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- إزالة المنطقة العازلة خلية تحلل وإضافة / Sarcosyl / بروتين كاف (ESP) حل 1 مل EDTA (0.5 M EDTA، 1٪ N-Lauroylsarcosine ملح الصوديوم (Sarkosyl)، 1 ملغ مل - 1 بروتين K). احتضان عند 50 درجة مئوية خلال الليل أو حتى المقابس شفافة. إذا كنت بحاجة لحضانة بين عشية وضحاها الثانية، يحل محل الحل ESP مع العازلة جديدة بعد ما يقرب من 18 ساعة.
- مسح الESP العازلة وغسل المقابس 5 مرات مع 12 مل تريس، EDTA (TE) العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8.0)، والسماح لموازنة 30 دقيقة مع كل غسل. تخزينها في 4 درجة مئوية في 1 مل العازلة TE.
4. محايد محايد 2-الأبعاد جل الكهربائي
- نقل أحد المكونات الاغاروز من الخطوة 3.8 إلى أنبوب microfuge جديدة وإضافة 150 ميكرولتر من العازلة انزيم التقييد (1X التركيز). إضافة 25-100 وحدة من انزيم التقييد (على سبيل المثال، 60 وحدة من EcoRV. (انظر الشكل 3A)). الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعة.
- في 4 درجات مئوية، صب جل الاغاروز 0.4٪ (300 مل) في 1X تريس / بورات / EDTA (TBE) في علبة جل ما يقرب من 25 × 25 سم. إدراج مشط لجعل الآبار تقريبا نفس عرض قطرها من المكونات. عندما يتم تعيين هلام، وإزالة المشط ونقل الجل إلى درجة حرارة الغرفة.
- شريحة واحدة من المقابس الأغاروس هضمها في بئر، وتحديد المواقع الشريحة مسطحة من المكونات ضد الجانب من البئر حيث tوقال انه الحمض النووي دخول هلام. إدراج سد واحد بنفس الطريقة في كل بئر ثانية.
- ماصة المنصهرة 0.4٪ الاغاروز في الآبار لختم المقابس في الموقف.
- تحميل 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي في بئر فارغة، تغادر مرة أخرى وجود فجوة بين السلم والعينات، وتشغيل هلام بين عشية وضحاها (16 ساعة و 55 V) في 1X TBE في درجة حرارة الغرفة.
- وصمة عار الجل في حمام مائي يحتوي على إيثيديوم بروميد (0.3 ميكروغرام مل -1) لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: يعتبر بروميد إيثيديوم المغير قوية والسم. الاطلاع على ورقة بيانات السلامة قبل بدء العمل وليس التعامل معها إلا بعد قراءة جميع احتياطات السلامة وفهمها. - تصور الحمض النووي مع موجة طويلة نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية وقطع كل جزء حارة مع مباشرة، حتى قطع، والتقليل من إدراج الاغاروز الزائد على جانبي الممر.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان جزء من الفائدة 5.5 كيلوبايت، وقطع جزء 7.5 سم لتشمل أجزاء من الحمض النووي من 5 كيلو بايت إلى approximatاعل 12 كيلو بايت (انظر الشكل 3A). - ضع حارة هلام المستأصل في علبة الجل على 90 درجة إلى اتجاه الهجرة الحمض النووي.
ملاحظة: صفين من 3 شظايا هلام يمكن أن يصلح في علبة هلام 25 × 25 سم 2. الصف الأول من الممرات هلام في الجزء العلوي من الدرج، والصف الثاني في 12.5 سم. - إعداد 300 مل الاغاروز لهلام البعد الثاني (0.9٪ في 1X TBE مع 0.3 ميكروغرام مل -1 بروميد إيثيديوم). عندما يتم تبريد الاغاروز إلى 50 درجة مئوية، ماصة للالاغاروز المنصهر حول شرائح هلام لترسيخ موقفهم. صب الاغاروز المتبقية في علبة لعمق هذا هو مستوى على الأقل مع شرائح هلام.
- بمجرد عزز الجل، electrophorese في 4 درجات مئوية في 1X TBE تحتوي على 0.3 ميكروغرام مل -1 بروميد إيثيديوم في 220 فولت حتى هاجر الحمض النووي حوالي 10 سم.
ملاحظة: 4 ساعات كافية لجزء 5.5 كيلوبايت ولكن جزء أصغر تحتاج إلى وقت أقل. - استئصال كتل حيث الحمض النووي الجيني هو ش الحاليالغناء حافة مسطرة معدنية، بما في ذلك جل فوقه لتشمل الحمض النووي التي هي غير مرئية (انظر الشكل 3C).
