Method Article

الأمر الذي أدى إلى انسداد النسخ المتماثل الموقع المحدد في E. القولونية استخدام نظام نيون كاظمة المشغل

DOI:

10.3791/54434

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف هنا نظاما يستخدم كتلة بروتين خاصة بالموقع وقابلة للانعكاس في الجسم الحي لإيقاف وطي شوكات النسخ المتماثل في الإشريكية القولونية. يتم تقييم إنشاء كتلة النسخ المتماثل عن طريق المجهر الفلوري ويتم استخدام الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز ثنائي الأبعاد المحايد المحايد لتصور المواد الوسيطة للنسخ المتماثل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العقبات موجودة على الحمض النووي، بما في ذلك البروتينات بإحكام والآفات المختلفة، يمكن أن تمنع بشدة تطور ماكينات النسخ المتماثل الخلية. وتوقف لجسيم مكرر يمكن أن يؤدي إلى التفكك لها من كروموسوم، سواء في جزء أو مجملها، مما أدى إلى انهيار شوكة النسخ المتماثل. الشفاء من هذا الانهيار هو ضرورة للخلية لبدقة كاملة ازدواج الكروموسومات وتقسيم وقت لاحق. آليات متنوعة لذلك، عند حدوث الانهيار، الخلية تطورت التي تجري لاستعادة شوكة الحمض النووي والسماح النسخ المتماثل إلى أن تكتمل مع الدقة العالية. سابقا، وقد تم دراسة هذه المسارات إصلاح تكرارها في البكتيريا باستخدام أضرار الأشعة فوق البنفسجية، والتي لديها عيب عدم المترجمة إلى موقع معروف. توضح هذه المخطوطة على نظام يستخدم نظام الإسفار كاظمة المشغل (FROS) لإنشاء كتلة البروتين في مواقع محددة يمكن أن تحفز المماطلة وانهيار تكرار FOركس في القولونية. البروتوكولات بالتفصيل كيفية وضع النسخ المتماثل يمكن تصور في الخلايا الحية واحدة باستخدام المجهر مضان وتكرار الحمض النووي وسيطة يمكن تحليلها من قبل 2-الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز. ويمكن إدراج درجة الحرارة المسوخ الحساسة من مكونات جسيم مكرر (على سبيل المثال DnaBts) في النظام للحث على انهيار متزامن من تكرار الشوك. وعلاوة على ذلك، فإن الأدوار من البروتينات إعادة التركيب وhelicases التي تشارك في هذه العمليات يمكن دراستها باستخدام بالضربة القاضية الجينية داخل هذا النظام.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال تكرار الحمض النووي، وجسيم مكرر يواجه عقبات على الحمض النووي التي تعيق تقدمه. الحمض النووي من التلف بما في ذلك الآفات والثغرات فضلا عن الهياكل الشاذة يمكن أن تمنع جسيم مكرر من المضي 1. في الآونة الأخيرة، فقد وجد أن البروتينات منضمة إلى الحمض النووي هي المصدر الأكثر شيوعا للإعاقة على النسخ المتماثل تطور شوكة 2. معرفة الأحداث التي أعقبت لقاء للجسيم مكرر مع كتلة البروتين النووي قد سبق محدودة بسبب عدم القدرة على إحداث مثل كتلة في الكروموسوم من خلية حية في مكان معروف. في المختبر تحليل عززت فهمنا للسلوك الحركي من جسيم مكرر نشطة عندما تجتمع انسداد البروتين النووي 3، فضلا عن تفاصيل الآلية ل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. حجب النسخ المتماثل مع FROS

  1. تحريض انسداد النسخ المتماثل
    1. تمييع ثقافة بين عشية وضحاها جديدة من E. كولاي سلالة تحمل مجموعة وتيتو وpKM1 18 إلى OD ل 600Nm = 0.01 في المتوسط ​​تمييع المعقدة (0.1٪ تريبتون، 0.05٪ مستخلص الخميرة، 0.1٪ كلوريد الصوديوم، 0.17 M KH 2 PO 4، 0.72 MK 2 هبو 4) مع المضادات الحيوية كما هو مطلوب للاختيار.
      ملاحظة: لا تقم بإضافة التتراسيكلين لاختيار ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وFROS هو، كتلة البروتين النووي في مواقع محددة محرض تمكن سيطة النسخ إلى أن تصور في الخلايا الحية 12،18. ويتضح تصميم تجريبي العام لأخذ عينات الخلايا في الشكل 1، وتوقيت أخذ العينات والاختلافات في الخلفية الوراثية جعل هذا النظام تنوعا لدراسة إصلاح مثل هذه الكتلة. يوضح التخطيطي كيف درجة الحرارة حساسة المسوخ، مثل نهاية الخبر dnaB والخبر dnaC التي استخدمت سابقا 18، يمكن أن تستخدم في هذا النظام.

