القبض على وإطلاق قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية من الدم

المرض المنتشر هو المسؤول عن معظم وفيات السرطان. تطوير النذير ورفيق العلامات البيولوجية لتشخيص ورم خبيث أمر بالغ الأهمية في إدارة مرض السرطان وعلاجه. تعميم الخلايا السرطانية (CTC) تلعب دورا رئيسيا في نشر الورم والانبثاث. وعلاوة على ذلك، التي يمكن الوصول إليها بسهولة ك "السائل خزعة" العلامات البيولوجية، لجنة مكافحة الإرهاب في مرضى السرطان الدم المحيطي قد ارتفع ك "معقل" لأبحاث السرطان العلامات البيولوجية. لجنة مكافحة الإرهاب تم التحقق من صحتها فضلا عن العلامات البيولوجية النذير في إعدادات السرطان المختلفة، بما في ذلك الثدي والبروستات وسرطان القولون والمستقيم ^1-3. ومع ذلك، التطورات الحديثة في مجال مكافحة الإرهاب وأشارت إلى أن مجرد تعداد هذه الخلايا النادرة محدودة فائدة سريرية، كما هو مبين في التجارب السريرية التدخلية ^4. وبالتالي، هناك حاجة الناشئة عن التقنيات التي تسمح للالتوصيف الجزيئي وظيفي لجنة مكافحة الإرهاب. حاليا، قليل من التكنولوجيات فقط توجد تسمح FOص غير مستضد منحازة، القبض قابلة للحياة، والإفراج عن لجنة مكافحة الإرهاب، تمكن قوي المصب الجزيئية والوظيفية ^5،6 التحليل. تقترن معظم هذه الأجهزة microfabricated إلى منصات ميكروفلويديك وبالتالي يكون عاملا يحد من كمية الدم التي يمكن معالجتها، والتي تتراوح 2-4 مل ^7-10. لجنة مكافحة الإرهاب هي الأحداث النادرة في أنبوب واحد من سحب الدم (7.5 مل)، وبالتالي الحد من زيادة كمية الدم التي يمكن معالجتها، يعيق كثيرا من فرص التقاط وعزل هذه الخلايا من الفائدة.

لقد قمنا بتطوير نوعين من الأجهزة غشاء ميكروفلتر Parylene C للقبض على لجنة مكافحة الإرهاب التي تستغل حجم الخلافات بين خلايا الورم أكبر وأصغر خلايا الدم العادية ^11،12. لقد ذكرت سابقا في جولة التصفية المسام التعداد ومقارنة ذلك مع منصة وافقت ادارة الاغذية والعقاقير، حيث أظهرت ميكروفلتر لتكون متفوقة في لجنة مكافحة الإرهاب كفاءة التقاطلعينات سرطان الدم المريض ^13،14. ومع ذلك، وجود قيود على مرشح الجولة هو ضرورة لاستخدام مثبت القائم على الفورمالديهايد قبل الترشيح. هذه العملية تحافظ على مورفولوجيا الخلايا مع السماح لهم لتحمل إجهاد القص والضغط أثناء عملية الترشيح. بينما التعداد والدراسات الجزيئية يمكن أن يؤديها على رقاقة ^13، تثبيتي يضعف القدرة على أداء توصيف وظيفي. لمعالجة هذا القيد، وضعنا المسام مرشح الفتحة التي ينفي ضرورة إصلاح الخلايا السابقة للترشيح (الشكل 1). هندسة فتحة المسام (6 ميكرومتر عرض × 40 ميكرون فتحة طول المسام) تسمح للخلايا الورم ليتم القبض على حين تسد جزئيا فقط المسام، وبالتالي لا يزال السماح بالمرور الحر للخلايا الدم الأخرى والتخفيف من ارتفاع في الضغط من شأنه أن يؤدي إلى تلف الخلايا وانفجار في نهاية المطاف ^15،16 يتكون خرطوشة فتحة المسام من 2 قطعة الاكريليك التي شطيرةمرشح فتحة المسام بين قطعة أعلى وأسفل مع ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) بصفتها طوقا لتوفير مانعة للتسرب ختم ^14،15 (الشكل 1).

