بروتوكول للاستفادة بولي (N--iso propylacrylamide) (PIPAAm) ميكروفلتر المغلفة لالتقاط فعالة وإطلاق thermoresponsive من قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية (CTC) وتقدم. هذا الأسلوب يسمح القبض على رابع كلوريد الكربون من الدم المرضى والإفراج لاحقا من لجنة مكافحة الإرهاب قابلة للثقافة المصب خارج رقاقة وتحليل وتوصيف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
القبض على وإطلاق قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية من الدم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ونحن لشرح طريقة لالتقاط أساس حجم قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية (CTC) من الدم الكامل، جنبا إلى جنب مع الافراج عن هذه الخلايا من رقاقة لتحليل و / أو ثقافة المصب. وتوظف استراتيجية استخدام رواية Parylene C فتحة غشاء المسام ميكروفلتر للقبض على لجنة مكافحة الإرهاب وطلاء بولي (N--iso propylacrylamide) (PIPAAm) لthermoresponsive الإفراج قابلة للحياة من لجنة مكافحة الإرهاب التي تم التقاطها. يتم تمكين القبض على الخلايا الحية من خلال الاستفادة من تصميم هندسة فتحة المسام مع أبعاد محددة للحد من إجهاد القص التي ترتبط عادة مع عملية الترشيح. في حين أن ميكروفلتر يسلك كفاءة التقاط عالية، وإطلاق سراح من هذه الخلايا غير تافهة. عادة، يتم الافراج سوى نسبة صغيرة من الخلايا عندما يتم استخدام تقنيات مثل التدفق العكسي أو كشط الخلايا. التصاق قوي من هذه الخلايا السرطانية الظهارية للغشاء Parylene C يعزى إلى تفاعل كهرباء غير محددة. لمواجهة الهو الواقع، قمنا بتوظيف استخدام PIPAAm الطلاء واستغلال خصائصه استجابة الحرارية بينية للافراج عن الخلايا من مرشح. يتم تصفية الدم لأول مرة في درجة حرارة الغرفة. أقل من 32 درجة مئوية، PIPAAm هو ماء. بعد ذلك، يتم وضع فلتر في أي من وسائل الإعلام ثقافة أو منطقة عازلة الحفاظ على 37 درجة مئوية، مما يؤدي في PIPAAm تحول مسعور، وبالتالي الإفراج عن الخلايا المربوطة كهربية.
المقدمة
المرض المنتشر هو المسؤول عن معظم وفيات السرطان. تطوير النذير ورفيق العلامات البيولوجية لتشخيص ورم خبيث أمر بالغ الأهمية في إدارة مرض السرطان وعلاجه. تعميم الخلايا السرطانية (CTC) تلعب دورا رئيسيا في نشر الورم والانبثاث. وعلاوة على ذلك، التي يمكن الوصول إليها بسهولة ك "السائل خزعة" العلامات البيولوجية، لجنة مكافحة الإرهاب في مرضى السرطان الدم المحيطي قد ارتفع ك "معقل" لأبحاث السرطان العلامات البيولوجية. لجنة مكافحة الإرهاب تم التحقق من صحتها فضلا عن العلامات البيولوجية النذير في إعدادات السرطان المختلفة، بما في ذلك الثدي والبروستات وسرطان القولون والمستقيم 1-3. ومع ذلك، التطورات الحديثة في مجال م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
الأخلاق بيان: لحماية حقوق الرعايا الإنسان، وقد تم الحصول على عينات دم بعد الموافقة المسبقة تحت البروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة ميامي مجالس المراجعة المؤسسية تحت IRB 20150020.
ملاحظة: الدم لتتم تصفيته لالتقاط جنة مكافحة الإرهاب يجب أن تجمع في أنبوب EDTA لمنع تجلط الدم.
1. طلاء على ميكروفلتر مع بولي (N-ISO-propylacrylamide) (PIPAAm)
- تزن خارج PIPAAm لإعداد 10٪ ث / الحل الخامس في بيوتانول. مزيج باستخدام الدوامة حتى حل واضح.
