مقالة منهجية

إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات

14.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54463

⸱

سبتمبر 20, 2016

 ,  , 
1The Bridge Institute, University of Southern California, 2Department of Chemistry, University of Southern California, 3School of Molecular Sciences, Center for Applied Structural Discovery at the Biodesign Institute, Arizona State University

في هذه المقالة

ملخص

نصف إجراءات تحضير وتسليم البلورات الدقيقة للبروتين الغشائي في الطور المكعب الدهني لعلم البلورات التسلسلي في ليزر الإلكترون الحر بالأشعة السينية ومصادر السنكروترون. يمكن أيضا تطبيق هذه البروتوكولات لدمج وتسليم بلورات البروتين الدقيقة القابلة للذوبان ، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في استهلاك العينة مقارنة بالحقن السائل.

الملخص

بروتينات غشاء (النواب) هي المكونات الأساسية لأغشية الخلوية والأهداف المخدرات الأولية. تصميم الرشيد للأدوية تعتمد على المعلومات الهيكلية الدقيقة، التي تم الحصول عليها عادة من قبل البلورات. لكن النواب من الصعب بلورة. وقد استفاد التقدم الذي أحرز مؤخرا في تقرير النائب الهيكلي كثيرا من تطوير أساليب شحمي المرحلة مكعب (نظام الإجراءات الجزائية) التبلور، والتي تسفر عادة الانعراج جيدا، ولكن البلورات غالبا ما تكون صغيرة التي تعاني من أضرار الإشعاع أثناء جمع البيانات البلورات التقليدي في مصادر السنكروترون. وقد مكن تطوير مصادر التي تنتج نبضات الفيمتو ثانية مشرق للغاية الجيل الجديد من أشعة ليزر الإلكترون الحر (XFEL) غرفة جمع البيانات درجة الحرارة من microcrystals مع عدم وجود أو أضرار الإشعاع يكاد يذكر. وقد أسفرت جهودنا الأخيرة في الجمع بين التكنولوجيا نظام الإجراءات الجزائية مع البلورات الفيمتو ثانية مسلسل (نظام الإجراءات الجزائية-SFX) في هياكل عالية الدقة من عدة G مستقبلات البروتين يقترن الإنسان، ثهيك تمثل هدفا بالغ الصعوبة لتحديد هيكل. في تقنية نظام الإجراءات الجزائية، SFX، يتم تجنيده نظام الإجراءات الجزائية في شكل مصفوفة لكل من النمو وتقديم microcrystals النائب إلى تقاطع مجرى حاقن مع شعاع XFEL لجمع البيانات البلورات. وقد ثبت أن نظام الإجراءات الجزائية-SFX يمكن أن تحسن بشكل كبير من قرار الحيود عندما تكون فقط 10 جنوب ميكرون بلورات المتاحة، أو عندما لا يمكن للاستخدام بلورات صغيرة في درجة حرارة الغرفة التغلب على مختلف المشاكل المرتبطة بلورات cryocooled أكبر، مثل تراكم العيوب، mosaicity عالية والتحف cryocooling. يجب التقدم في المستقبل في مصادر الأشعة السينية والتكنولوجيات كاشف جعل البلورات مسلسل جذابة للغاية وعملي للتنفيذ وليس فقط في XFELs، ولكن أيضا في beamlines السنكروترون أكثر يسرا. هنا نقدم بروتوكولات البصرية التفصيلية لإعداد وتوصيف وتسليم microcrystals في نظام الإجراءات الجزائية للتجارب البلورات التسلسلية.وتشمل هذه البروتوكولات طرق لإجراء التجارب تبلور في الحقن وكشف وتميز العينات وضوح الشمس، وتحسين كثافة وضوح الشمس، وتحميل بلورة مكروية نظام الإجراءات الجزائية لادن في الجهاز حاقن وتقديم نموذج لشعاع لجمع البيانات.

المقدمة

الأشعة السينية البلورات هي الأسلوب الأكثر نجاحا حتى الآن عن حل هياكل ذرية قرار من بروتينات الغشاء (النواب). تبلور من mesophases شحمي، المعروف أيضا باسم مرحلة مكعب شحمي (نظام الإجراءات الجزائية)، أو في بلورة المتوسط، تمثل واحدة من أهم التطورات في علم البلورات النائب الذي مكن تحديد هيكل عالية الدقة من الأهداف الصعبة مثل G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs ) 1. جعلت التطورات الأخيرة في الأدوات والتقنيات نظام الإجراءات الجزائية هذه التقنية المتاحة لمجتمع كبير من علماء الأحياء الهيكلية في جميع أنحاء العالم 2. ومع ذلك، في كثير من الحالات بلورات النائب التي تشكل في نظام الإجراءات الجزائية هي صغيرة جدا بحيث لا يمكن استخدامها حتى في أكثرها تقدما beamlines microfocus السنكروترون، حيث تعاني عينات من أضرار الإشعاع الشديد وتدهور قبل إشارة كافية بدقة عالية يمكن الحصول عليها 3.

