يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

11.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54457

⸱

سبتمبر 9, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المخطوطة طريقة حقن صب مهندس microvessels أن ألخص الخصائص الفسيولوجية للالبطانة. العملية المستندة ميكروفلويديك تخلق شبكات الأوعية الدموية براءات الاختراع 3D مع الظروف tailorable، مثل تدفق والتكوين الخلوي، والهندسة، والتدرجات الكيميائية الحيوية. ووصف عملية التصنيع وأمثلة من التطبيقات المحتملة.

الملخص

في منصات المختبر لدراسة الخلايا البطانية والبيولوجيا الوعائية تقتصر إلى حد كبير إلى 2D زراعة الخلايا البطانية، وتدفق غرف مع البوليمر أو ركائز الزجاج مقرها، والمقايسات تشكيل أنبوب القائم على هيدروجيل. هذه المقايسات، في حين بالمعلومات، لا ألخص الهندسة التجويف، المصفوفة خارج الخلية المناسبة، والقرب عديد الخلايا، التي تلعب دورا رئيسيا في تحوير وظيفة الأوعية الدموية. توضح هذه المخطوطة طريقة الحقن لتوليد الأوعية هندسيا مع قطر بناء على أمر من 100 ميكرون. هي ملفقة Microvessels من البذر الخلايا البطانية في قناة ميكروفلويديك جزءا لا يتجزأ من ضمن نوع أصلي أنا الكولاجين هيدروجيل. من خلال دمج الخلايا متني داخل المصفوفة الكولاجين السابقة لتوجيه تشكيل، microenvironments الأنسجة محددة يمكن أن تكون على غرار ودراستها. التحويرات إضافية من خصائص وسائل الإعلام الهيدروديناميكية تكوين تسمح للسيطرة على وظيفة الأوعية الدموية المعقدة داخل المكروية المطلوب.هذا البرنامج يسمح لدراسة توظيف ماحول الأوعية الخلايا، التفاعلات الدم البطانة، استجابة التدفق، والتفاعلات الأنسجة الاوعية الدموية الدقيقة. microvessels هندسيا توفر القدرة على عزل تأثير من المكونات الفردية من مكانة الأوعية الدموية وعلى وجه التحديد المكافحة الكيميائية والميكانيكية والخصائص البيولوجية لدراسة علم الأحياء الأوعية الدموية في كل من الصحة والمرض.

المقدمة

في الأوعية الدموية الدقيقة في كل جهاز يساعد على تحديد المكروية الأنسجة، والحفاظ على توازن الأنسجة وتنظيم التهاب، النفاذية، تخثر الدم، وانحلال الفيبرين 1،2. البطانة الاوعية الدموية الدقيقة، على وجه الخصوص، هو واجهة بين تدفق الدم والأنسجة المحيطة بها، وبالتالي تلعب دورا حاسما في تحوير الأوعية الدموية وظيفة الجهاز استجابة للمؤثرات مثل القوات الهيدروديناميكية والسيتوكينات تعميم والهرمونات 3-5. فهم التفاعلات مفصلة بين البطانة، والدم، والمكروية الأنسجة المحيطة هامة لدراسة البيولوجيا الوعائية وتطور المرض. ومع ذلك، فقد أعاقت التقدم في دراسة هذه التفاعلات التي تقتصر في أدوات المختبر التي لا ألخص في بنية الاوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي وتعمل 6،7. ونتيجة لذلك، اعتمدت الميدان والتقدم العلاجي بشكل كبير على تكلفة وقت-تستهلك النماذج الحيوانية التي غالبا ما تفشل في ترجمة النجاح في البشر 8-10. بينما في النماذج الحية لا تقدر بثمن في دراسة آليات المرض وظائف الأوعية الدموية، فهي معقدة وغالبا ما تفتقر إلى مراقبة دقيقة من الأفراد الخلوي، والكيمياء الحيوية، والعظة الفيزيائية الحيوية.

الأوعية الدموية في جميع أنحاء الجسم يمتلك بنية هرمية ناضجة بالتعاون مع أسرة الشعرية توسعية، وتوفير نضح الأمثل ونقل المواد الغذائية في وقت واحد 11. في البداية، أشكال الأوعية الدموية كما ضفيرة البدائية التي تعيد ترتيب لشبكة متفرعة هرميا خلال التنمية في وقت مبكر 12،13. على الرغم من أن العديد من إشارات تشارك في هذه العمليات مفهومة جيدا 14-16، فإنه لا يزال بعيد المنال كيف يمكن لهذا يتم تحديد الزخرفة الوعائية 15. بدوره، تلخص هذه العملية في المختبر لمهندس شبكات الأوعية الدموية المنظمة لديها النحلن العديد من في المختبر المنصات الموجودة صعبة. لنموذج الأوعية الدموية، مثل اثنين من الأبعاد مزارع الخلايا البطانية، تفتقر إلى الخصائص المهمة مثل القرب عديد الخلايا، ثلاث الهندسة اللمعية الأبعاد، تدفق، والمصفوفة خارج الخلية. وقد استخدمت 19 أو غزو المقايسات 20،21 لدراسة وظيفة بطانة الأوعية الدموية في 3D وتفاعلاتها مع غيرها من الأوعية الدموية 17،22 أو خلية الأنسجة أنواع 23 - أنبوب المقايسات تشكيل في الهلاميات المائية 3D (الكولاجين أو الفيبرين) 17. ومع ذلك، وتجميعها شمعة في هذه المقايسات تفتقر إلى الترابط، وتدفق الدورة الدموية، ونضح المناسب. وعلاوة على ذلك، والميل للتراجع الأوعية الدموية في هذه أنبوب المقايسات تشكيل 24 يمنع الثقافة على المدى الطويل والنضج مما يحد من درجة الدراسات الفنية التي يمكن القيام بها. وبالتالي، هناك حاجة المتزايدة لمهندس في المختبر منصات شبكات الاوعية الدموية الدقيقة التي يمكن أن نموذج بشكل مناسب أونdothelial خصائص وقابلة للثقافة على المدى الطويل.