5. التهجين الجنوبي
- إعداد الحل
- إعداد عازلة نزع البورينات (0.125 M حمض الهيدروكلوريك الحل).
ملاحظة: هذا المخزن يمكن إعادة استخدامها وغير مستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 1 في الشهر. - إعداد تمسخ العازلة (1.5 M كلوريد الصوديوم، و 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم).
ملاحظة: تمسخ عازلة يمكن إعادة استخدامها مرة واحدة وغير مستقر لمدة تصل إلى 3 أشهر في درجة حرارة الغرفة. - إعداد العازلة تحييد (1.5 M كلوريد الصوديوم، و 0.5 M تريس). ضبط لدرجة الحموضة 7.5 مع حمض الهيدروكلوريك.
ملاحظة: يمكن إعادة استخدامها عازلة تحييد مرة واحدة ومستقر لمدة تصل إلى 3 أشهر في درجة حرارة الغرفة. - إعداد 10X المالحة سترات الصوديوم (SSC) العازلة (0.15 م سترات ثلاثي الصوديوم، كلوريد الصوديوم 1.5 M، درجة الحموضة 7-8) لاستخدامها في الخطوات 5.2.4 و5.2.6. من هذا المخزن المؤقت، وجعل الأسهم SSC 2X (للاستخدام في الخطوة 5.2.9).
ملاحظة: SSC 10X و 2x SSC لإعادة مستقرة عند RT لمدة 3 أشهر. - إعداد التعديل الكنيسة وجيلبرت التهجين العازلة 19 (0.5 M الفوسفات العازلة [الرقم الهيدروجيني 7.2]، 7٪ (ث / ت) كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS)، 10 ملي EDTA). ترك عند 65 درجة مئوية إلى حل قبل تماما للاستخدام.
- إعداد عازلة نزع البورينات (0.125 M حمض الهيدروكلوريك الحل).
- تحويل
- شطف كتل هلام رفعه في حل نزع البورينات لمدة 10 دقيقة في RT على الكرسي الهزاز أو شاكر المداري. حافظ على سرعة الإثارة منخفضة لتجنب إتلاف كتل الاغاروز.
- شطف كتل هلام لفترة وجيزة مع الماء المقطر ثم مع العازلة تمسخ لمدة 30 دقيقة. شطف مرة أخرى لفترة وجيزة في الماء المقطر ثم احتضان كتل هلام العازلة في تحييد لمدة 30 دقيقة مع الإثارة لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- قطع غشاء النايلون لحجم الدقيق للهلام (ق). قطع نيك في أعلى الزاوية اليمنى للمساعدة في توجيه الغشاء في الخطوات المستقبلية.
ملاحظة: كتلتان هلام (6 عينات) يمكن تصور على غشاء واحد. - صب ما يكفي من 10X SSC في آرعبد المنعم يوسف بحيث لا تجف بين عشية وضحاها. إنشاء منصة حوالي 5 سم فوق مستوى المخزن المؤقت. تشبع 3 ورقة اللوني 3MM مع 10x SSC ومكان على المنصة. قطع ورقة اللوني بحيث تكون طويلة بما فيه الكفاية لتكون مغمورة في المخزن عند كلا الطرفين واسعة بما يكفي لتناسب هلام غشاء جرا.
- وضع الجل (ق) على رأس ورقة اللوني المشبعة. تأطير هلام مع غلاف بلاستيكي لمنع العازلة-اجتياز جل أثناء النقل. وضع بعناية الغشاء قطع على رأس هلام (ق). إزالة فقاعات الهواء بين الغشاء وهلام من قبل المتداول زجاجة أو ماصة المصلية بلطف عبر الغشاء.
- قطع ثلاثة ورقة اللوني 3MM إلى نفس حجم الغشاء. تشبع ورقة ورقة اللوني مع 10x SSC ووضع على رأس الغشاء. إزالة أي فقاعات الهواء التي شكلت.
- كومة المناشف الورقية لا يقل عن 5 سم ارتفاع فوق ورقة نشاف تليها دعم قوي (APPROالوزن ximate من 1 كجم للغشاء 23 × 16 سم). السماح بنقل بالمضي قدما بين عشية وضحاها.
- فضح غشاء (DNA جانب متابعة) إلى 1200 J / م 2 من الأشعة فوق البنفسجية إلى تشعبي الحمض النووي للغشاء. لا شطف قبل هذه الخطوة.
- شطف الغشاء تماما في SSC 2X لمنع خلفية عالية على الصور وصمة عار. استخدام وصمة عار على الفور لتهجين (انظر 5.3) أو جففه في RT، والتفاف في غلاف بلاستيكي وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- تهجين
- فرن التهجين سخن والزجاجات إلى 55 درجة مئوية.