نهج جديد لجمع بيانات البلوراتتم تمكين مع بدء تشغيل أول أشعة ليزر الإلكترون الحر (XFEL). وتستند هذه الطريقة على مبدأ "حيود قبل تدميرها"، لأول مرة نظريا 4 ثم أكدت التجربة على عينات بيولوجية في Linac المتماسك مصدر الضوء (LCLS) 3، الشركة الرائدة في العالم في XFELs الصعب. وXFEL يولد عالية السطوع نبضات الأشعة السينية في بضع عشرات من مدة الفيمتو ثانية التي حيد الضوء من الكريستال البكر قبل ذرات البروتين يمكن ان تتحرك استجابة لأضرار الإشعاع. في التجارب الأولية، التي تم توفيرها microcrystals باستمرار إلى التقاطع مع شعاع XFEL في تيار مائي تنتجها حاقن السائل 5. ويعرف هذا الإعداد التجريبية كما البلورات الفيمتو ثانية مسلسل (SFX). العيب الرئيسي لاستخدام الحقن سائل لSFX هو نسبتهم تدفق عالية، الأمر الذي يتطلب بالتالي عشرات إلى مئات من ملليغرام من البروتين النقي لجمع مجموعة بيانات كاملة. من خلال خطة الإدارة البيئيةloying حاقن خاص التي يمكن التعامل مع العينات نظام الإجراءات الجزائية تشبه الهلام (نظام الإجراءات الجزائية microextrusion حاقن) 6، سلمنا بنجاح microcrystals عدة GPCRs البشرية المختلفة التي تزرع في مصفوفة الإجراءات الجزائية والتي تم الحصول عليها هياكل عالية الدقة من 6-9، مع انخفاض كبير في البروتين الاستهلاك إلى أقل من 0.3 ملغ لكل مجموعة البيانات. يتكون حاقن من خزان التي يمكن أن تعقد ما يصل إلى 20 أو 40 أو 100 ميكرولتر من نظام الإجراءات الجزائية وضوح الشمس لادن والشعرية الضيق (10-50 ميكرون في القطر) التي يتم من خلالها مقذوف العينة من خلال تطبيق الضغط العالي (تصل إلى 10،000 رطل) من المكبس الهيدروليكي مع مرحلة الضغط تضخيمها، يقودها السائل من مضخة HPLC (عالية الأداء اللوني السائل). استقر تيار من نظام الإجراءات الجزائية التي تخرج من فوهة الشعرية تدفق مواز للغاز متأخرا (عادة الهليوم أو النيتروجين).

هنا نقدم المظاهرات البصرية من الخطوات اللازمة لإعداد وتوصيف العيناتلتجربة نظام الإجراءات الجزائية-SFX. مزيد من التفاصيل يمكن العثور عليها في البروتوكولات نشرت 10. وكمثال على ذلك، سوف نستخدم الأدينوزين متلقي 2A 11 و تحضير بلورات من هذا البروتين في نظام الإجراءات الجزائية لجمع بيانات الأشعة السينية باستخدام نهج SFX. في حين بروتوكولات لدينا هي متوافقة مع أي حاقن قادر على الجري نظام الإجراءات الجزائية لجمع البيانات عن طريق البلورات التسلسلية في مصادر XFEL والسنكروترون، لأغراض التوضيح، سوف نستخدم حاقن نظام الإجراءات الجزائية وصفها في المرجع. 6. شروط مرسب الأمثل التي تنتج microcrystals ذات الكثافة السكانية العالية في نظام الإجراءات الجزائية يجب أن تحددها الإنتاجية العالية تبلور فحص 12،13 قبل الشروع في هذا البروتوكول. ويرد مخطط نموذجي لهذا البروتوكول في الشكل 1.

البروتوكول

1. حلول تصفية والدهون

ملاحظة: جميع الكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول يجب أن تكون نظيفة قدر الإمكان لتجنب إدخال ملوثات الجسيمات في العينات، التي يمكن أن تسد حاقن نظام الإجراءات الجزائية.

  1. تصفية كل الحلول مرسب والدهون المنصهرة خلال 5 ميكرون مرشحات تدور باستمرار. المحاقن نظيفة تماما وتنطبق الهواء المضغوط لتجف. اختياريا، واستخدام المحمول غطاء غرفة نظيفة لمنع محاصرة جزيئات الغبار أو الألياف خلال إجراءات إعداد العينات.

2. إعادة إعماره النائب في نظام الإجراءات الجزائية

ملاحظة: إن اختيار أفضل الدهون المضيف نظام الإجراءات الجزائية لبلورة يعتمد على النائب الهدف، وعادة ما يتم تحديدها خلال دهن المضيف المحاكمات فحص تبلور 14. Monoacylglycerols (أكواب) تمثل الطبقة الأكثر شيوعا من الدهون المستخدمة في نظام الإجراءات الجزائية تبلور 15. وتستند البروتوكولات المتعلقة باستخدام 9.9 MAG (monoolein) كما فياستضافة الدهون، حيث أن هذه هي الدهون الأكثر نجاحا لفي المتوسط ​​تبلور حتى الآن 16. يمكن أن تكون بديلا 9.9 MAG من الدهون المضيف نظام الإجراءات الجزائية الأخرى أو خليط من الدهون بعد مراعاة الاختلافات في السلوك مرحلتها. على سبيل المثال، في حالة GPCRs، وعادة ما مخدر monoolein مع الكولسترول لاستقرار مستقبل. هنا، استخدم 9: 1 (ث / ث) 9.9 MAG: الكولسترول خليط مثل الدهون المضيف.

