يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الحماية فعالية والرئوي الاستجابة المناعية بعد تحت الجلد والطريق الأنفي BCG الإدارة في الفئران

10K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54440

⸱

سبتمبر 19, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Zaragoza

في هذه المقالة

ملخص

نقوم هنا بالتفصيل المنهجية المتبعة لمقارنة الفعالية الوقائية والاستجابة المناعية للرئة الناجمة عن التحصين داخل الأنف وتحت الجلد مع BCG في نموذج الفأر. تظهر نتائجنا فوائد التطعيم الرئوي وتشير إلى دور الاستجابة بوساطة IL17 في الحماية التي يسببها اللقاح.

الملخص

على الرغم من التغطية العالمية للتطعيم ضد BCG داخل الأدمة ، لا يزال السل أحد أكثر الأمراض المعدية انتشارا في العالم. شجعت البيانات قبل السريرية على لقاحات السل الرئوي كاستراتيجية واعدة للوقاية من الأمراض الرئوية المسؤولة عن انتقال العدوى. في هذا العمل ، نصف المنهجية المستخدمة لإثبات فوائد التطعيم ضد BCG داخل الأنف في نموذج الفئران عند مقارنتها بالتطعيم تحت الجلد. كشفت بياناتنا عن فعالية وقائية أكبر بعد إعطاء BCG داخل الأنف. بالإضافة إلى ذلك ، تشير نتائجنا إلى أن التطعيم الرئوي يؤدي إلى استجابة مناعية أعلى في الرئتين ، بما في ذلك استجابات Th1 و Th17 ، بالإضافة إلى زيادة تركيز الغلوبولين المناعي A (IgA) في الشعب الهوائية التنفسية. تظهر بياناتنا العلاقة بين الفعالية الوقائية ووجود الخلايا المنتجة ل IL17 في الرئتين بعد تحدي المتفطرة السلية ، مما يشير إلى دور هذا السيتوكين في الاستجابة الوقائية التي يمنحها التطعيم الرئوي. أخيرا ، نقوم بتفصيل سير العمل العالمي الذي طورناه لدراسة التطعيم التنفسي في نموذج الفأر ، والذي يمكن استقراءه على لقاحات السل الأخرى ، بصرف النظر عن BCG ، والتي تستهدف الاستجابة المخاطية أو طرق الإعطاء الرئوية الأخرى مثل القصبة الهوائية أو الهباء الجوي.

المقدمة

السل (TB) هو واحد من الأمراض المعدية الرائدة تسبب المزيد من الوفيات المرتبطة من فيروس نقص المناعة البشرية في العالم، وجنبا إلى جنب مع ارتفاع الزيادة من أدوية المتعددة السلالات المقاومة يجعل السل مشكلة صحية عالمية تنذر بالخطر 1. أدوات جديدة للتشخيص والمخدرات أكثر فعالية وأقل سمية، واللقاحات السل آمنة وفعالة جديدة هي حاجة ملحة، خاصة في العالم النامي.

تعيش الموهن عصيات كالميت غيران (BCG) حاليا لقاح مرخص الوحيد ضد السل، الذي تديره الأدمة عند الولادة منذ 1970s في جميع أنحاء العالم. ويعتبر السل فعالة في الوقاية من أشكال حادة من المرض (التهاب السحايا والسل الدخني) في الأطفال، ولكن أظهرت فعالية تتعارض ضد السل الرئوي المسؤول عن انتقال المرض 2.

التطعيم الرئوي، الذي يحاكي الطريق الطبيعي لعدوى السل، يمثل نهجا جذابا للفتيلة المضيف المحلي الاستجابة المناعيةالصورة. وفي هذا الصدد، أظهرت أعمال مختلفة قبل السريرية في نماذج السل حيوانية مختلفة ذات الصلة أكبر فعالية لقاح التالية التحصين الرئوي مقارنة تحت الجلد أو داخل الأدمة الطريق 3-6. ومع ذلك، فإن آليات الحماية الناجمة عن التطعيم الرئوي ليست مفهومة جيدا. في السنوات الأخيرة، وقد أشار العديد من الأعمال من أجل الاستجابة بوساطة IL17 باعتبارها عاملا مهما من الاستجابة المناعية المخاطية-TB معين، كما في نماذج الفئران ناقصة لIL17 المخاطية فعالية الحماية التي يسببها اللقاح تضعف 7،8.