ظهرت مجموعة متنوعة من تقنيات الهندسة الأوعية الدموية على مر السنين للتطبيقات الطبية لاستبدال أو السفن تجاوز المتضررة في المرضى الذين يعانون من أمراض الأوعية الدموية. وكان سفن القطر كبيرة مصنوعة من مواد تركيبية مثل البولي اثيلين البولي (PET)، وتترافلوروإيثيلين (EPTFE) نجاح علاجي كبير مع طويلة المدى المباح (متوسط ​​95٪ المباح أكثر من 5 سنوات) 25. على الرغم من القطر الصغير الطعوم الاصطناعية (<6 ملم) تواجه عادة مضاعفات مثل تضخم باطنة وتكون الصفيحات 26 - 28، الأنسجة المهندسة الطعوم صغيرة قطرها المصنوع من المواد البيولوجية قد حققت تقدما كبيرا 29،30. وعلى الرغم من التقدم من هذا النوع، وظلت السفن هندسيا على الميكروسكيل تحديا. لنموذج بشكل كاف الأوعية الدموية الدقيقة، فمن الضروري لتوليد أنماط شبكة معقدة مع SUFficient القوة الميكانيكية للحفاظ على المباح ومع تكوين مصفوفة التي تسمح لكل من نفاذ المواد الغذائية للخلايا متني وإعادة عرض الخلوية.

ويعرض هذا البروتوكول الاصطناعية شبكة الأوعية perfusable الرواية التي يحاكي مواطن في الجسم الحي وضع مع الانضباطي والسيطرة عليها المكروية 31-34. الطريقة الموصوفة يولد microvessels هندسيا مع قطر بناء على أمر من 100 ميكرون. هي ملفقة microvessels التي صممتها perfusing الخلايا البطانية من خلال قناة ميكروفلويديك مضمن ضمن نوع لينة أنا الكولاجين هيدروجيل. هذا النظام لديه القدرة على توليد شبكات نمط مع هيكل اللمعية مفتوحة، وتكرار التفاعلات متعددة الخلايا، تعدل خارج الخلية تكوين مصفوفة، وتطبيق قوات الدورة الدموية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التصنيع الدقيق من منقوشة ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) مع تصميم شبكة