  1. مزيج استهداف النائب، الذي يتم تنقيته في حل المنظفات مذيلة، مع دهن المضيف نظام الإجراءات الجزائية المناسبة باستخدام اثنين من الحقن (رقم 1 ورقم 2) والحشد، كما هو موضح سابقا (13).
  2. لفترة وجيزة، تحميل حقنة # 1 مع الدهن المنصهر والمحاقن رقم 2 مع الحل النائب. استخدام النسبة بين الدهن وحل النائب مائي المقابلة إلى المستوى الذي هو أقل بقليل من قدرة الماء القصوى من الدهون المضيف نظام الإجراءات الجزائية المقابلة، على سبيل المثال، 3: 2 ت / ت الدهون / الحل النائب عن 9.9 MAG، 1: 1 ت / ت الدهون حل / النائب عن معظم الدول الأخرى أكواب سلسلة أقصر (7.9 MAG9.7 MAG، وما إلى ذلك).
  3. توصيل الحقن من خلال مقرنة حقنة والبدء في خلط المواد بالضغط على الغطاسون لتحريك خليط ذهابا وإيابا بين الحقن، حتى تصبح العينة متجانسة وشفافة. إعداد ما يقرب من 50 ميكرولتر من عينة نظام الإجراءات الجزائية لجمع مجموعة بيانات كاملة عن طريق نظام الإجراءات الجزائية-SFX. فإن حجم العينة النهائي تزيد عادة من قبل ما يقرب من عامل من اثنين (إلى ~ 100 ميكرولتر) بعد توحيد عينة والمعايرة الدهون (القسم 5).

3. إعداد تبلور في الحقن

  1. بعد يتم تشكيل نظام الإجراءات الجزائية شفاف ومتجانس، نقل العينة بأكملها إلى حقنة # 2. فصل حقنة رقم 1، مع الحفاظ على مقرنة متصلة حقنة # 2.
  2. توصيل إبرة القابلة للإزالة (26S مقياس) إلى 100 ميكرولتر آخر حقنة نظيفة (حقنة رقم 3)، ونضح ما يقرب من 70 ميكرولتر من محلول مرسب في ذلك. تكوين حل مرسب الذي يقوم بتشغيل وormation الوقود النووي من microcrystals عالية الكثافة هي فريدة من نوعها لكل هدف النائب وينبغي أن تحدد قبل الشروع في هذه البروتوكولات. هنا، استخدام مرسب تكوين الحل الأمثل أن ينتج الاستحمام من microcrystals من مستقبلات و2A (40 ملم الصوديوم ثيوسيانات، 100 ملي سترات الصوديوم الهيدروجيني 5، 26-28٪ PEG400).
  3. قطع الإبرة من المحاقن # 3 مع الحفاظ على الطويق تفلون داخل الحقنة.
  4. توصيل الحقن رقم 2 ورقم 3 خلال مقرنة، والتأكد من أن الحلقات تفلون هي بشكل صحيح في كلا الحقن. المسمار بعناية مقرنة بإحكام في الموقف.
  5. الشرق الحقن المترابطة عموديا مع حقنة # 2 في الجزء السفلي وحقن عينة نظام الإجراءات الجزائية البروتين لادن من حقنة # 2 في حقنة # 3 ببطء ولكن بثبات حتى تلامس سلسلة الإجراءات الجزائية المكبس من حقنة # 3. ستبلغ حجم نظام الإجراءات الجزائية حقن حوالي 1/10 من حجم الرواسب الأولي في حقنة # 3 (~ 7 ميكرولتر). التحقق من حجم قبل على نطاق والقراءة على حد سواء بسورياnges (يجب على الغطاسون يتحرك بنحو 7 ميكرولتر).
  6. قطع الاتصال حقنة # 2. مقرنة الآن يرتبط فقط إلى حقنة رقم 3 الذي يحتوي على عينة مغمورة في محلول مرسب.
  7. استخدام بارافيلم لختم تماما حقنة # 3، بما في ذلك واجهة حقنة الغطاس، في نهاية الافتتاحية للمقرنة والجوز إبرة. ختم ناقصة خلال هذه الخطوة يمكن أن يسبب الظروف مرسب لتغيير وعينة ليذوى.
  8. كرر الخطوات من 3،3-3،7 لاقامة تبلور في 6 الحقن إضافية (# 4- # 9) باستخدام ما مجموعه ~ 50 ميكرولتر من عينة نظام الإجراءات الجزائية (~ 7 ميكرولتر من نظام الإجراءات الجزائية في كل حقنة).
  9. متجر مختومة الحقن في كيس قابل للغلق البلاستيكية التي تحتوي على واحد أو اثنين من الأنسجة تنظيف خالية من الألياف قبل ينقع بالماء لحماية ضد عينة الجفاف. ختم حقيبة وتخزين المحاقن في 20 درجة مئوية الحاضنة أثناء نمو البلورات.