- المجهر قطع ب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عن طريق الدم المتبرعين الأصحاء "(تم الحصول عليها بموجب بروتوكول المعتمدة من قبل جامعة ميامي IRB 20150020 بعد الموافقة المسبقة) ارتفعت مع الخلايا السرطانية مثقف، وتقنية thermoresponsive من أجل إطلاق سراح قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية (CTC)، القبض على تحقيقه، وإطلاق سراح وكفاءة استرجاع من 94٪ ± 9٪، 82٪ ± 5٪ و 77٪ ± 5٪ على التوالي (الجدول 1) 15. وعلى سبيل المقارنة، فإن إطلاق واسترجاع كفاءة المرشحات غير المصقول ب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
عملية التقاط قابلة للحياة رابع كلوريد الكربون من الدم الكامل والإفراج عنهم من ميكروفلتر هي بسيطة نسبيا. لكن بعض النقاط الهامة التي تستحق الذكر. ومن الضروري، كما هو الحال مع كل ثقافة الخلية التي حافظت على حالة معقمة من خلال العملية برمتها. الخطوة الأولى من طلاء فلتر مع PIPAAm أمر بالغ الأهمية، لأنه يقوم على أساس تقنية الافراج عن الخلايا من مرشح على استغلال حرارة خصائص بينية استجابة PIPAAm ل. لضمان تم المغلفة مرشح على نحو فعال، وقياس حجم المسام (عرض وطول المسام فتحة) على مرشح تحت ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تمت حماية جزء من هذا العمل بموجب طلب براءة الاختراع المؤقت للولايات المتحدة رقم 62/219،808. Siddarth Rawal هي مساهم في شركة Circulogix Inc. التي تنتج تجاريا المرشحات وأشرطة / خراطيش المرشح المستخدمة في هذه المقالة.
شكر وتقدير
نشكر جميع المرضى الذين تبرعوا بعينات دم لدعم هذا العمل. نشكر الدكتورين Guiseppe Giaconne و Ritesh Parajuli و Marc E. Lippman على مساعدتهم في الحصول على العينات السريرية ، والدكتورة كارمن غوميز ، ورالف لاندجراف ، وستيفان زوشنر ، وتومي جيتوش ، وديانا لوبيز على مناقشاتهم الثاقبة. يشكر Zheng Ao الدعم الجزئي والمساعدة من برنامج شيلا وديفيد فوينتي للدراسات العليا في بيولوجيا السرطان ، مركز سيلفستر الشامل للسرطان.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
فتحة شرائح
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مرشح | Circulogix Inc. | MSF-01 | مرشحات مختلفة الحجم متاحة لترشيح CTC من الدم أو البول (www.circulogixinc.com) |
| بولي (N< em>-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | شركة Ploysciences Inc. | 21458 | غير خطرة. تخزينها في درجة حرارة الغرفة. |
| 1-بوتانول | سيجما ألدريتش | B7906 | استخدم في منطقة جيدة التهوية |
| مجهر بلاستيكي كول | بارمر | 48510-30 | يمكن استخدام أي شرائح بلاستيكية أو بدلا من ذلك أي نوع من المربعات (معدن ، أكريليك ، إلخ) إذا كان سيتم استخدام بالة لعقد مرشح 8 مم × 8 مم مربع |
| Spin Coater | أنظمة الطلاء المتخصصة | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide هو الاسم العام ل Kapton Tape الذي يمكن شراؤه من بائعين متعددين (Amazon ، Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| أطباق فالكون بتري 35 × 10 مم | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | catridges المخصصة متوفرة على أساس ترشيح CTC من الدم أو البول ؛ |
| حقنة 20 مل | BD Scientific | 302830 | |
| مضخة حقنة | دينار كويتي علمي | 78-0100 فولت | يمكن استخدام أي مضخة حقنة قادرة على حمل حقنة سعة 25 مل |
| أنبوب الطرد المركزي سيلستار 50 مل | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | يمكن استخدام أي علامة تجارية ، طالما أن السطح متوافق مع إزالة الخلايا وليس طارد |
| خلايا SKBR3 | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | أي اختبار يمكن أن يوفر تحليلا معقولا لتقييم الخلايا الحية سيعمل |
| حاضنة زراعة الخلايا | VWR | 98000-368 | أي حاضنة يمكن استخدامها لزراعة الخلايا ستكون كافية |
المراجع
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- de Bono, J. S., Scher, H. I., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