في حين أن الكفاءة القبض على مرشح فتحة المسام عالية، لا بد (الجدول 1)، لجنة مكافحة الإرهاب القبض على الغشاء Parylene C بواسطة تفاعلات قوية غير محددة كهرباء بدلا من المصفوفة خارج الخلية (ECM) بوساطة الالتصاق ^15. أساليب مثل التدفق العكسي أو استخدام كاشطات خلية تفشل في إطلاق سراح نحو فعال الخلايا من مرشح، أو تؤدي إلى تلف الخلايا وموت الخلايا. بحثنا الاستخدام غير تقليدية من PIPAAm إلى صياغة استراتيجية الافراج عن ^15. PIPAAm هو بوليمر أن يخضع لعكسها أقل حرجة درجة حرارة المحلول (LCST) المرحلة الانتقالية في درجة حرارة المحلول من 32 درجة مئوية ^(17). تقليديا، وقد تم اكتشاف نطاق واسع هذا العقار من PIPAAm لتطبيقات هندسة الأنسجة. عادة، الخلاياالسطوح مثقف على PIPAAm المغلفة عند 37 درجة مئوية عندما PIPAAm هو مسعور. ويمكن بعد ذلك الخلايا يمكن فصل كورقة عندما يتم إزاحة درجة حرارة الثقافة إلى أقل من 32 درجة مئوية، حيث يصبح سطح PIPAAm المغلفة رطب ^17،18. نحن استغلال هذه الخاصية الحرارية عن طريق إجراء عملية الترشيح في درجة حرارة الغرفة (أقل من 32 درجة مئوية)، ومن ثم تمكينه الافراج عن خلية عن طريق وضع مرشح في وسائل الإعلام ثقافة الحفاظ على 37 درجة مئوية. عند هذه الدرجة، وطبقة البوليمر PIPAAm يصبح مسعور، وبالتالي الإفراج عن خلايا ملزمة كهربية ¹⁵ (الشكل 1).

على الرغم من أن طريقة استجابة درجة الحرارة فضلا عن أساليب أخرى تم تنفيذها بنجاح لتحقيق القبض على رابع كلوريد الكربون قابلة للحياة والافراج ^19-21، عيب واحد محتمل رئيسي تتقاسمها هذه التكنولوجيات المبلغ هو أنهم جميعا في توظيف مبدأ تعتمد على مستضد لالتقاط جنة مكافحة الإرهاب. مستضد مقرها القبض على رابع كلوريد الكربون، ص كما هو مبينreviously، قد يؤدي إلى منحاز لجنة مكافحة الإرهاب تحليل ^11،14. على سبيل المثال، العديد من التكنولوجيات القائمة على تقارب تستخدم الأجسام المضادة التي تربط EpCAM لالتقاط جنة مكافحة الإرهاب. ومع ذلك، فقد ثبت أن لجنة مكافحة الإرهاب في التعبير عن مستويات مختلفة من EpCAM، مما يؤدي إلى إغفال EpCAM منخفضة وEpCAM السلبية لجنة مكافحة الإرهاب من خلال هذه التقنيات. أيضا، قد يحدث القيود عند لجنة مكافحة الإرهاب من أصل غير الظهارية هو من مصلحة، مثل لجنة مكافحة الإرهاب في إعدادات سرطان الجلد وساركوما. وهكذا، فإن التكنولوجيا التي تسمح لالتقاط CTC قابلة للحياة والإفراج، دون التحيز المحتمل الذي عرضته التقاط مستضد أساس مرغوب فيه للغاية.