4. كشف كريستال

  1. إزالة المحاقن من الحاضنة لصورة LCعينات P مباشرة داخل المحاقن (# 3- رقم 9) كل 12-24 ساعة تحت مجهر تشريحي مع الضوء عبر الاستقطاب. تحديد البلورات كما جزيئات لامعة معبأة بإحكام، أو في حالة وضوح الشمس الحجم أصغر كما توهج موحد من خيوط نظام الإجراءات الجزائية.
  2. إعادة الحقن مختومة إلى حقيبة، وتخزينها في 20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

5. توطيد عينة والمعايرة مع 7.9 MAG

ملاحظة: الخطوة الدهون المعايرة هو موضح هنا تخدم غرضين: أ) لاستيعاب حل مرسب الزائد وب) لمنع الدهون تجميد على الحقن في شعاع XFEL. عندما يتم حقن عينة نظام الإجراءات الجزائية تتألف من 9.9 MAG في فراغ الغرفة لجمع البيانات، يمكن التبخر مكثف تبريد العينة وصولا الى درجات حرارة أقل من درجة حرارة مرحلة التوازن الانتقالية (~ 18 درجة مئوية)، وتحويل أجزاء من العينة في المرحلة البلورية رقائقي (قانون العمل). هذه البقع من مرحلة LC، عندما ضرب من قبل شعاع، تنتج diffr مسحوق مكثفحلقات العمل التي يمكن أن تلحق الضرر كاشف حساس 6، مثل كورنيل-SLAC كشف بكسل مجموعة (CSPAD). المعايرة 9.9 عينة MAG مع الدهن سلسلة أقصر (9.7 MAG أو 7.9 MAG) يخفف هذه المشكلة، حيث أن هذه الخلطات لديهم انخفاض درجات الحرارة مرحلة انتقالية. هنا، نحن تصف المعايرة من نظام الإجراءات الجزائية التي تتألف من 9.9 MAG مع MAG 7.9. عندما يتم استخدام أكواب سلسلة أقصر (9.7 MAG، 7.9 MAG، الخ) لبلورة أو عندما يتم جمع البيانات البلورات التسلسلية في الضغط المحيط المعايرة في خطوة 5.11 لا يزال مطلوبا، ولكن يمكن تنفيذها باستخدام الأصلي الدهون المضيف نظام الإجراءات الجزائية المستخدمة ل بلورة.

  1. عن 1 ساعة قبل بدء جمع البيانات، وإزالة المحاقن مع عينات من 20 درجة مئوية الحاضنة.
  2. حدد 2-4 الحقن لتوحيد عينة بناء على مظهر الكريستال مماثلة وتشابه ظروف التبلور.
  3. إزالة بعناية بارافيلم ختم من الحقن المحدد.
  4. إزالةمقرنة حقنة ونعلق إبرة القابلة للإزالة نظيفة (26S مقياس) إلى الحقنة التي تم اختيارها أولا. بلطف وببطء دفع المكبس إلى الأمام للضغط على مرسب من خلال إبرة في أنبوب microcentrifuge. توخى الحذر في هذه الخطوة لتطبيق الضغط العالي على المكبس في هذه الخطوة يمكن إخراج بعض من نظام الإجراءات الجزائية لادن وضوح الشمس جنبا إلى جنب مع حل مرسب، مما يؤدي إلى فقدان جزئي أو كامل من العينة.
  5. وقف الغطاس عند معظم مرسب تمت إزالة والتي تراكمت لديها نظام الإجراءات الجزائية عند مدخل إبرة.
  6. كرر الخطوة 5،4-5،5 مع الحقن مختارة أخرى.
  7. لتعزيز عينات نظام الإجراءات الجزائية الناتجة، ربط اثنين من الحقن معا من خلال الحشد نظيفة.
  8. كساد الغطاس على حقنة واحدة لنقل العينة كلها من واحدة من الحقن إلى آخر.
  9. فصل حقنة فارغة.
  10. كرر الخطوات من 5،7-5،9 لتوحيد جميع من مادة الكريستال نظام الإجراءات الجزائية لادن من قبل 03:58المحاقن -selected في حقنة واحدة. إزالة الكثير من الرواسب وقت ممكن.
  11. إضافة ~ 5 ميكرولتر من 7.9 MAG أو سلسلة أقصر الأصلي الدهون المضيف MAG إلى حقنة فارغة. ربط هذا حقنة لالحقنة مع العينة المجمعة خلال مقرنة حقنة وتخلط بالضغط بدلا من ذلك الغطاسون حقنة. كرر حتى يمتص كل حل المتبقية وتشكيل نظام الإجراءات الجزائية متجانسة وشفافة. المبلغ النهائي من نظام الإجراءات الجزائية بعد المعايرة يمكن أن تختلف 20-35 ميكرولتر اعتمادا على حجم والرواسب الزائدة وتكوينها.
  12. نقل كامل عينة نظام الإجراءات الجزائية المختلطة في حقنة واحدة وفصل حقنة فارغة.