نحن في الآونة الأخيرة أظهرت لأول مرة أن الأنف إدارة BCG باي DBA / 2 الفئران، سلالة الماوس تتميز انعدام الحماية بعد التطعيم ضد مرض السل تحت الجلد 9. وتشير هذه النتائج إلى أن تطعيم السل التنفسي يمكن أن تكون أكثر فعالية في الحد من نسبة السل في البلدان الموبوءة، حيث يعتبر BCG داخل الأدمة غير فعالة ضد pulmonالسل آرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وظلت كل الفئران تحت ظروف خاضعة للرقابة وملاحظة أي علامة على المرض. أجري العمل التجريبي في اتفاق مع التوجيهات الأوروبية والوطنية لحماية حيوانات التجارب وبموافقة من لجان الأخلاقيات المحلية المختصة.

1. إعداد الأرصدة كمية لالجلسرين من BCG الدنماركية وH37Rv المتفطرة السلية

وقد أجريت جميع البروتوكولات المذكورة في ظل ظروف BSL3: ملاحظة.

  1. أسهم الجلسرين المجمدة ذوبان الجليد من BCG الدنماركية أو سلالات H37Rv وتطعيم 100 ميكرولتر في 10 مل من 7H9 المتوسط ​​10 تستكمل مع توين-80 بنسبة 0.05٪ (ت / ت) وشركة تطوير العقبة (الزلال، سكر العنب، الكاتلاز) 10٪ (ت / ت).
  2. احتضان في ظل ظروف ثابتة لمدة أسبوع واحد على 37 درجة مئوية حتى الثقافة هي في نمو السجل المرحلة.
  3. رفع مستوى الثقافة البكتيرية عن طريق نقل ثقافة 10 مل إلى 200 مل من المتوسط ​​الطازجة. احتضان لمدة 20 إضافيةأيام في ظل ظروف ثابتة.
  4. نقل إلى أنابيب الطرد المركزي 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 2500 ز س.
  5. تجاهل supernatants و resuspend بيليه البكتيرية في حجم المتبقية. إضافة إلى كل أنبوب العقيمة الخرز الزجاجي 3 ملم قطرها (10-15 في أنبوب).
  6. دوامة بقوة خلال 1 دقيقة من أجل فصل كتل البكتيرية. resuspend كل بيليه في 10 مل من برنامج تلفزيوني مع توين-80 بنسبة 0.05٪ (ت / ت).
  7. ترك الأنابيب لمدة 10 دقيقة مما يتيح أكبر قدر من المجاميع البكتيرية والخرز الزجاجي ليستقر.
  8. استرداد 9.5 مل من طاف من كل من 4 أنابيب تحتوي على كتل صغيرة والبكتيريا واحدة وأحجام نقل إلى أدنى أنبوب الطرد المركزي 50 مل واحد (الحجم النهائي تعافى 38 مل). أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة على 400 ز س.
  9. استرداد 35 مل من طاف (التي تحتوي على البكتيريا بشكل رئيسي واحد) في جديدة أنبوب الطرد المركزي 50 مل واحد وإضافة 15 مل من برنامج تلفزيوني مع الجلسرين 50٪ (ت / ت)، والحصول على تركيز الجلسرين النهائية 15٪ (ت / ت).
  10. المزيج بلطفوتوزيعها في قسامات 1 مل في أنابيب مناسبة لتجميد. مخزن في -80 درجة مئوية (قطعة واحدة يوفر ما يقرب من 50 قسامات الأسهم الجلسرين).
  11. لقياس الأسهم الجلسرين، ذوبان الجليد والجلسرين اليوم بعد تجميد وتنفيذ سبعة التخفيفات المسلسل عشرة أضعاف في منفصلة أنابيب 1.5 مل تحتوي على 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  12. لوحة 100 ميكرولتر من كل تخفيف في 7H10 المتوسطة الصلبة أجار 10 تستكمل مع شركة تطوير العقبة 10٪ (ت / ت) التي أعدت في 55 مم أطباق بتري.
  13. بعناية إضافة 3 حبات الزجاج ملم قطرها (حوالي 10 في لوحة) ويهز بلطف لوحة لتوزيع بالتساوي حجم فوق لوحة أجار. تجاهل الخرز وختم لوحة أجار مع بارافيلم.
  14. احتضان لمدة 21 يوما في 37 درجة مئوية، وتحديد تركيز البكتيريا عن طريق عد الوحدات المكونة للمستعمرة (كفو) في التخفيفات حيث المستعمرات واحد يمكن تمييزها بدقة.