  1. رقاقة تلفيق لإنشاء قالب سلبي من تصميم شبكة
    1. خلق نمط الشبكة باستخدام أي تصميم (CAD) البرمجيات بمساعدة الكمبيوتر. تأكد من أن البعد قطري بين مدخل ومخرج تطابق المسافة بين مدخل ومخرج الخزانات على الأجهزة السكن في الخطوات المستقبلية (انظر 2.1.1).
      ملاحظة: تصميم نمط نفسها اعتمادا الجمركية على أهداف بحثية محددة من قبل المستخدم (انظر الشكل 1 على سبيل المثال أنماط).
    2. توليد قناع نمط الشبكة باستخدام عالية الدقة الطباعة أو طلب الضوئية الرئيسية الكروم من مورد تجاري. بروتوكول أكثر تفصيلا لعملية ضوئيه متاح في أماكن أخرى 35.
    3. تنظيف ويفر 8 "السيليكون لمدة 5 دقائق في 100 واط مع العلاج الأكسجين البلازما.
    4. صب ما يكفي من مقاومة للضوء سلبي (SU-82100 يعمل بشكل جيد) على الرقاقة بحيث مقاومة أشكال وجبة بوظة مع قطر 2.5 سم. باستخدام المغطي تدور، وتدور الرقاقة عند 500 دورة في الدقيقة مع 100 دورة في الدقيقة / ثانية منحدر وصيانة لمدة 10 ثانية. ثم المنحدر حتى 1600 دورة في الدقيقة مع 300 دورة في الدقيقة / ثانية، والحفاظ على لمدة 30 ثانية. ملاحظة: سرعة ومنحدر تحتاج إلى الأمثل لكل حالة المختبر أن تسفر عن مقاومة سماكة 150 ميكرون.
    5. لينة خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 7 دقائق، المنحدر تصل إلى 95 درجة مئوية مع 360 ° C / ساعة، والحفاظ على لمدة 45 دقيقة. تبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة على طبق ساخن. بصمة نمط السفينة على الرقاقة المغلفة عن التعرض إلى 365 نانومتر ضوء الأشعة فوق البنفسجية تحت الضوئية الرئيسية الكروم، مع التعرض ثلاثة أضعاف ذلك من توصية الشركة الصانعة (350 ميغا جول / سم 2 لسمك SU-8 من حوالي 150 ميكرون).
      ملاحظة: منذ SU-8 هو سلبي مقاومة، فإن المناطق التي تعرضت (كل شيء ما عدا تصميم نمط) تصبح غير قابلة للذوبان للمطور في الخطوة 1.1.7.
    6. من الصعب خبز الرقاقة يتعرض في 65درجة مئوية لمدة 5 دقائق والطريق المنحدر تصل إلى 95 درجة مئوية مع 360 ° C / ساعة وصيانة لمدة 25 دقيقة، ثم السماح لتبرد ببطء إلى RT على طبق ساخن.
    7. تزج الرقاقة في SU-8 المطور ل10-15 دقيقة ليغسل غير مصورة مقاومة، ثم نظيفة مع ايزوبروبيل والجافة تحت تدفق النيتروجين المضغوط. افحص النقش تحت المجهر الضوئي لضمان المستعبدين جيدا إلى الرقاقة على SU-8 مقاومة (ابحث عن تقشير غير المرغوب فيها وفقاعات).
    8. قياس سمك ميزات نمط باستخدام profilometer وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 36. خلال اكتساب القياس، وتجنب مناطق هيكل التي لا غنى عنها من أجل وظيفة شبكة (أي مدخل ومخرج قنوات) باعتباره profilometer الاتصال القائم يمكن أن تهدد سلامة الهيكلية للميزات نمط على الرقاقة. بدلا من ذلك، استخدام أسلوب عدم الاتصال (أي profilometer البصرية) لتجنب هذه المشكلة تماما.
  2. شركة جنرال الكتريكneration من منقوشة وشقة لقوالب صب الكولاجين
    ملاحظة: التعامل مع silanes داخل غطاء الدخان الكيميائية.
    1. وضع رقاقة في مجفف مع 100 ميكرولتر من ثلاثي كلورو (3،3،3-trifluoropropyl) سيلاني لمدة 2 ساعة لsilanize السطح.
    2. نقل رقاقة silanized إلى 120 × 120 مم مربع طبق بيتري. صب وكيل المختلط وبالغاز دي PDMS المطاط الصناعي وعلاج (10: 1 ث / ث نسبة) على الرقاقة لتحقيق 4-6 مم سماكة. صب PDMS إضافية إلى 120 × 120 ملم مربع طبق منفصل بيتري لتوليد القوالب المسطحة دون الأنماط. علاج عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    3. تخرج من الفرن والسماح للPDMS ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة. باستخدام مشرط قطع بعناية مربع حول SU-8 وقشر ببطء قبالة العفن PDMS من رقاقة. تقليم حواف إلى 30 ملم × 30 ملم. لقوالب مسطحة، وقطع الشفاء PDMS دون نمط مطبوع إلى قطع مربعة حوالي 40 ملم × 40 ملم.

2. أجهزة الإسكان

  1. Fabricatأيون من أعلى وأسفل قطعة الإسكان
    1. افتعال الإسكان سفينة باستخدام بولي (ميتاكريليت الميثيل) (PMMA). الى افتعال، تأمر أجزاء من متجر للآلات القياسية مع العددية الكمبيوتر التي تسيطر عليها (CNC) قدرات الطحن. انظر الشكل 1 لالتخطيطي من القطع العلوية والسفلية.
    2. تصميم قطعة أعلى الإسكان (1D الشكل) لتشمل 20 ملم × 20 ملم بشكل جيد على الجانب السفلي من الجهاز وعلى عمق 1 ملم، واثنين من منافذ حقن الكولاجين (قطر 4 مم) في الجزء العلوي من الجهاز الموجود في زوايا من الساحة جيدا، وهما مدخل ومخرج الخزانات مع 6 أقطار ملم، وأربعة ثقوب المسمار (مم 3) في الأركان الأربعة للجهاز.
      ملاحظة: قد يتم حفر ثقوب إضافية على هامش قطعة لأغراض التعامل معها.
    3. تصميم قطعة سكنية السفلي (الشكل 1E) لتشمل ثقب مربع في الوسط (أبعاد 15 ملم × 15 ملم) مع المحيطة 25 ملم × 25 ملمالرف وعلى عمق 0.25 مم. حفر 4 فتحات المسامير مع 4-40 الموضوع. ضمان فتحات المسامير في الجزء السفلي، ووأعلى القطع محاذاة معا خلال الخطوات التجمع في المستقبل.