6. توصيف Microcrystals

  1. نعلق إبرة نظام الإجراءات الجزائية حاقن تحميل (نمط النقطة 3، وقياس 22 بوصة واحدة في الطول) إلى الحقنة مع عينة الموحدة.
  2. بعناية إخراج ~ 1 ميكرولتر من العينة نظام الإجراءات الجزائية على شريحة زجاجية وتغطية ذلك مع زلة غطاء زجاجي. اضغط بلطف علىتغطية زلة لشطيرة العينة.
  3. التقاط صور من العينة نظام الإجراءات الجزائية تحت المجهر ستيريو على أعلى التكبير ممكن (عادة 100X) باستخدام الإضاءة مشرق الميدان والمستقطبات متقاطعة. إذا كان ذلك ممكنا، التقاط صور إضافية باستخدام مجهر الأشعة فوق البنفسجية ومضان وSONICC (الثانية بالدفع اللاخطية التصوير من بلورات مراوان) 17 تصوير لتأكيد وجود microcrystals بروتين في العينة.
  4. تقدير حجم وضوح الشمس وكثافة 10. فإن كثافة الكريستال مثالية لتجربة جمع البيانات تعتمد على حجم وضوح الشمس، وقطره من شعاع الأشعة السينية وقطر مجرى نظام الإجراءات الجزائية، ويجب أن تؤدي إلى معدل إصابة الكريستال حوالي 10-40٪.

7. تعديل كريستال الكثافة

ملاحظة: إذا وجدت كثافة وضوح الشمس في الخطوة 6.4 مرتفعة جدا، مما أدى إلى نسبة كبيرة من الزيارات الكريستال متعددة، يجب أن تضعف بلورات باتباع الخطوات الموضحة أدناه لتحسينعينة لجمع البيانات. إذا كانت كثافة وضوح الشمس منخفضة جدا لجمع البيانات بكفاءة في جميع عينات مستعدة، ثم ظروف النمو وضوح الشمس ينبغي إعادة الأمثل، حيث لا يوجد طريقة يمكن الاعتماد عليها لتركيز بلورات النائب في نظام الإجراءات الجزائية.

  1. إعداد المبلغ المطلوب من نظام الإجراءات الجزائية أنيق لاستخدامها في التخفيف عن طريق محاكاة تكوين نظام الإجراءات الجزائية (نفس الدهون والرواسب) من العينة الأصلية مع البلورات التي تحتاج إلى أن تضعف.
  2. نقل كافة الإجراءات الجزائية أنيق في حقنة واحدة. فصل حقنة فارغة ولكن ترك مقرنة اتصال.
  3. إزالة الإبرة من المحاقن التي تحتوي على عينة نظام الإجراءات الجزائية مع microcrystals. ربط حقنة العينة إلى حقنة تحتوي على نظام الإجراءات الجزائية أنيق من خلال مقرنة.
  4. خلط محتويات الحقن عن طريق دفع ذهابا وإيابا من خلال مقرنة حتى يتحقق التجانس.
  5. كرر القسم 6 إلى إعادة تقييم كثافة بلورة مكروية في العينة المعدلة.

8. نظام الإجراءات الجزائية الحاقن تحميل لالثانية نظام الإجراءات الجزائية-SFX جمع البيانات

  1. قطع مقرنة من المحاقن مع عينة ونعلق إبرة 1 "تحميل إلى الحقنة.
  2. نقل 20-40 ميكرولتر من العينة إلى خزان حاقن نظام الإجراءات الجزائية.
  3. إدراج حاقن نظام الإجراءات الجزائية في حجرة العينة 18، بدء حاقن، وضبط معدل تدفق وجمع البيانات نظام الإجراءات الجزائية-SFX.

9. دمج القابلة للذوبان بلورات البروتين في نظام الإجراءات الجزائية

ملاحظة: استخدام وسائل الإعلام لزجة جدا، مثل نظام الإجراءات الجزائية، للتسليم من بلورات من البروتينات القابلة للذوبان يسمح احد لتقليل بشكل كبير من استهلاك البروتين في تجربة البلورات التسلسلية. في هذه الخطوات التي تصف كيفية دمج بلورات من بروتينات قابلة للذوبان في نظام الإجراءات الجزائية. ويمكن الحصول على بلورات من قبل أي تقنية، توحيد معا في شكل تعليق الكريستال وتصفيتها إذا لزم الأمر.

  1. ضبط كثافة وضوح الشمس في تعليق لضمان معدلات الكريستال ضرب ما يقرب من 10-40٪.
  2. تبتوقيت شرق الولايات المتحدة توافق على حل الكثيرمن مع نظام الإجراءات الجزائية باستخدام 7.9 MAG، 9.7 MAG أو 1: 1 خليط من 7.9 MAG و 9.9 MAG كما الدهون المضيف.
  3. مزيج ~ 25 ميكرولتر من تعليق وضوح الشمس مع ~ 25 ميكرولتر من الدهون المضيف باستخدام خلاط حقنة حتى يتشكل نظام الإجراءات الجزائية متجانسة.
  4. تقييم حجم وضوح الشمس وكثافة كما هو موضح في القسم 6. تحميل العينة في حاقن نظام الإجراءات الجزائية، وجمع البيانات كما هو موضح في القسم 8.