الأهم من ذلك، هو حجم جهاز الالتقاط ميكروفلتر بحتة على أساس واستراتيجية الإصدار هو الملحد إلى وجود بعض علامات سطح. ونحن نعتقد أن العمل من ميكروفلتر المغلفة PIPAAm سيساعد على توسيع فهمنا للعملية المتنقل، من خلال توفير القدرة على التقاط الصور والافراج عن لجنة مكافحة الإرهاب لتحليل المصب بفعالية وكفاءة. وهذا قد قويةially كشف الجزيئات الجديدة التي قد تكون موجهة رواية المستهدفة العلاجات الشاملة فضلا عن توفير العلامات البيولوجية التي يمكن رصدها بسهولة والمساعدة في سرطان التعامل مع المرضى.

الأخلاق بيان: لحماية حقوق الرعايا الإنسان، وقد تم الحصول على عينات دم بعد الموافقة المسبقة تحت البروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة ميامي مجالس المراجعة المؤسسية تحت IRB 20150020.
ملاحظة: الدم لتتم تصفيته لالتقاط جنة مكافحة الإرهاب يجب أن تجمع في أنبوب EDTA لمنع تجلط الدم.

1. طلاء على ميكروفلتر مع بولي (N-ISO-propylacrylamide) (PIPAAm)

1. تزن خارج PIPAAm لإعداد 10٪ ث / الحل الخامس في بيوتانول. مزيج باستخدام الدوامة حتى حل واضح.
2. المجهر قطع بلاستيكية الشرائح إلى ما يقرب من 12 ملم × 12 ملم الساحات إما مع زوج من مقص أو شفرة حادة. بدلا من ذلك استخدام المقصلة.
   ملاحظة: هذه الساحات بمثابة حامل للمرشحات في أثناء عملية تدور طلاء.
3. باستخدام زوج حادة من مقص حافة مستقيمة، وقطع فتحة المسام ميكروفلتر يفر إلى 8 ملم × 8 ملم الساحات.
4. باستخدام شريط الفيلم بوليميد تأمين قطع المرشحات على squa البلاستيكالدقة قطع سابقا في الخطوة 1.3. تطبيق هذا الفيلم فقط إلى حافة وركن من مرشح بحيث لا يقل عن 7 مم X 7 ملم من ناحية التصفية يتنافى مع تغطيها الشريط.

يتم وضع توضيحات ممثل ميكروفلتر مجموعة المتابعة لPIPAAm طلاء 8 ملم × 8 ملم ميكروفلتر على 12 ملم × 12 ملم البلاستيك قطع مربعة من شريحة المجهر البلاستيكية: الرقم 2. ويستخدم الشريط بوليميد لتأمين ميكروفلتر في مكان تدور معطف PIPAAm.Reproduced بإذن من المرجع ^15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. وضع ميكروفلتر التي تم تأمينها في الساحة البلاستيك، على تشوك فراغ تدور المغطي.
6. البرنامج تدور المغطي لهذه الوصفة: ابدأ، 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية، 6000 صمساء لمدة 60 ثانية، و 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية، وإيقاف.
7. الاستغناء يكفي 10٪ ث / ت حل PIPAAm (المعد في 1.1) لتغطية كامل سطح ميكروفلتر باستخدام معيار نقل البلاستيك ماصة وبدء المغطي تدور.
8. إزالة ميكروفلتر PIPAAm المغلفة من زيادة ونقصان المغطي بعد الانتهاء من عملية الطلاء. ترك مرشح تعلق على الساحة البلاستيك أثناء التخزين.
   ملاحظة: يمكن تخزين التصفية المغلفة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 3 أشهر.

2. جمعية الترشيح كاسيت مع ميكروفلتر PIPAAm المغلفة

1. ترطيب PIPAAm ميكروفلتر المغلفة في درجة حرارة الغرفة عن طريق وضع ميكروفلتر لا يزال تأمين على الساحة البلاستيك في طبق بتري. إضافة برنامج تلفزيوني 1X حتى يتم غمر ميكروفلتر تماما واسمحوا الوقوف لمدة 5 دقائق.
2. بعد الخطوة الماء، والإفراج عن مرشح من الساحة البلاستيك عن طريق قطع شريط الفيلم بوليميد باستخدام زوج من مقص.
   ملاحظة: خذ علما أي جانب من مرشح لديهاطلاء PIPAAm.
3. تجميع ميكروفلتر إلى الكاسيت والترشيح، والتي يقحم ميكروفلتر بين العلوي والسفلي قطعة الاكريليك مع 2 ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) قطع بمثابه طوقا / الختم. المشبك كاسيت الاكريليك مع لقطات لتأمين مرشح وتوفير ختم ضيق.
   ملاحظة: طلاء PIPAAm يجب متجهة لأعلى، حتى يتم تصفية عينة من خلال، سوف يتم القبض على الخلايا على PIPAAm السطح المطلي للمرشح (الشكل 1).