3. Microvessel تصنيع الأجهزة

  1. إعداد المواد
    1. غسل وتعقيم مجموعتين من ملاقط، ملعقة الفولاذ المقاوم للصدأ، وهو سائق المسمار شقة صغيرة، ومسامير الصلب غير القابل للصدأ، والعديد من دبابيس وتد الفولاذ المقاوم للصدأ. لتصنيع السفن، كما الأوتوكلاف قوالب PDMS micropatterned، PDMS الساحات مسطحة، coverslips الزجاج (22 × 22 ملم)، وقطع القطن.
    2. تعقيم القطع PMMA السكن في التبييض لمدة لا تقل عن 1 ساعة، ثم يشطف بالماء تعقيمها في نسيج الثقافة هود مرتين، والسماح للهواء الجاف في أطباق زراعة الأنسجة عقيمة (150 ملم × 25 ملم).
  2. معقم Polyethyleneimine-غلوتارالدهيد (جزيرة الأمير إدوارد - GA) طلاء
    1. علاج الآبار الداخلية للتعقيم قطع PMMA الجافةمع البلازما لحوالي 1 دقيقة. إضافة 1٪ Polyethyleneimine (PEI) على الآبار الداخلية (20 ملم جيدا مربع على أعلى والجرف مربع 25 ملم على الجزء السفلي) من القطع PMMA لمدة 10 دقيقة. شطف مع العقيمة H 2 O والسماح ليجف في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.
      ملاحظة: الوقت اللازم للعلاج البلازما هي متغيرة تبعا الجهاز المستخدم - يجب على جزيرة الأمير إدوارد ينتشر بسهولة مما يدل على سطح ماء. إذا لم يكن كذلك، قد يكون من الضروري معالجة البلازما إضافية.
    2. تطبيق 0.1٪ غلوتارالدهيد (GA) على جزيرة الأمير إدوارد تعامل أسطح القطع PMMA لمدة 30 دقيقة. شطف مرتين مع الماء المعقم والسماح ليجف.
      ملاحظة: في الخطوات المستقبلية، والكولاجين التمسك السطح المطلي من خلال يشابك الكولاجين غلوتارالدهيد. هذا يساعد على تأمين هلام في مكان داخل الجهاز أثناء خطوات الجمعية في المستقبل وطوال الفترة الثقافة الجهاز.
  3. إعداد جل الكولاجين
    1. صنع السفن التي تستخدم 0.6٪ - 1٪ الكولاجينالحلول. لجعل 0.75٪ الكولاجين لتصنيع السفن، ومزيج من النوع الأول الكولاجين حل سهم (1.5٪ - معزولة عن الفئران ذيول 37) مع هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)، 10X وسائل الإعلام الملحق (M199)، وسائل الإعلام والثقافة الخلية. إبقاء جميع الحلول على الجليد.
    2. تحديد حجم الكولاجين عن طريق المعادلة التالية، حيث V ƒinal هو الحجم النهائي من هلام المطلوبة (عادة 1 مل من الكولاجين في الجهاز هي كافية)، والخامس الكولاجين الأسهم هو حجم الكولاجين الأسهم المطلوبة، والكولاجين الأسهم C هو تركيز من الكولاجين الأوراق المالية، وC ƒinal الكولاجين هو التركيز المطلوب من الكولاجين في السفينة.
      figure-protocol-1
    3. استخدام حقنة 1 مل لنقل حجم مناسب من الكولاجين الأسهم إلى 30 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. تحديد كميات من هيدروكسيد الصوديوم تحييد (V هيدروكسيد الصوديوم)، M199 10X ملحق سائل الإعلام(V 10 X)، وسائل الإعلام والثقافة الخلية (V 1 X) على النحو التالي وتخلط بشكل منفصل في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل:
      figure-protocol-2
    4. يضاف خليط من تحييد الكواشف (V 10 X، V هيدروكسيد الصوديوم، V 1 X) إلى الكولاجين aliquoted، واستخدام ملعقة صغيرة من المزيج بلطف الحل حتى يتم الحصول على هلام متجانسة. تجنب إدخال فقاعات عن طريق اثارة ببطء وبلطف.
    5. لدمج الخلايا في المصفوفة على التركيز المطلوب (على سبيل المثال، 0،5-20٬000٬000 خلية / مل)، إضافة الخلايا إلى حل الكولاجين بعد مزجه مع الكواشف تحييد، والاستمرار في اثارة حتى يتم توزيع خلايا متجانس.
    6. عندما تضاف الخلايا، وضبط حجم وسائل الإعلام ثقافة الخلية لاستيعاب الحجم الإضافي، على النحو الذي تحدده المعادلة التالية، حيث خلايا V </ دون> هو حجم المطلوب من تعليق الخلية، C كثافة الخلايا ƒinal هي كثافة المطلوب من الخلايا في السفينة، والكثافة C تعليق خلية هي كثافة الخلايا في المحلول.
      figure-protocol-3