2. ماوس التطعيم

  1. ذوبان الجليد في BCG الجلسرين كميا قبل وتمييع في برنامج تلفزيوني لالإعداديةهما تعليق. حساب الحجم النهائي النظر في جرعة لكل حيوان هو 100 ميكرولتر للإدارة تحت الجلد (10 7 كفو لكل مل للتطعيم تحت الجلد) و 40 ميكرولتر لإدارة الأنف (2.5 × 10 7 كفو للتطعيم داخل الأنف).
  2. استخدام محطة عمل التخدير المتخصصة للقوارض لتخدير الفئران مع خليط من الأيزوفلورين والأكسجين. استخدام الأيزوفلورين 5٪ للحث على التخدير و 2٪ للحفاظ على الفئران في غرفة التخدير. (ويمكن استخدام غيرها من طريقة التخدير مقبول).
  3. لإعطاء اللقاح تحت الجلد ملء حقنة 1 مل مع إبرة 26 G مع 1 مل من تعليق البكتيرية (10 7 خلية / مل). إزالة فقاعات الهواء.
  4. وضع الماوس تخدير على سطح مستو في موقف المعرضة داخل غطاء تدفق الصفحي وتطعيم تحت الجلد 100 ميكرولتر (10 6 كفو / جرعة) من اللقاح في الجهة من الماوس مرة أخرى. عودة الماوس إلى القفص ومراقبة لضمان propeRLY يتعافى من التخدير.
  5. تغيير إبرة حقنة بين كل إدارة الماوس. إزالة فقاعات الهواء كما هو موضح أعلاه.
  6. لإدارة الأنف، وضع الماوس تخدير في موقف ضعيف داخل غطاء محرك السيارة.
  7. مع micropipette يستغرق 20 ميكرولتر من تعليق مع 2.5 × 10 7 خلية / مل. وضع اللقاح قطرة تلو قطرة بين فتحتي الأنف حتى يتم إيداع مجلدا كاملا، وترك الوقت بين قطرات للسماح الماوس التنفس وحدة التخزين في ملاحظة: يمكن أن الفئران تعاني من ضيق في التنفس أثناء هذا الإجراء ولذلك يجب أن تترك لل استيعاب كل قطرة مسبق لادارة المرحلة التالية لمنع ذلك قدر الإمكان.
  8. إعادة ملء micropipette مع 20 ميكرولتر آخر وكرر العملية. إذا بدأ الفأر أن يستيقظ من التخدير بعد التلقيح الأول، وضعه في غرفة التخدير قبل ثانية واحدة. عودة الماوس إلى القفص، وضمان أنه يتعافى بشكل صحيحمن التخدير.

3. ماوس الطعن في الأنف مع H37Rv الانفعال

  1. ذوبان الجليد في H37Rv الجلسرين كميا قبل وتمييع في برنامج تلفزيوني لإعداد تعليق البكتيرية من 2500 كفو لكل مل. حساب الحجم النهائي النظر في جرعة لكل حيوان هو 40 ميكرولتر.
  2. وتلقيح H37Rv الأنف كما هو موضح في 2،5-2،7. جرعة التحدي النهائية في الماوس هو 10 2 كفو / 40 ميكرولتر.