النتائج

أدناه ونحن تصف النتائج تمثيلية تم الحصول عليها مع عينات عن طريق اتباع البروتوكولات المذكورة أعلاه إعداد، والذي سمح لنا لجمع البيانات SFX وحل هياكل عالية الدقة من خمسة GPCRs الإنسان: مستقبلات السيروتونين 5-HT 2B في مجمع مع الإرغوتامين ناهض 8 (PDB معرف 4NC3 )، مستقبلات مملس (SMO) في مجمع مع سايكلوبامين خصم 6 (PDB معرف 4O9R)، مستقبلات δ-المواد الأفيونية في مجمع مع ثنائية وظيفية الببتيد يجند ديب-NH 2 7 (PDB معرف 4RWD)، مستقبلات أنجيوتنسين في مجمع مع مانع ZD7155 9 (PDB معرف 4YAY)، ومجمع بين رودوبسين وarrestin 19 (PDB معرف 4ZWJ)؛ واثنين من اختبار بروتينات قابلة للذوبان: الليزوزيم (PDB معرف 4ZIX) و phycocyanin (PDB معرف 4ZIZ).

5-HT 2B تتوسط العديد من الوظائف الفسيولوجية المركزية والطرفية من مادة السيروتونين الناقل العصبي. هذا المستقبلكان يستخدم لإنشاء والتحقق من صحة طريقة نظام الإجراءات الجزائية، SFX، من خلال مقارنة هيكل درجة حرارة الغرفة التي تم الحصول عليها في LCLS مع هيكل cryocooled حلها عن طريق microcrystallography التقليدية في مصدر فوتون المتقدم (APS). وقد أعد ما مجموعه 100 ~ ميكرولتر عينة نظام الإجراءات الجزائية مع microcrystals البروتين (متوسط ​​حجم حوالي 5 ميكرون)، وتستخدم لجمع البيانات SFX، وهيكل نظام الإجراءات الجزائية-SFX من 5HT 2B تم حلها بنجاح في 2.8 Å (الشكل 2) 8. وترد تفاصيل إضافية مفيدة في إعداد العينات وجمع البيانات الواردة في الجدول 1.

مستقبلات مملس (SMO) هو عضو في الفئة السادسة GPCRs والهدف الجزيئي للسايكلوبامين مشوه، مع وظائف أثبتت بشكل جيد في التطور الجنيني ونمو الورم. في البداية، تم الحصول على بلورات كبيرة نسبيا من SMO / سايكلوبامين بمتوسط ​​حجم 120 × 10 × 5 ميكرون وتستخدم بعد ذلك لcollecti البياناتعلى على مصدر السنكروترون باستخدام التقليدية البلورات القائم على مقياس الزوايا. ومع ذلك، هذه البلورات كبيرة أنتجت الحيود ضعف في خط الأشعة التركيز الجزئي (10 ميكرون في القطر) يعانون من mosaicity كبير (أكثر من 2-3 درجات)، وربما يرجع ذلك إلى تراكم العيوب نمو البلورات، أو من آثار تتعلق cryocooling. نظام الإجراءات الجزائية، SFX، ومع ذلك، مكننا من جمع البيانات ذات الحيود في LCLS من 5 ميكرون بلورات الحجم في درجة حرارة الغرفة. تم حل هيكل عن طريق استبدال الجزيئي في ومتباين الخواص 3.4 و 3.2 و 4.0 قرار Å على طول المحاور الرئيسية الثلاثة، وتحديد واضح لموقع سايكلوبامين في الربط جيب 6 (الشكل 3).

وتستخدم على نطاق واسع المواد الأفيونية قلويد، مثل المورفين، استهداف μ للمواد الأفيونية مستقبلات (μ-OR) لإدارة شديدة الألم. ومع ذلك، استخداماتها واسعة النطاق يؤدي إلى التسامح المكتسبة والإدمان. شاركت ادارة المورفين مع δ-الأفيونية مستقبلات (δ-OR) الخصوم وقد تبين لمنع الآثار الجانبية المذكورة أعلاه، وبالتالي تعزيز البحث عن مركبات ذات وظيفة δ-OR-المتعارضة وميكرون، أو ناهض المختلطة. حصلنا على بيانات حيود الأولية على δ-OR في مجمع مع ثنائية وظيفية رباعي الببتيد ديب-NH 2 باستخدام بلورات cryocooled أن diffracted إلى 3.3 Å في مصدر الأشعة السينية السنكروترون توظيف استراتيجية التقليدية جمع البيانات على أساس مقياس الزوايا. وكشفت هذه البيانات كثافة الإلكترون الغامضة جزئيا ليجند الببتيد. وفي وقت لاحق، تم الحصول على البيانات XFEL الحيود في درجة حرارة الغرفة وتحديد هيكل في 2.7 القرار A يدل على كثافة واضحة ليجند ومستقبلات 7. عرضت هذا الهيكل فرصة لفهم المزيد من وظيفة مستقبلات المواد الأفيونية والانتقائية وتوفير معلومات قيمة لتطوير المسكنات جديدة.

جنرال الكتريك = "1"> أنجيوتنسين II نوع 1 مستقبلات (AT 1 R) هو النوع من الاختزال بمثابة المنظم الرئيسي لضغط الدم. نحن تبلور AT 1 R في مجمع مع خصم ZD7155 في نظام الإجراءات الجزائية. وصلت بلورات الأمثل الحد الأقصى لحجم 40 × 4 × 4 ميكرون 3 مع أفضل الحيود الوصول فقط ~ 4 Å في مصدر السنكروترون. عن طريق تغيير الظروف التبلور، حصلنا على الاستحمام من بلورات صغيرة (10 × 2 × 2 ميكرون 3)، والتي كانت تستخدم للحصول على هيكل درجة حرارة الغرفة عند 2.9 قرار Å باستخدام الأشعة XFEL. تم جمع ما مجموعه 2764739 الصور كاشف لجعل مجموعة البيانات الكاملة من حوالي 65 ميكرولتر من نظام الإجراءات الجزائية وضوح الشمس لادن ما يعادل حوالي 0.29 ملغ من البروتين 9. من العدد الإجمالي للإطارات، تم تحديد 457275 كما يضرب وضوح الشمس، المقابلة لمعدل إصابة من 17٪، منها 73130 لقطة (16٪ من الزيارات) تم فهرستها بنجاح ومتكاملة.