  4. الكولاجين حقن - قطعة الأعلى
    1. مكان القالب PDMS micropatterned في 100 ملم × 20 ملم طبق. البلازما تنظيف العفن PDMS لمدة 1 دقيقة.
    2. محاذاة قطعة أعلى PMMA على رأس القالب PDMS بحيث الخزانات مربع على العفن هي التي تخضع مباشرة لمدخل ومخرج الخزانات (انظر الشكل 1D - الخطوط المتقطعة). وضع المقاوم للصدأ المسامير الفولاذية وتد في مدخل ومخرج الثقوب الخزان على رأس PMMA قطعة للحفاظ على وصول واضح من الخزانات إلى نمط.
    3. استخدام حقنة 1 مل لاستخراج ~ 0،5-0،6 مل الكولاجين. ضمان بقاء عدم وجود فقاعات في المحقنة.
    4. اضغط لأسفل لightly مع ملاقط على السكن كبير لضمان اتصال مطاردة بين قطعة العلوي والعفن PDMS. حقن الكولاجين ببطء من خلال منفذ الحقن في أعلى PMMA قطعة. تأكد من الكولاجين يملأ في 20 ملم نطاق × 20 مم فوق نمط ولا يتسرب.
    5. إغلاق طبق دون تتصارع المسامير وتد والسماح لهلام في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. حقن الكولاجين - قطعة القاع
    1. وضع ساترة زجاج 22 × 22 مم في وسط أسفل قطعة. استخدام حقنة 1 مل الاستغناء ~ 0.25 مل الكولاجين بالتساوي على شريحة زجاجية. انخفاض بلطف PDMS مربع مسطح على الكولاجين، وضمان PDMS مسطح ضد PMMA وعدم وجود فقاعات المحاصرين. السماح لهلام في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  6. الجمعية الجهاز
    1. بعد دبق، إضافة ما يكفي من برنامج تلفزيوني حول قطعة PDMS شقة في أسفل قطعة لتطويق PDMS (حوالي 1 مل). استخدام ملاقط لإزالة أي بريدxcess الكولاجين حول الحواف، وببطء تقشر قطعة PDMS. إضافة المزيد من برنامج تلفزيوني على رأس الكولاجين للحفاظ على الماء.
    2. لإعداد أكبر قطعة، استخدام ملاقط لالتقاط أكبر PMMA قطعة واقلبها بحيث القالب PDMS على أعلى. إضافة بضع قطرات من برنامج تلفزيوني إلى الواجهة، ثم سرعان ما وإزالة بحزم العفن PDMS من كبار PMMA قطعة.
    3. إزالة بلطف دبابيس الصلب غير القابل للصدأ المسمار من الجانب الآخر من PMMA الإسكان باستخدام زوج آخر من الملقط. إضافة عدة قطرات أكثر من برنامج تلفزيوني على الكولاجين micropatterned. الوجه PMMA قطعة أعلى أكثر من ذلك أن يواجه الكولاجين أسفل ووضع 4 مسامير في الثقوب الزاوية.
    4. وضع بلطف قطعة كبار على رأس قطعة القاع، ومواءمة مسامير مع ثقوب الزاوية على قطعة القاع. لا تسمح قطعتين إلى الانزلاق ضد بعضها البعض. استخدام مفك البراغي لتشديد الخناق استخدام لمسة رقيقة. لا تبالغ.
    5. نضح في برنامج تلفزيوني المحيطة السطوح PMMA ووضع بي الصغيرةاللجنة الاقتصادية لأوروبا من القطن تحت حافة واحدة من الجهاز. باستخدام ماصة، وإزالة أي برنامج تلفزيوني من الخزانات واستبدالها مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية. ودع الجهاز حتى هلام معا في الحاضنة 37 درجة مئوية على الأقل 1 ساعة.
  7. البذر الخلية
    1. ثقافة الخلايا البشرية الوريد السري البطانية (HUVECs) في وسائل الإعلام نمو بطانة عند 37 درجة مئوية (CO 2، O 2) لconfluency 38. كلما أمكن ذلك، استخدم بين الممرات 4 و 7.
    2. يعرض للتريبسين الخلايا البطانية عن طريق غسل القارورة الثقافة مع 6 مل من برنامج تلفزيوني ثم إضافة 2 مل من التربسين 0.05٪ عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا. ترك الخلايا في التربسين حتى أكثر من الالتصاقات البؤرية يكون فصل ويتم تقريب الخلايا حتى (وهذا يستغرق عادة حوالي 2-3 دقائق). وقف رد الفعل التربسين بإضافة 4 مل من وسائط النمو البطاني المحتوية على مصل بقري جنيني (FBS). غسل القارورة مع وسائل الإعلام عدة مرات للتأكد من فصل الخلايا من القارورة وجمعفي أنبوب مخروطي الشكل.