3. الترشيح من عينة الدم مع التقاط والإفراج عن لجنة مكافحة الإرهاب من ميكروفلتر

1. حيث أن كل علامة تجارية ضخ حقنة لديه واجهة المستخدم الخاصة به، راجع دليل المستخدم للمضخة وبرنامج ضخ حقنة لتدفق بمعدل 75ML / ساعة وضبط مستوى الصوت إلى 20 مل.
2. الحارة 3 مل من وسائل الاعلام (متوفر تجاريا) ثقافة خلية مكوي إلى 37 درجة مئوية (من خلال إضافة 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين والستربتوميسين أعدت).
   
3. إضافة 7.5 مل من المتاحة تجاريا هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) إلى 7.5 مل من الدم عينة ونضح هذا الدم المخفف إلى حقنة 25 مل.
   ملاحظة: ضبط حجم HBSS بحيث يتم تخفيف عينة من الدم مع حجم مساو من 1: 1 مع HBSS على سبيل المثال إذا تم استخدام 10 مل من الدم، ثم تخلط مع حجم مساو من 10 مل HBSS لتحقيق 1: التخفيف 1.
4. إشراك كاسيت الترشيح مع حقنة وضعه على ضخ حقنة. وضع أنبوب 50 مل في أسفل لجمع التدفق من خلال وتبدأ المضخة.
   ملاحظة: الترشيح يجب أن تأخذ ما يقرب من 10- 12 دقيقة. وسيتم تنفيذ جميع الخطوات الترشيحفي درجة حرارة الغرفة العادية (20-25 درجة مئوية) بما في ذلك خطوة 3.8
5. بعد الترشيح اكتمال، فك الارتباط الترشيح كاسيت تدوين الملاحظات الجانب الذي هو أعلى الذي يحتوي على خلايا القبض على السطح المطلي PIPAAm. نضح 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة الحارة إلى حقنة جديدة.
6. إعادة إشراك كاسيت الترشيح مع حقنة تحتوي على وسائل الإعلام، ولكن في هذه المرة إشراك نهاية الجزء السفلي من الكاسيت بحيث PIPAAm المغلفة سطح مرشح يواجه بعيدا عن حقنة.
   ملاحظة: سوف يكون هذا الإفراج عن أي الخلايا التي قد تكون جزءا لا يتجزأ في المسام فتحة من خلال تطبيق التدفق العكسي لطيف.
7. وضع حقنة مرة أخرى على ضخ حقنة وعقد طبق بتري صغيرة أو لوحة 6 جيدا الحق تحت كاسيت الترشيح. ضبط معدل تدفق إلى 100 مل / ساعة وتبدأ المضخة.
8. تمرير جميع وسائل الإعلام من خلال تصفية وجمع من خلال تدفق في طبق بتري. انتظر جميع وسائل الإعلام لتمرير من خلال وثم توقف المضخة وإزالة حقنة لالثانية الترشيح كاسيت من المضخة.
9. فك الارتباط بين تلك كاسيت الترشيح من حقنة وفتحه لاسترداد مرشح من الكاسيت. وضع مرشح مع سطح PIPAAm لأسفل في نفس طبق بتري المستخدمة في جمع التدفق العكسي عند الافراج عن الخلايا من المسام. تضاف بقية وسائل الإعلام دافئة ووضع طبق بتري في حاضنة الثقافة وضعت في 37 درجة مئوية.
10. بعد 30 دقيقة سوف يتم الافراج عن الخلايا من مرشح. ومع ذلك، ترك مرشح في طبق بتري لمدة تصل إلى 24 ساعة لضمان جميع الخلايا فصل.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، فإن الخلايا صدر يمكن جمعها في أنبوب microcentrifuge لأداء المزيد من التحليل المصب مثل PCR، ELISA، ويسترن وصمة عار على سبيل المثال لا أمثلة قليلة.
11. بعد 24 ساعة في الثقافة، وإزالة بعناية ميكروفلتر باستخدام ملقط.
    ملاحظة: مرشح يمكن التخلص منها في هذا الوقت حيث تم الافراج عن الخلايا من ذلك.
12. ماصة بلطف مستنبت صعودا وهبوطا باستخدام 1000 & #181؛ ل ماصة، لاعادة تعليق الكريات الحمراء والطرفية خلية الدم وحيدات النوى (PBMC) أن يتم القبض على مرشح وأفرج عنه في لوحة مع لجنة مكافحة الإرهاب. تنفيذ هذا الإجراء بعناية وبلطف لتجنب فصل الخلايا السرطانية فضفاضة يعلق. إزالة بعناية المتوسط ​​بأكمله يحتوي على إعادة علقت كريات الدم الحمراء وPBMC مخلفا وراءه الخلايا المرفقة للسرطان والبديل مع متوسطة جديدة قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن يتكرر مرة واحدة إذا كريات الدم الحمراء المفرطة موجودة بعد غسل واحد.