Gتقارير إنجاز المشروعات إشارة من خلال مسارين الرئيسية بوساطة إما G البروتينات أو arrestins. تم حل بنية مستقبلات الأدرينالية β 2 منضم إلى G heterotrimeric الصورة البروتين قبل بضع سنوات 20، في حين أن بنية النوع من الاختزال في مجمع مع arrestin ظلت بعيدة المنال. حصلنا على بلورات صغيرة من البروتين الانصهار رودوبسين-arrestin في نظام الإجراءات الجزائية التي وصلت إلى 25-30 ميكرومتر في أطول البعد، ولكن على الرغم من تطويري مكثف، diffracted فقط إلى ~ (7) قرار Å في مصادر السنكروترون. باستخدام أسلوب نظام الإجراءات الجزائية، SFX، خلال 12 ساعة من XFEL beamtime، جمعنا 22262 يضرب الكريستال، منها 18874 أنماط تم فهرستها بنجاح ومتكاملة لمتباين حدود قرار من 3.8 A / 3.8 A / 3.3 Å 19. رودوبسين-arrestin هو بروتين معقد صعبة للغاية التي قاومت تحديد الهيكل باستخدام الأساليب التقليدية. أظهر تقرير الناجح لهذا الهيكل إمكانات ضخمة منطريقة نظام الإجراءات الجزائية-SFX لمعالجة المشاكل الصعبة وتوفير فرصة فريدة لدراسة آلية الإشارات-arrestin منحازة في GPCRs.

أخيرا، بالإضافة إلى غشاء البلورات البروتينية التي تزرع في المرحلة شحمي، وقد تم تكييف لدينا إعداد العينات وطريقة التسليم بنجاح لبلورات البروتين القابلة للذوبان، حيث يتم استخدام نظام الإجراءات الجزائية كوسيلة الناقل لتسليم بلورات، مما يسمح لنا أن ينخفض ​​بشكل كبير من استهلاك البروتين اللازمة لتحديد هيكل. هياكل اثنين من البروتينات نموذج، الليزوزيم و phycocyanin، تم حل عند 1.89 A و 1.75 القرار A على التوالي من قبل هذه الطريقة، وذلك باستخدام أقل من 0.1 ملغ من كل من البروتين 21.

مستقبلات السيروتونين 2B مستقبلات مملس δ الأفيونية مستقبلات أنجيوتنسين الثاني نوع مستقبلات 1 رودوبسين-Arrestin الليزوزيم فيكوسيانين
PDB معرف 4NC3 4O9R 4RWD 4YAY 4ZWJ 4ZIX 4ZIZ
إجمالي العينة المستخدمة *، ميكرولتر 100 83 50 65 75 10 10
البروتين الكلي المستخدمة، ميكروغرام 300 500 300 290 340 100 100
متوسط ​​حجم الكريستال، ميكرون 5 × 5 × 5 <5 5 × 2 × 2 10 × 2 × 2 5-10 5 × 2 × 2 10 × 10 × 5
معدل اصابة، ٪ 3.6 7.8 5.9 17 0.45 40 6.5
إجمالي وقت جمع البيانات، ساعة 10 8 4.6 6.4 12 0.75 0.67
عدد من أنماط المفهرسة 32819 61964 36083 73130 18874 54544 6629
مجموعة الفضاء C 2 2 2 1 P 2 1 C 2 C 2 P 2 1 2 1 2 1 ف 4 3 2 1 2 H 3 2
القرار، 2.8 3.2 / 3.4 / 4.0 2.7 2.9 3.3 / 3.8 / 3.8 1.89 1.75

جنرال الكتريك = "1"> * وبعد المعايرة الدهون

الجدول 1. ملخص الإحصاءات إعداد العينات وجمع البيانات لهياكل تمثيلية حلها باستخدام طريقة نظام الإجراءات الجزائية-SFX.