- إضافة 100 ميكروغرام مل -1 زلال المصل البقري (BSA) و 10 ميكروغرام مل -1 الحمض النووي غير محددة (مثل سمك السلمون الحمض النووي الحيوانات المنوية) إلى المخزن المؤقت التهجين استعد مسبقا.
- للسماح حتى تغطية العازلة التهجين عندما يتم إرجاع غشاء يصل، وضع وصمة عار على مربع الحجم المماثل من شبكة النايلون مع الجانب محدد الحمض النووي للغشاء متجهة لأعلى. لفة وصمة عار على طول حافة طويلة. الانزلاقوصمة عار / شبكة داخل زجاجة التهجين. إضافة كمية مناسبة من العازلة التهجين قبل ساخنة في انبسط وصمة عار (على سبيل المثال 30 مل لمدة 23 × 16 سم 2 غشاء).
- احتضان في الفرن الساخن مسبقا، تدوير زجاجات، لمدة 1 ساعة.
- إعداد التحقيق عن طريق خلط 50 نانوغرام من المنقى مثلي المنتج PCR إلى المنطقة من الفائدة، 150 نانوغرام من الاشعال مسدوس عشوائية، عازلة للKlenow جزء وH 2 O لجعل حجم 13 ميكرولتر. يغلي لمدة 3 دقائق ثم وضع على الفور على الجليد. إضافة 1 ميكرولتر من 1 مزيج ملي dCTP / dGTP / dTTP، 1 ميكرولتر من Klenow جزء (5U) و 50 μCi deoxyadenosine رديولبلد 5'-ثلاثي على الفوسفات ألفا (α 32 P-dATP).
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. إضافة 1 ميكرولتر من 1 مزيج ملي dNTP و 1 ميكرولتر من Klenow شظية. احتضان 20 دقيقة في RT.
- تغلي التحقيق لمدة 5 دقائق وعلى الفور إضافة إلى أنابيب التهجين. هجن بين عشية وضحاها في 55 درجة مئوية، مع دوران.
- صب العلاقات العامةوسام الإمبراطورية البريطانية من الغشاء.
ملاحظة: وهذا التحقيق هو قادرة على إعادة استخدامها مرة واحدة. - شطف الغشاء لفترة وجيزة في درجة حرارة ما قبل، وانخفاض صرامة غسل العازلة (2X SSC، 0.1٪ (ث / ت) SDS). منخفضة إضافة إلى غسل العازلة صرامة الطازجة واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 55 مئوية مع دوران. كرر.
- يغسل مرتين في غسل العازلة التشدد المتوسطة (1X SSC، 0.1٪ (ث / ت) SDS) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 55 مئوية مع دوران.
- يغسل مرتين في ارتفاع غسل العازلة صرامة (SSC 0.1X، 0.1٪ (ث / ت) SDS) لمدة 5 دقائق عند 55 درجة مئوية مع التناوب.
- إزالة الغشاء والداب مع الأنسجة لإزالة السائل الزائد. التفاف في غلاف بلاستيكي ضمان عدم وجود الرطوبة المتبقية على غلاف بلاستيكي ووضعه في شريط التعرض مع ما قبل مموها شاشة تخزين الفوسفور. إغلاق الكاسيت وفضح لا يقل عن 2 ساعة قبل التصور باستخدام جهاز تصوير الفوسفور.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وFROS هو، كتلة البروتين النووي في مواقع محددة محرض تمكن سيطة النسخ إلى أن تصور في الخلايا الحية 12،18. ويتضح تصميم تجريبي العام لأخذ عينات الخلايا في الشكل 1، وتوقيت أخذ العينات والاختلافات في الخلفية الوراثية جعل هذا النظام تنوعا لدراسة إصلاح مثل هذه الكتلة. يوضح التخطيطي كيف درجة الحرارة حساسة المسوخ، مثل نهاية الخبر dnaB والخبر dnaC التي استخدمت سابقا 18، يمكن أن تستخدم في هذا النظام.
...الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أثناء ازدواجية الكروموسوم ، ستواجه آلية النسخ المتماثل عوائق مختلفة تمنع تقدمها. لضمان تكرار الكروموسوم أحادي الأصل بالكامل ، تمتلك البكتيريا العديد من المسارات لإصلاح الحمض النووي الذي يتيح بعد ذلك إعادة تحميل الريبليسوم20،21. يمكن التعامل مع الآفات والفواصل المفردة التي تقطعت بها السبل والفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل والبروتينات المرتبطة بإحكام بالحمض النووي باستخدام مسار مخصص ، على الرغم من أنه من المحتمل أن يكون هناك تداخل كبير في هذه المسارات. العائق الأكثر شيوعا أمام الردود في الخلايا الحية هو كتل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأسترالي [DP11010246].