    3. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات و resuspend لهم في مناطق ذات كثافة من 10 مليون خلية لكل مليلتر. إزالة كافة وسائل الإعلام ثقافة الخلية من مدخل ومخرج الخزانات. باستخدام 200 ميكرولتر طرف جل التحميل وإضافة 10 ميكرولتر من تعليق خلية في وسط الخزان مدخل. وينبغي أن تبدأ الخلايا في التدفق إلى شبكة فورا ومعطف الشبكة.
    4. إضافة 200 ميكرولتر وسائل الإعلام بشكل متساو على كل من الخزانات والسماح خلايا نعلق وانتشرت داخل الشبكة لا يقل عن 1 ساعة.
  8. الثقافة الجهاز
    1. ثقافة الجهاز مع تدفق الجاذبية مدفوعة من خلال شبكة من خلال إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى خزان مدخل و 50 ميكرولتر إلى خزان منفذ. مع هذا الأسلوب الثقافة واستبدال وسائل الاعلام كل 12 ساعة للمحافظة على سلامة بطانة الأوعية الدموية.
      ملاحظة: إذا كانت الظروف الثقافة التدفق المستمر مرغوبة (للحفاظ على إجهاد القص المستمر، وجمع وسائل الاعلام عند مخرج، الخ) وSYRويمكن استخدام إنجي مضخة بدلا من ثقافة الجاذبية مدفوعة.
    2. السماح للخلايا البطانية المصنف 24 على الأقل ساعة لنعلق وتستقر قبل تطبيق التدفق المستمر. قبل الإعداد تدفق مستمر، والحفاظ على الأجهزة مع خطورة مدفوعة ظروف التدفق.
      ملاحظة: شروط وسائل الاعلام لتدفق التطبيقية تختلف من ثقافة الجاذبية مدفوعة. إضافة المتوسع البلازما، مثل ديكستران، إلى وسائل الإعلام تستقر microvessels هندسيا ويمنع انهيار الأوعية الدموية خلال نضح المستدام 39.
    3. جعل وسائل الإعلام من أجل الإعداد تدفق مستمر، حل 3.5٪ ديكستران (70 كيلو دالتون) في وسائل الإعلام نمو بطانة للثقافة سفينة المثلى. باستخدام تقنية معقمة، وملء 10 مل المحاقن مع وسائل الاعلام نمو الخلايا البطانية مع 3.5٪ ديكستران.
    4. إعداد طبق ثقافة عقيمة لتدفق ذوبان ثقوب في الجدار الجانبي من طبق بيتري باستخدام حام الحديد.
    5. نعلق 12 "السيليكون أنابيب (1/32" ID) لقفل اقتران لور (أنثى، 1/16 "ID)، و 1 /16 "على التوالي أنبوب موصل إلى أنبوب مع 1" جزء من الأنابيب على الطرف الآخر. إدراج "إبرة حادة 20G (بعيدة عن محور إبرة) إلى نهاية خالية من 1" 1/4 القطاع. أيضا بإعداد "الجزء 3 من أنابيب موصولة إلى أنبوب إلى أنبوب 90 درجة موصل الكوع مشتركة (لتركيبها في مدخل السكن). وفي خطوات لاحقة، سيتم الخيوط أنابيب أطول من خلال طبق استعداد وتعلق على 3 "الجزء عن طريق إبرة G 20. أنابيب المخرج يجب أن تعكس أنابيب مدخل، مع نهاية خالية بدلا من قفل اقتران لور. الأوتوكلاف جميع شرائح قبل استخدامها.
    6. كاتب الموضوع مدخل تعقيمها وأنابيب مخرج من خلال ثقوب في الطبق المعد. نعلق 3 "شرائح لالداخلية 20 الإبر G. إرفاق قفل اقتران لور إلى حقنة مليئة سائل الإعلام ويروي وسائل الاعلام من خلال الأنبوب باستخدام ضخ حقنة وضعت في معدل تدفق عالية. تأكد من عدم وجود فقاعات في أنابيب أو وصلات، وهذه سوف تعيق تدفق للسفينة.
    7. إدراج جonnector مشتركة في مدخل السكن. تعيين ضخ حقنة لمعدل التدفق المطلوب والبدء نضح.
      ملاحظة: هذه يمكن تعديلها تبعا لهندسة السفن والظروف التجريبية من اجهادات القص المطبقة. لقناة قطر 100 ميكرون، ومعدل التدفق من 3 ميكرولتر / دقيقة يعمل بشكل جيد.
    8. إذا رغبت في ذلك، وجمع سائل الإرواء مع أنابيب منفذ استعداد إدراجها في العقيمة البوليسترين 5 مل أنبوب أسفل جولة تحتوي على 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام.
      ملاحظة: يتم إضافة كمية صغيرة من وسائل الإعلام إلى أنبوب جمع لمنع تشكيل فقاعة التي يمكن منع التدفق.
    9. اعتمادا على معدل التدفق، قد تحتاج إلى إعادة ملئها بعد 24 إلى 36 ساعة الحقنة. ويتم ذلك عن طريق إزالة الموصل من مدخل السكن، لتحل محل حقنة، والسماح لوسائل الإعلام ليروي بمعدل تدفق عالية لعدة دقائق. هذا التسلسل يضمن أن الفقاعات لا أدخلت على الأنابيب. إعادة تعيين المضخة إلى معدل التدفق المطلوب للثقافة وإدراج الموصل في مدخل السكن، والعودة إلى الحاضنة.