4. تحليل المستحثة الاستجابة المناعية في الرئتين

  1. الرئة تعليق الخلوي
    ملاحظة: تقييم الاستجابة المناعية التكيفية التي يسببها اللقاح في الرئتين يتطلب توليد تعليق خلية واحدة. لهذا الغرض، ونحن نستخدم dissociator الأنسجة مثل GentleMACS.
    1. التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم (أو غيرها من منهجية الإنسانية المقبولة) وضمان الفأر هو ميت لمس مقلة العين لتأكيد غائبة منعكس طرفة.
    2. داخل غطاء تدفق الصفحي، استخراج لترungs باستخدام مقص العقيمة وملقط ووضعها على سطح نظيف. الرئتين نظيفة إزالة القصبة الهوائية والنسيج الضام، ونقل الرئتين إلى أنبوب 1.5 مل مع برنامج تلفزيوني (الحفاظ على الجليد حتى التجهيز).
    3. لتوليد تعليق الخلوية، وضع الرئتين في أنبوب المناسب لتفكك الجهاز (أنبوب C-dissociator) تحتوي على 5 مل من 10 ملي HEPES-هيدروكسيد الصوديوم 7.4 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 1 ملم MgCl 2 و 1.8 ملي CaCl 2 العازلة.
    4. إضافة 100 ميكرولتر من كولاجيناز D 100 ملغ / مل (2 ملغ / مل تركيز النهائي)، و 40 ميكرولتر من أنا الدناز 20000 وحدة دولية / مل (160 وحدة دولية / مل تركيز النهائي.
      ملاحظة: الحلول المالية من كولاجيناز D أو DNaseI يتم إعداد حل الانزيمات مجفف بالتجميد في برنامج تلفزيوني أو الجلسرين 50٪ (ت / ت)، 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة ذ MgCl 2 1 ملم، على التوالي.
    5. وضع أنبوب في dissociator الأنسجة واستخدام m_lung_01 برنامج محدد مسبقا لتجزئة الرئة. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة.
    6. المركز الرابعأنبوب الإلكترونية في dissociator واستخدام m_lung_02 البرنامج مسبقا لتجانس الرئة الكامل إلى تعليق الخلوي واحد.
    7. تمرير تعليق الخلوي من خلال 70 ميكرون خلية النايلون مصفاة لتركيب أنبوب الطرد المركزي 50 مل. غسل مصفاة مع 10 مل من المتوسط ​​1640 RPMI.
    8. خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 x ج وتجاهل طاف.
    9. إضافة 1 مل من الكريات الحمراء الناشر العازلة، مزيج من قبل vortexing واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    10. إضافة 10 مل من RPMI 1640 الخلايا المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 ز س.
    11. Resuspend الخلايا في 0.5 مل من اكتمال المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع المعطل للحرارة بنسبة 10٪ الجنين العجل المصل (FCS)، 2 مم L-Glutamin، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين و 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول.
      ملاحظة: يتم المعطل FCS من الحضانة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    12. عد الخلايا وإضافة RPMI كاملة 1640 المتوسطة للوصول إلى الكثافة الخلوية النهائية من 10 7 خلية / مل.
      ملاحظة: للحصول على عدد خلايا، ونحن نستخدم مكافحة خلية الآلي.
    13. توزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلوية في U-أسفل لوحة 96-جيدا العقيمة (10 6 خلايا / جيد).
    14. إضافة 50 ميكرولتر / بئر الكامل المتوسط ​​1640 RPMI مع 15 ميكروغرام / مل من H37Rv التجاري البروتين النقي المشتق (PPD) (5 ميكروغرام / مل تركيز النهائي).
  2. جمع طاف لتحديد خلوى بواسطة ELISA
    1. احتضان لوحة من 4.1.14 لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. لوحة أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 x ج واسترداد 100 ميكرولتر من طاف.
    3. تخزين في -80 درجة مئوية.
    4. تمييع supernatants 1/10 و 1/2 في المخزن فحص لIFNγ وتقرير IL17A، على التوالي. تحديد تركيزات خلوى مع مجموعات ELISA التجارية، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (مجموعات التنمية ELISA).
  3. تلطيخ الخلايا لتحديد خلوى-producing CD4 + الخلايا عن طريق التدفق الخلوي
    1. احتضان لوحة من 4.1.14 لمدة 18 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. إضافة 1.5 ميكرولتر من Brefeldin A 1 ملغ / مل (الأسهم الذائبة في DMSO) لكل (تركيز النهائي 10 ميكروغرام / مل) جيدا واحتضان لمدة ست ساعات إضافية.
    3. أجهزة الطرد المركزي لوحة من 4.3.2 لمدة 1 دقيقة في 3200 x ج وتجاهل طاف.
    4. Resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من مكافحة فأر CD4-FITC المخفف في RPMI 1640 مع 10٪ FCS (1/500)، واحتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    5. أجهزة الطرد المركزي لوحة من 4.3.4 لمدة 1 دقيقة في 3200 x ج، تجاهل طاف وإضافة 100 ميكرولتر / بئر حل التثبيت. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    6. غسل الخلايا مرتين مع 150 ميكرولتر / غسل من حل permeabilization.
      ملاحظة: يتم تخفيف 10X الأسهم تتركز في الماء منزوع الأيونات لإعداد محلول العمل 1X.
    7. Resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من مكافحة فأر IFNγ-APC ومكافحة فأر IL17A-APC.Cy7 مخففة في permeabilحل سعودة (1/250 كل من الأجسام المضادة).
    8. احتضان لمدة 1 ساعة على RT.
    9. غسل الخلايا مرتين مع 150 ميكرولتر / غسل من حل permeabilization.
    10. Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لاكتساب التدفق الخلوي.