4. قابلية تقييم لجنة مكافحة الإرهاب

1. تقييم لجنة مكافحة الإرهاب الجدوى مثقف باستخدام لايف / الفحص الميت ^8.
   والعديد من لايف / المقايسات الميت المتاحة تجاريا: ملاحظة. بعد بروتوكول الشركة المصنعة ينصح بشدة. يرجى الرجوع إلى قائمة المواد / الكواشف لعدة فحص التجارية المستخدمة لهذه التجربة.

عن طريق الدم المتبرعين الأصحاء "(تم الحصول عليها بموجب بروتوكول المعتمدة من قبل جامعة ميامي IRB 20150020 بعد الموافقة المسبقة) ارتفعت مع الخلايا السرطانية مثقف، وتقنية thermoresponsive من أجل إطلاق سراح قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية (CTC)، القبض على تحقيقه، وإطلاق سراح وكفاءة استرجاع من 94٪ ± 9٪، 82٪ ± 5٪ و 77٪ ± 5٪ على التوالي (الجدول 1) 15. وعلى سبيل المقارنة، فإن إطلاق واسترجاع كفاءة المرشحات غير المصقول بشكل ملحوظ أقل (7٪ ± 1٪ كفاءة والافراج عن 6٪ ± 1٪ كفاءة الاسترجاع) (الجدولين 1) 15. من أجل تقييم جدوى CTCs صدر من مرشح، ~ وارتفع 1000 SK-BR-3 الخلايا في 7.5 مل من الدم متبرع سليم، وتصفيتها من خلال PIPAAm مرشح فتحة المغلفة وأفرج عنه باستخدام الطريقة الموصوفة أعلاه. أجري لايف / فحص الميت لتقييم قابلية الخلية قبل ارتفاع في الدموبعد الافراج عنهم. وكانت الجدوى ما قبل ارتفاع 98٪ (592 من أصل 602 خلايا تحصى) والجدوى من الخلايا والقبض والإفراج عن الدم كان 95٪ (540 من أصل 567 خلايا تحصى) 15 (الشكل 3A). في موازاة ذلك، الخلايا اعتقلت وأفرج عنه بعد الترشيح من عينة الدم كانت تربيتها في مستنبت 5A مكوي و. واتخذت صورة في يوم 3 ويوم 10. كما هو مبين في الشكل 3B، والخلايا التي صدرت من مرشح لم تبق فقط قابلة للحياة، ولكن توسعت بسرعة في الثقافة، وبالتالي تأسيس لمرحلة ما جدوى الترشيح.