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| التربتون | سيجما ألدريتش | 16922 | مكون وسائط النمو |
| كلوريد الصوديوم | VWR | 27810.364 | مكون وسائط النمو |
| مستخلص الخميرة | سيجما ألدريتش | 92144 | مكون وسائط النمو |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة | سيجما ألدريتش | P9791 | مكون وسائط النمو ؛ مكون عازلة للبوتاسيوم |
| فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة | سيجما-ألدريتش | P3786 | مكون وسائط النمو ؛ مكون عازلة البوتاسيوم |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | لتحريض إنتاج TetR-YFP |
| Anhydrotetracycline هيدروكلوريد | Sigma-Aldrich | 37919 | إطلاق النسخ المتماثل bloackage |
| Axioskop 2 مجهر فلوران | Zeiss | 452310 | تصور الخلايا |
| مجموعة مرشحات eYFP | تقنية Chroma | 41028 | تصور كاميرا YFP |
| CCD | Hamamatsu | Orca-AG | تصور الخلايا |
| MetaMorph ؛ البرمجيات (الأجهزة الجزيئية) | SDR Scientific | 31282 | الإصدار 7.8.0.0 المستخدمة في إعداد هذه المخطوطة |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | لمقابس الاغاروز والرحلان الكهربائي للهلام |
| طارد الماء الزجاجي الأصلي (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | لتصنيع سدادات الاغاروز |
| TRIS | VWR | VWRC103157P | TE ، مكون |
| عازلة TBEحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M محلول ملح ثنائي الصوديوم EDTA المعدل إلى درجة الحموضة 8.0 مع هيدروكسيد الصوديوم. |
| أزيد الصوديوم | سيجما ألدريتش | S2002 | عامل مضاد للجراثيم |
| حمض الهيدروكلوريك | سيجما ألدريتش | 258148 | مكون عازلة TE |
| ديوكسيكولات الصوديوم | سيجما ألدريتش | D6750 | مكون عازلة تحلل الخلية |
| N-Lauroylsarcosine ملح الصوديوم (ساركوسيل) | Sigma-Aldrich | L5125 | تحلل الخلية ومكون ESP العازلة |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | مكون عازلة تحلل الخلية |
| Lysozyme | Amresco | 6300 | مكون عازلة تحلل الخلية |
| Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP مكون عازلة |
| للخلية الفرعية نموذج 192 خلية | BioRad | 1704507 | نظام الرحلان الكهربائي |
| للأشعة فوق البنفسجية transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | تصور الحمض النووي |
| يمكن أيضا استخدام 1610433 Ethidium Bromide | BioRad | تصور حمض البوريك الحمض النووي | |
| VWR | PROL20185.360 | مكون TBE | |
| Hybond-XL النايلون memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) |
| ورق كروماتوغرافيا واتمان | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | النشاف الجنوبي |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01 / 02 | تشابك الحمض النووي والتهجين |
| حمض الديوكسي ريبونوكلييك من المنوية السلمون | Sigma-Aldrich | 31149 | مكون عازلة التهجين |
| هيدروكسيد الصوديوم | Sigma-Aldrich | S5881 | مكون عازلة التمسخ |
| ثلاثي سترات الصوديوم ثنائي هيدرات | VWR | PROL27833.363 | عازلة نقل |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) | Amresco | 227 | مكون عازلة للغسيل |
| ألبومين مصل الأبقار | Sigma-Aldrich | A7906 | مكون عازلة التهجين |
| بادئات Hexamer Random | Bioline | BIO-38028 | |
| جزء Klenow | New England BioLabs | M0212L | |
| dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
| Adenosine 5'-triphosphate-< sup>32< / sup> P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
| تخزين شاشة الفوسفور | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E قياسي متعدد الأغراض شاشة 35 سم × 43 سم |
| تايفون FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | تصور زجاجة التهجين |
| UVP | 07-0194-02 | 35 مم × 300 مم |
المراجع
- Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
- Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).
- McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).
- Tanner, N. A., et al. Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).
- Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli. Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).
- Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli. Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).
- Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal. Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).
- Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves. Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).
- Lau, I. F., et al. Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).
- Gordon, G. S., et al. Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).
- Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo. EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).
- Payne, B. T., et al. Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51 (3), 463-471 (1987).
- Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli. Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).
- Mettrick, K. A., Grainge, I. Stability of blocked replication forks in vivo. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Church, G. M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).
- Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. Multiple pathways process stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).
- Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).
- Carl, P. L. Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA. Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).
- Nawotka, K. A., Huberman, J. A. Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons. Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).
- Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control. J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