5. تحليل المناعية في القصبات الغسل (نال)

  1. حصولهم العينات BAL
    1. التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم (أو غيرها من منهجية الإنسانية المقبولة) وضمان الفأر هو ميت لمس مقلة العين لتأكيد غائبة منعكس طرفة.
    2. فضح القصبة الهوائية باستخدام المناسبة الدقة ملقط معقم والمقص وإجراء قطع صغير في القصبة الهوائية، والتأكد من عدم استئصال تماما. الحرص على عدم تسبب النزيف التي يمكن أن تلوث العينة بال.
    3. ندخل في القصبة الهوائية قنية متصلة معقمة حقنة 1-مل مع 800 ميكرولتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
    4. تطعيم ببطء برنامج تلفزيوني في الرئتين ومن ثم صإيكوفر حجم بال الانسحاب مكبس الحقنة ببطء للغاية من أجل تجنب انهيار الرئة.
      ملاحظة: استرداد 500 و 600 ميكرولتر غير مرضية.
    5. نقل حجم بال في أنبوب 1.5 مل وتأكيد يبقى بال uncoloured، مشيرا إلى أن لا تكون ملوثة بالدم (الحفاظ على الجليد حتى التجهيز).
    6. الطرد المركزي عينات بال لمدة 5 دقائق في 400 x ج، ونقل طاف لأنبوب جديد.
    7. متجر supernatants في -80 درجة مئوية.
  2. تقرير من إعتلال في بال supernatants
    ملاحظة: جميع الكواشف المستخدمة في RT.
    1. معطف نسبة عالية من البروتين البوليسترين ملزم أسفل شقة لوحات 96-جيدا مع 100 ميكرولتر من PPD مخففة في برنامج تلفزيوني (10 ميكروغرام / مل) لم. السل -specific تقرير ايغا، أو مع 100 ميكرولتر من BAL طاف المخفف 10 مرات في برنامج تلفزيوني لمجموع تقرير ايغا.
    2. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    3. تجاهل طاف والاستفادة من لوحة على منشفة ورقية لدراي. يغسل مع 200 ميكرولتر / جيد من برنامج تلفزيوني.
    4. منع مع 200 ميكرولتر / بئر من زلال المصل البقري (BSA) 1٪ (ث / ت) في برنامج تلفزيوني-توين-80 بنسبة 0.05٪ (ت / ت) (عازلة حجب).
    5. احتضان 1 ساعة على RT.
    6. يغسل مرة واحدة مع 200 ميكرولتر / بئر برنامج تلفزيوني توين-80 بنسبة 0.05٪ (ت ت /) (عازلة الغسل).
    7. إضافة 100 ميكرولتر من طاف بال مخفف في الآبار المغلفة PPD. احتضان ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: إذا تم الكلي تقرير ايغا بالتوازي مع PPD محددة ايغا، وترك مجموع الآبار ايغا مع غسل العازلة 100 ميكرولتر خلال هذه الحضانة.
    8. يغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر / بئر غسل buffer.0170004
    9. إضافة 100 ميكرولتر من الفجل البيروكسيداز (HRP) -conjugated مكافحة فأر ايغا المخفف في عرقلة العازلة (1/10000).
    10. احتضان 1 ساعة RT.
    11. غسل خمس مرات مع 200 ميكرولتر / بئر غسل العازلة.
    12. إضافة 100 ميكرولتر / بئر 3،3 '، 5،5'-Tetramethylbenzidine (TMB). احتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في تيكان الظلام.
    13. إضافة 100 ميكرولتر / بئر H 2 SO 4 0.5N. قراءة لوحة في معمل عند طول موجي 450 نانومتر.