.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء ازدواجية الكروموسوم ، ستواجه آلية النسخ المتماثل عوائق مختلفة تمنع تقدمها. لضمان تكرار الكروموسوم أحادي الأصل بالكامل ، تمتلك البكتيريا العديد من المسارات لإصلاح الحمض النووي الذي يتيح بعد ذلك إعادة تحميل الريبليسوم20،21. يمكن التعامل مع الآفات والفواصل المفردة التي تقطعت بها السبل والفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل والبروتينات المرتبطة بإحكام بالحمض النووي باستخدام مسار مخصص ، على الرغم من أنه من المحتمل أن يكون هناك تداخل كبير في هذه المسارات. العائق الأكثر شيوعا أمام الردود في الخلايا الحية هو كتل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأسترالي [DP11010246].

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
التربتونسيجما ألدريتش16922مكون وسائط النمو
كلوريد الصوديومVWR27810.364مكون وسائط النمو
مستخلص الخميرةسيجما ألدريتش92144مكون وسائط النمو
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجما ألدريتشP9791مكون وسائط النمو ؛ مكون عازلة للبوتاسيوم
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةسيجما-ألدريتشP3786مكون وسائط النمو ؛ مكون عازلة البوتاسيوم
L-ArabinoseSigma-AldrichA3256لتحريض إنتاج TetR-YFP
Anhydrotetracycline هيدروكلوريدSigma-Aldrich37919إطلاق النسخ المتماثل bloackage
Axioskop 2 مجهر فلورانZeiss452310تصور الخلايا
مجموعة مرشحات eYFPتقنية Chroma41028تصور كاميرا YFP
CCDHamamatsuOrca-AGتصور الخلايا
MetaMorph   ؛ البرمجيات (الأجهزة الجزيئية)SDR Scientific31282الإصدار 7.8.0.0 المستخدمة في إعداد هذه المخطوطة
AgaroseBiolineBIO-41025لمقابس الاغاروز والرحلان الكهربائي للهلام
طارد الماء الزجاجي الأصلي (Rain-X)AutobarnDIO1470لتصنيع سدادات الاغاروز
TRISVWRVWRC103157PTE ، مكون
عازلة TBEحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكAjax FinechemAJA1800.5 M محلول ملح ثنائي الصوديوم EDTA المعدل إلى درجة الحموضة 8.0 مع هيدروكسيد الصوديوم.
أزيد الصوديومسيجما ألدريتشS2002عامل مضاد للجراثيم
حمض الهيدروكلوريكسيجما ألدريتش258148مكون عازلة TE
ديوكسيكولات الصوديومسيجما ألدريتشD6750مكون عازلة تحلل الخلية
N-Lauroylsarcosine ملح الصوديوم (ساركوسيل)Sigma-AldrichL5125تحلل الخلية ومكون ESP العازلة
Rnase ASigma-AldrichR6513مكون عازلة تحلل الخلية
LysozymeAmresco6300مكون عازلة تحلل الخلية
Proteinase KAmrescoAM0706ESP مكون عازلة
للخلية الفرعية نموذج 192 خليةBioRad1704507نظام الرحلان الكهربائي
للأشعة فوق البنفسجية transilluminator 2000BioRad1708110تصور الحمض النووي
يمكن أيضا استخدام 1610433 Ethidium BromideBioRadتصور حمض البوريك الحمض النووي
VWRPROL20185.360مكون TBE
Hybond-XL النايلون memrbaneAmershamRPN203SZeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159)
ورق كروماتوغرافيا واتمانGE Healthcare Life Sciences3030690النشاف الجنوبي
HL-2000 HybrilinkerUVP95-0031-01 / 02تشابك الحمض النووي والتهجين
حمض الديوكسي ريبونوكلييك من المنوية السلمونSigma-Aldrich31149مكون عازلة التهجين
هيدروكسيد الصوديومSigma-AldrichS5881مكون عازلة التمسخ
ثلاثي سترات الصوديوم ثنائي هيدراتVWRPROL27833.363عازلة نقل
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)Amresco227مكون عازلة للغسيل
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA7906مكون عازلة التهجين
بادئات Hexamer RandomBiolineBIO-38028
جزء KlenowNew England BioLabsM0212L
dNTP SetBiolineBIO-39025
Adenosine 5'-triphosphate-< sup>32< / sup> P-ATPPerkinElmerBLU502A
تخزين شاشة الفوسفورGE Healthcare Life SciencesGEHE28-9564-76BAS-IP MS 3543 E قياسي متعدد الأغراض شاشة 35 سم × 43 سم
تايفون FLA 7000GE Healthcare Life Sciences28-9558-09تصور زجاجة التهجين
UVP07-0194-0235 مم × 300 مم
3MM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
  2. Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Repressor Operator SystemSite Specific Replication BlockageEscherichia coli Replication ForkFluorescence Microscopy VisualizationTwo Dimensional Gel ElectrophoresisTemperature Sensitive MutantsGenetic Knockout AnalysisDNA Replication IntermediatesAgarose Plug PreparationSouthern Hybridization Detection

Related Articles