الشكل 1: PIPAAm المغلفة المرشحات فتحة لالتقاط والإصدار تعميم الخلايا السرطانية من الدم (لوحة الأعلى) (A) Brightfield صورة PIPAAm مرشح فتحة المغلفة. (ب) الترشيح من الدم الكامل للقبض على لجنة مكافحة الإرهاب. (ج) رسم تخطيطي للرانه ميكروفلتر كاسيت حيث تقع على، مرشح فتحة PIPAAm المغلفة بين الجزء العلوي والسفلي كاسيت. (أسفل لوحة) (D) تخطيطي لعملية الإفراج استولي عليه لجنة مكافحة الإرهاب من المرشحات فتحة PIPAAm المغلفة. مستنسخة بإذن من المرجع 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3: القبض على الإصدار والثقافة من الخلايا السرطانية قابلة للحياة خلايا سرطان الثدي (SKBr-3) ارتفعت في أسروا الدم المانحة العادي وأفرج عنه باستخدام ميكروفلتر PIPAAm المغلفة. ظلت خلايا قابلة للحياة بعد الإفراج وتوسعت في الثقافة بسرعة. (أ) فحص لايف ميت تنفيذها على الخلايا التي صدرت من مرشح. وأظهر 95٪ (540 من أصل 567 خلايا تحصى) من الخلايا لتكون قابلة للحياة(الأخضر) بعد الافراج عنهم. وصفت الخلايا الميتة باللون الأحمر. (ب) يوم 3 إلى يوم 10 الثقافة من الخلايا الإفراج عن مرشح فتحة PIPAAm المغلفة. ظلت خلايا قابلة للحياة وتوسعت في الثقافة. شريط مقياس = 100 μm.Reproduced بإذن من المرجع 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4): قياس المسام المعلمات قبل وبعد PIPAAm طلاء الصور Brightfield مرشح فتحة (A) قبل و(ب) مرحلة ما بعد PIPAAm طلاء. وقد انخفض طول (C) المسام بنسبة 7.3٪ ± 2.1٪ بعد أن انخفضت PIPAAm الطلاء والمسام العرض بنسبة 15.3٪ ± 5.6٪ بعد PIPAAm الطلاء. مستنسخة بإذن من المرجع 15.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تتم إزالة تلويث الكريات الحمر والكريات البيضاء التي كتبها جنتل يغسل تم انتشال ما يقرب من 1000 SKBr-3 خلايا من الدم عن طريق تصفية فتحة PIPAAm المغلفة وكانت مطلية على لوحة 48-جيدا: الرقم 5. (أ) في 16 ساعة في الثقافة، والخلايا SKBr 3 ورم انضمت إلى لوحة الثقافة (الأسهم الخضراء)، في حين أن كريات الدم الحمراء أفكارك وكريات الدم البيضاء واستقر أيضا في الجزء السفلي من لوحة (الأسهم الحمراء). (ب) بعد غسل، وإزالة الخلايا غير ملتصقة، وترك الخلايا السرطانية ملتصقة على لوحة (الأسهم الخضراء). مستنسخة بإذن من المرجع 15. من فضلكانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: القبض على الإصدار واسترجاع كفاءة PIPAAm فتحة المغلفة المرشحات القبض على كفاءة = أعداد الخلايا القبض على مرشح قبل إطلاق سراح أعداد / خلية ارتفعت في الدم. إطلاق سراح أعداد الخلايا كفاءة = صدر من الأرقام مرشح / خلية القبض على مرشح قبل الافراج عنهم. كفاءة الاسترجاع = أعداد الخلايا أفرج عنه من أرقام مرشح / خلية ارتفعت إلى blood.Reproduced بإذن من المرجع 15.

تمت حماية جزء من هذا العمل بموجب طلب براءة الاختراع المؤقت للولايات المتحدة رقم 62/219،808. Siddarth Rawal هي مساهم في شركة Circulogix Inc. التي تنتج تجاريا المرشحات وأشرطة / خراطيش المرشح المستخدمة في هذه المقالة.