6. الجرثومي تقرير الحمل في الرئتين

  1. الرئة التجانس والطلاء
    1. بعد أربعة أسابيع التحدي، تضحية الماوس بواسطة الخلع عنق الرحم (أو غيرها من منهجية الإنسانية المقبولة) وضمان الفأر هو ميت لمس مقلة العين لتأكيد غائبة منعكس طرفة.
    2. ضع الماوس في موقف ضعيف ثابتة على سطح مستو وتطهيرها داخل غطاء تدفق الصفحي.
    3. إجراء شق وإزالة الجلد من منطقة الصدر لترك مرئية منطقة الصدر.
    4. قطع الأضلاع وحصاد الرئتين والقلب باستخدام مقص العقيمة وملقط. وضع الأجهزة على سطح نظيف.
    5. تنظيف الرئتين عن طريق إزالة القلب والقصبة الهوائية والأنسجة الضامة ونقل الرئتين إلى أنبوب 1.5 مل مع 1 مل من الماء منزوع الأيونات(الحفاظ على الجليد حتى معالجة).
    6. استخدام ملقط معقم لنقل الرئتين من كل فأر في أنبوب المناسب لتجانس جهاز (M - أنبوب dissociator)، التي تحتوي على 1 مل من الماء منزوع الأيونات.
    7. وضع أنبوب في dissociator الأنسجة واستخدام RNA_1 برنامج محدد مسبقا لالتجانس الرئتين.
    8. جعل خمسة التخفيفات المسلسل عشرة أضعاف في أنابيب 1.5 مل، بدءا من 100 ميكرولتر من جناسة الرئة مخففة في 900 ميكرولتر.
    9. التخفيفات لوحة كما هو موضح في 1،11-1،14.
  2. التمايز بين BCG وH37Rv بواسطة PCR
    ملاحظة: في لوحات من 6.1.6 الموافق المجموعة التي تم تلقيحها مع BCG بالطريق الأنف، قمنا بتحليل عدد تمثيلي من المستعمرات قبل PCR المميزين بين BCG وH37Rv للتأكد من أن كفو تعتبر لتقييم فعالية يتفق واقية الممنوحة لقاح فريد لH37Rv. هذه الأهداف PCR التضخيم من RD9، وهي منطقة الجينومية مختلفة في مجموعة بوسطن الاستشارية وم توberculosis، وإعطاء جزء من 2618 سنة مضت لH37Rv، و 465 نقطة أساس لقاح بي سي جي 11.
    1. إعداد المخزون مزيج الرئيسي لجميع العينات مع وحدات التخزين في عينة كما هو مبين، ومن ثم توزيعها في أنابيب PCR (9 ميكرولتر / العينة).
      ملاحظة: المخزن المؤقت 5X: 2 ميكرولتر. التمهيدي إلى الأمام 25 ميكرومتر (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0.32 ميكرولتر، عكس التمهيدي 25 ميكرومتر (GCCCAACAGCTCGACATC): 0.32 ميكرولتر، طق البلمرة 5 وحدات / ميكرولتر: 0.04 ميكرولتر، منزوع الأيونات H 2 O: 6.32 ميكرولتر.
    2. المس مستعمرة مع المسواك العقيمة وتزج مسواك مع العينة في أنبوب PCR التي تحتوي على مزيج الرئيسي.
    3. تشغيل PCR مع البرنامج التالي: 10 دقيقة 95 درجة مئوية (هذه الخطوة لتحريك تعطل البكتيري)، 10 دقيقة 95 درجة مئوية (هذه الخطوة لتحريك تعطل البكتيري)، 35 دورات (30 ثانية في 95 درجة مئوية، 1 دقيقة في 58 درجة مئوية و 4 دقائق عند 72 درجة مئوية).
    4. تحميل عينات PCR في هلام الاغاروز 1٪ مع عينات بروميد إيثيديوم وتشغيل لتصور شظايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يصف هذا العمل المقارنة بين طريقين من إدارة BCG: تحت الجلد وداخل الأنف. الطريق تحت الجلد هو مشابه إلى الأدمة، الذي هو الطريق السريرية الحالية لمجموعة بوسطن الاستشارية في جميع أنحاء العالم. ويهدف طريق الأنف التطعيم لتقليد الطريق الطبيعي لعدوى م. السل، بهدف تحريض استجابة مناعية مباشرة في الرئتين، والجهاز الهدف الرئيسي لهذا العامل الممرض.