تحليل 4. جهاز

  1. تحليل نفاذية
    1. استخدام 40 كيلو دالتون FITC-ديكستران لتصور نفاذية السفينة في الموقع. وضع الإسكان سفينة على المجهر متحد البؤر والتركيز على الطائرة السفينة. إضافة 5 ميكرومتر 40 كيلو دالتون FITC-ديكستران إلى مدخل والصورة في 4X التكبير، 25 مللي ثانية وقت التعرض، وفي 1 إطار في الثانية لمدة 10 دقيقة.
    2. تحليل سلسلة صورة مع رمز تحليل لتقدير نفاذية ديكستران عبر جدار الوعاء الدموي في الكولاجين (ميكرون / ثانية) على أساس نموذج نشرتها تشنغ وآخرون. آل 31.
  2. تحليل المناعية ومتحد البؤر التصوير
    1. لإصلاح السفن، يروي مع 3.7٪ الفورمالديهايد من خلال مدخل لمدة 20 دقيقة ويغسل من قبل perfusing برنامج تلفزيوني ثلاث مرات (20 دقيقة لكل غسل). كتلة الأجسام المضادة غير محدد ملزم مع 2٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 0.5٪ تريتون X-100 بيrfused من خلال الشبكة لمدة 1 ساعة. يروي حلول الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. يروي حلول الأجسام المضادة الثانوية 1 - 2 ساعة، ويغسل مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني بنفس الطريقة.
    2. التقاط صور المناعي من microvessels في الموقع باستخدام المجهر متحد البؤر مع خطوة ض 1 ميكرون. صورة microvessels في التكبير من 4X، 10X، أو 20X.
      ملاحظة: سوف التكبير من 4X تقديم معلومات هيكل الشبكة العالمية، في حين 10X 20X والصور المكبرة ستقدم تفاصيل الخلوية مثل استطالة، وتشكيل تقاطع، الخ.
    3. تحليل مداخن صورة باستخدام يماغيج مع التوقعات Z (صورة / الأكوام / Z-المشروع)، المقاطع العرضية (صورة / عرض الأكوام / متعامد)، وإعادة البناء 3D (صورة / الأكوام / مشروع 3D).
  3. المجهر الإلكتروني التصوير
    1. لتحليل المجهر الإلكتروني، وتحديد في الموقع من قبل perfusing نصف القوة سول Karnovsky لution (2٪ امتصاص العرق / 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.2 م العازلة كاكوديلات) بين عشية وضحاها. تفكيك السفينة وفصل بعناية قطعتين. تقليم حواف وتزج تماما في حل تثبيتي لعدة أيام.
    2. تزج الجزء العلوي سميكة من السفينة في 25٪ غلوتارالدهيد لمدة 20 دقيقة وشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (2 دقيقة لكل منهما). يذوى في يغسل الإيثانول المسلسل من 50٪، 70٪، 85٪ (2 دقيقة لكل منهما) واثنين من يغسل في الإيثانول٪ 100 (5 دقائق لكل منهما).
    3. تحضير العينة للتحليل مع مزيد من الجفاف عن طريق التجفيف نقطة حرجة بعد بروتوكول الشركة المصنعة 40. تفل معطف السفينة مع الذهب والبلاديوم (7 نانومتر) وتحليل تحت المجهر الإلكتروني الماسح مع الجهد المتسارع لل5 كيلو فولت، حجم البقعة 3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

منصة سفينة المهندسة يخلق الأوعية الدموية الدقيقة وظيفي جزءا لا يتجزأ من ضمن نوع الكولاجين الطبيعي أنا المصفوفة، ويسمح لرقابة مشددة من البيئة الخلوية، الفيزيائية الحيوية والكيمياء الحيوية في المختبر. لافتعال microvessels هندسيا، و perfused الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVECs) من خلال شبكة ميكروفلويديك جزءا لا يتجزأ من الكولاجين حيث نعلق على تشكيل التجويف براءات الاختراع والبطانة متموجة. كما هو موضح في الشكل 1A-C، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

microvessels المهندسة هي نموذج في المختبر حيث الخصائص الفسيولوجية مثل الهندسة اللمعية، قوات الهيدروديناميكية، والتفاعلات متعددة الخلايا موجودة والانضباطي. هذا النوع من منصة قوية لأنه يوفر القدرة على نموذج ودراسة السلوك البطانية في مجموعة متنوعة من السياقات التي يمكن أن تكون مطابقة في المختبر الظروف والثقافة إلى أن من المكروية في السؤال. على سبيل المثال، وآليات القيادة عمليات البطانية، مثل الأوعية الدموية، ومن المعروف أن تحدث بشكل مختلف في مختلف الأجهزة وفي الحالا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أنوه لين ومختبر التصوير غارفي مايك في معهد الخلايا الجذعية والطب التجديدي وكذلك مرفق واشنطن Nanofabrication في جامعة واشنطن. كما ينوه بالدعم المالي من المعهد الوطني للصحة منح DP2DK102258 (لYZ)، والتدريب يمنح T32EB001650 (لSSK وMAR) وT32HL007312 (لMAR).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>تصنيع الرقاقة< قوي>
نظام البلازما القويAutoGlow
Headway Spin CoaterHeadway Research, Inc PWM32 تدور المغطى 
ABM Contact AlignerABM
Alpha Step ProfilometerTencorAlpha Step 200
SU-8 DeveloperMicrochemY020100
SU-8 ResistMicrochemSU-8 2000
8 "رقاقة السيليكونWafer World Inc.
منضدية مايكرو نمط مولدهايدلبرغ للأدوات& PG 101لتوليد قناع ضوئي
صفيحة ساخنةVWR97042-646
كحول إيسوبروبيلأفانتور مواد الأداء9088
أطباق بتري (120 × 120 مم ، مربع)سيجما ألدريتشZ617679
ثلاثي كلورو (3،3،3-ثلاثي فلورو بروبيل) سيلانسيجما ألدريتشMKBG3805V
قاعدة مطاط معدني بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) وعامل المعالجةDow CorningSylgard 184مختلط عند 10: 1 (مع / وزن)
مجفف الفراغSigma-AldrichZ119024-1EA
فرنVWR9120976 <
قوي > تصنيع الجهاز وثقافته < / قوي >
بولي (ميثيل ميثاكريلات) (PMMA) معالجزجاجي
كورونامنتجات الكتروتكنيك ، وشركةBD-20جهاز محمول لمعالجة البلازما لأجهزة PMMA وقوالب PDMS
لحام الحديدWeller WTCPS
الفولاذ المقاوم للصدأ تروس رئيس مشقوق آلة برغيMcMaster-Carr  91785A096
المقاوم للصدأ وتد دبابيسماكماستر كار 93600A060
ملاقط  Miltex24-572يمكن استخدام أي ملاقط مماثلة
ملعقة (ملعقة صغيرة)خدمات المجهر الإلكتروني62410-01
مفكاستخدام أي مفك براغي مسطح الرأس ،
أغطية زجاجية معقمة (22 × 22 مم)أطباق بيتر فيشر سيانتيفيك12-542B
BleachClorox4460030966
Petri (150 × 25 مم)كورنينج430599
بتري (100 × 20 مم)قطن كورنينج2909
، مقطع إلى قطع
بولي إيثيلين معقمة (PEI)سيجما-ألدريتشP3143مخفف إلى 1٪ في ماء بدرجة زراعة
الخلايا غلوتارالديهايدسيجما-ألدريتشG6257مخفف إلى 0.1٪ في ماء
درجة زراعة الخلايامعقم H2< / sub>Oمعقمة DI H2< / sub>O
من النوع الأول من الكولاجين ، مذاب في 0.1٪ حمضمعزول من ذيول الفئران كما هو موضح في Rajan et. al.< / i> 2006 (المرجع # 37)
1 مل حقنةBD309659
10 مل حقنةBD309604
15 مل أنابيب مخروطيةCorning352097
أنابيب مخروطية 30 مل Corning352098
M199 10x Media تقنيات الحياة11825-015
1 N هيدروكسيد الصوديوم (معقم)سيجما ألدريتش415413تمييع إلى 1 نيوتن في مائي من درجة
زراعة الخلايا HUVECsلونزا
وسائط نمو البطانيةلونزاCC-3124
تريبسينكورنينج25-052-CI
مصل بقري الجنين (FBS)10082147 علمي Thermofisher
ديكستران من Leuconostoc spp. (70   كيلو دالتون)سيجما ألدريتش31390
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)كورنينج21-031-CV
الدمهوسر علمية3200
نصائح تحميل هلامVWR37001-152
18 G Blunt Fill NeedleBD & nbsp ؛305180
20 جرام إبرة الاستغناء عن الفولاذ المقاومماكماستر كار75165A123
Tygon 1/32 " معرف ، 3/32 "OD أنابيب السيليكونكول بارمرEW-95702-00
1/16 "أنبوب إلى أنبوب اقترانماكماستر كار5116K165
90 درجة ؛ موصلات الكوع ، أنبوب إلى أنبوبماكماستر كار5121K901
لوير قفل اقتران (أنثى ، 1/16 "معرف)McMaster-Carr51525K211
ملقط بلاستيكي ، مع قبضة الفكخدمات المجهر الإلكتروني72971
مضخة حقنة مزدوجةهارفارد70-4505
5 مل بوليسترين أنبوب دائري القاعفيشر العلمي14-959-2A
< قوي > تحليل الجهاز < / قوي >
الفورمالديهايدسيجما ألدريتشF8775
ألبومين مصل الأبقارسيجما ألدريتشA8806-5G
تريتون X-100سيجما ألدريتشT-9284
أرنب مضاد ل hCD31Abcamab324571:25 تخفيف العمل
FITC مترافق المضاد فون ويلبراند عامل الجسم المضادAbcamab88221:100 تخفيف العمل
الماعز المضاد للأرانب 568 الجسم المضادالثانوي Thermofisher ScientificA-110111:100 تخفيف العمل
HoeschtThermofisher ScientificH1399معلق في DMSO
الصوديوم cacodylate  Sigma-AldrichC0250لصنع 0.2 M cacodylate buffer
EthanolVWR InternationalBDH1164-4LP
40 kDa DextronSIGTA Sigma-AldrichFD40S & nbsp ؛
<قوي>كواشف ثقافة إضافية  < / قوي>
CHIR-99021Selleck ChemS2924مثبط جزيء صغير GSK-3
مؤتلف بشري VEGFPeprotech100-20
مؤتلف بشري bFGFPeprotechAF-100-18B
الفولاذ براغي يمكن أطباق 1 سم × 3 سم الأسيتيك محلول مقياس للصدأ

المراجع

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7 (3), e1000245(2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757(2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858(2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2(2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

PDMS
Micropatterning وجمعية Microvessels 3D
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.