يوضح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على الرغم من أن اللقاح الحالي ضد السل ، BCG ، هو اللقاح الأكثر انتشارا في التاريخ ، إلا أن السل لا يزال أحد الأسباب الرئيسية للوفاة والمراضة الناجمة عن الأمراض المعدية في جميع أنحاء العالم. تفسر هذه المفارقة بعدم حماية هذا اللقاح ضد السل الرئوي ، وهو الشكل المسؤول عن انتقال العدوى. هناك حاجة ماسة إلى نهج تطعيم جديدة فعالة ضد الأشكال الرئوية للمرض ، حيث سيكون لها أكبر تأثير على انتقال المرض على مستوى العالم.

تظهر بياناتنا بوضوح أن التغيير في مسار إعطاء BCG لتقليد المسار الطبيعي للعدوى يمكن أن ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل "وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية الإسبانية" [رقم المنحة BIO2014-5258P] ، "المفوضية الأوروبية" من قبل برامج H2020 [أرقام المنح TBVAC2020 643381].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرق ميدلبروك 7H9ديناربحريني 271310
ميدلبروك ADC إثراءدينار بحريني211887
توين 80شارلاوTW00800250
خرز زجاجي بقطر 3 ممشارلاو038-138003
ميدلبروك 7H10 أجارديناربحريني 262710
حقنة 1 مل 26GA 0.45 × 10 مم301358 ديناربحريني
GentleMACS dissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
C أنابيبMiltenyi Biotec130-093-237
M أنابيبMiltenyi Biotec130-093-236
Collagenase DRoche11088882001
DNaseIApplichemA3778،0100
Falcon 70 & micro ؛ مصفاة الخليةm Corning352350
RPMI 1640SigmaR0883
خلايا الدم الحمراء عازلةSigmaR7757
مكمل GlutaMAXGibco35050-061100x محلول
البنسلين الستربتومايسينSigmaP4333100x مصل
عجل الجنينبيولوجي الصناعات04-001-1A
2-MercaptoethanolSigmaM3148-25ML
صولجان 2.0 مستشعرات عداد خلايا مؤتمتة محمولةMilliporePHCC20040
مستشعرات عداد الخلايا الصولجان ، 40 & micro ؛ مMilliporePHCC40050
المتفطرة السلية - Tuberculin PPDStatens Serum Institut (SSI)2390
Mouse IFN- & gamma; مجموعة أدوات تطوير ELISA Mabtech3321-1H
Mouse IL17A ELISA طقم تطوير  Mabtech3521-1H
Brefeldin ASigmaB7651
FITC Rat Anti-Mouse CD4BD 553047
BD Cytofix / Cytoperm KitBD555028
APC-Cy7 Rat Anti-Mouse IL-17ABD560821
APC Mouse مضاد للفأر IFNgBD554413
LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 × 30 مم 23 جم × 1 1/4 بوصةUNIMED27.134تستخدم كقنية القصبة الهوائية
لألواح البوليسترين الملزمة عالية البروتين BAL ذات القاع المسطح 96 بئر MAXISORPNUNC430341
الألبومين ، من مصل الأبقارSigmaA4503
Goat Anti-Mouse IgA (&alpha ؛ سلسلة محددة) ناقص ؛ الأجسام المضادة للبيروكسيدازSigmaA4789
3،3 & ، 5،5 & -tetramethylbenzidine (TMB)   ؛SigmaT0440
MyTaq DNA PolymeraseBiolineBIO-21107تتضمن المجموعة Buffer 5x
محلول المركز المركز

المراجع

  1. Zumla, A., et al. The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go. Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).
  2. Mangtani, P., et al. Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials. Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).
  3. Aguilo, N., et al. Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination. Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).
  4. Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis. Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).
  5. Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).
  6. Lagranderie, M., et al. BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route. Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).
  7. Gopal, R., et al. Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis. Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).
  8. Khader, S. A., et al. IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).
  9. Aguilo, N., et al. Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism. J Infect Dis. , (2015).
  10. Middlebrook, G., Cohn, M. L. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods. Am J Public Health Nations Health. 48 (7), 844-853 (1958).
  11. Brosch, R., et al. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).
  12. Kaushal, D., et al. Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis. Nat Commun. 6, 8533(2015).
  13. Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).
  14. Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).
  15. Griffiths, K. L., et al. Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. PLoS One. 8 (10), e78312(2013).
  16. Hirota, K., et al. Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses. Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).
  17. Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels. J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

BCG BCG IL17 IgA H37Rv
الحماية فعالية والرئوي الاستجابة المناعية بعد تحت الجلد والطريق الأنفي BCG الإدارة في الفئران
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.