كمية من العينة المطلوبة للحصول على تجربة نظام الإجراءات الجزائية-SFX يعتمد على جودة وضوح الشمس الحيود، وكثافة وضوح الشمس، وقطر فوهة حاقن، فضلا عن حجم XFEL شعاع، وكثافة ونبض معدل التكرار.

figure-results-1
الشكل 1. مخطط انسيابي لإجراء إعداد عينة نموذجية لإعداد نموذج نظام الإجراءات الجزائية-SFX. يبدأ مع تبلور نظام الإجراءات الجزائية من البروتين المستهدف في المحاقن الزجاج مانعة لتسرب الغاز. بعد الحصول على البلورات، وتوحيد نظام الإجراءات الجزائية وضوح الشمس لادن في حقنة واحدة ومعاير مع دهن إضافي، لabsorب حل مرسب الزائد. بلورات ثم تتميز باستخدام أساليب الفحص المجهري مختلف قبل جمع البيانات XFEL. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. نتيجة ممثل، وهيكل 5-HT 2B في مجمع مع الإرغوتامين. (أ) تصوير Microcrystals من 5-HT 2B / الإرغوتامين باستخدام وضع المجهر مشرق الميدان 8. تمت إعادة استخدام هذا الرقم من إشارة 8 بإذن المؤلف من العلوم. (ب) Microcrystals من 5-HT 2B / الإرغوتامين تصويرها باستخدام الوضع عبر الاستقطاب المجهر 8. تم إعادة استخدامها هذا الرقم من إشارة 8 مع حقوق التأليف والنشرإذن من العلوم. (ج) كارتون تمثيل 5-HT 2B / هيكل الإرغوتامين التي حصل عليها نهج نظام الإجراءات الجزائية-SFX. وترد الدهون التي بنيت في نموذج في التمثيل عصا. يظهر الإرغوتامين يجند في التمثيل المجالات. خطوط الصلبة تشير إلى حدود غشاء تقريبية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3. نتيجة التمثيلية، وهيكل من SMO في مجمع مع سايكلوبامين. اللوحة اليمنى، تصوير microcrystals من SMO / سايكلوبامين باستخدام الوضع عبر الاستقطاب المجهر 6. تم إعادة استخدامها هذا الرقم من الإشارة 6 بإذن المؤلف من طبيعة الاتصالات. لوحة الحق، وrepresentati الكرتونعلى الهيكل SMO / سايكلوبامين التي حصل عليها نهج نظام الإجراءات الجزائية-SFX. ويرد سايكلوبامين يجند في التمثيل المجالات. خطوط الصلبة تشير إلى حدود غشاء تقريبية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

البروتوكولات وصفها هنا توفر المخطط العام للإجراءات إعداد عينة لتجربة نظام الإجراءات الجزائية-SFX القياسية مع حاقن نظام الإجراءات الجزائية. استنادا إلى تجربتنا، فإن المبلغ الإجمالي للبلورة مكروية محملة نظام الإجراءات الجزائية العينة النهائية اللازمة لتحصيل البيانات الكاملة عادة 50-100 ميكرولتر (الجدول 1؛ 25-50 ميكرولتر من البروتين لادن عينة نظام الإجراءات الجزائية الأولية)، وهذا يتوقف على حجم بلورة مكروية والجودة والكثافة. وبما أن كل 100 ميكرولتر حقنة زجاجية مانعة لتسرب الغاز يمكن أن تستوعب حوالي 7 ميكرولتر من نظام الإجراءات الجزائية في شكل سلسلة ممتدة بشكل كامل لضمان حسن وحتى نشر الحل مرسب في نظام الإجراءات الجزائية، ما لا يقل عن 4-7 عينات في الحقن يجب أن تكون على استعداد ل كل تجربة نظام الإجراءات الجزائية-SFX.

منذ مقذوف العينة من خلال ضيق 20-50 ميكرون في القطر الشعرية، لا بد من تجنب أي مواد الجسيمات الأجنبية في العينة. الغبار والألياف التي يمكن إدخالها في بعض الأحيان في نظام الإجراءات الجزائيةعينة أو مرسب الحلول قد يعوق الشعرية حاقن ويزيد من الوقت لأسفل أثناء التجربة. وبالتالي، فمن المهم لتصفية الدهون وجميع الحلول من خلال مرشح المسام 5 ميكرون قبل إعداد العينات. اختياريا، غرفة نظيفة أو محمول غطاء غرفة نظيفة يمكن استخدامها لإعداد العينات.

وتقوم هذه البروتوكولات على استخدام 9.9 MAG (monoolein) كما الدهون المضيفة للالنائب التبلور. أنها، مع ذلك، لا تقتصر على 9.9 MAG ويمكن أن تتكيف بسهولة مع أي الدهون المضيف نظام الإجراءات الجزائية الأخرى أو خليط من الدهون بعد الأخذ في الاعتبار الاختلافات في السلوك المرحلة الدهون. معظم هياكل النواب تبلورت في نظام الإجراءات الجزائية التي تم الحصول عليها باستخدام واحدة من أكواب، مع 9.9 MAG يجري الممثل الأكثر نجاحا حتى الآن 15. العيب الرئيسي لاستخدام 9.9 MAG لSFX هو انتقالها إلى مرحلة الكريستال رقائقي على التبريد أقل من 18 درجة مئوية، والذي يحدث في كثير من الأحيان عندما يتم تنفيذ الحصول على البيانات في فراغ. وtitratiعلى 7.9 MAG وصفها في المادة 5 من هذا البروتوكول يوفر حلا جيدا لهذه المشكلة. في تجربتنا، بلورات الصمود مثل هذا المعايرة دون أي آثار سلبية. إذا، ومع ذلك، فإن إضافة 7.9 MAG أو MAG بالسلاسل القصير آخر غير مرغوب فيه، ومعايرة لا يمكن أن يؤديها مع 9.9 MAG. في هذه الحالة، والغاز أدى إلى استقرار تدفق نظام الإجراءات الجزائية خلال الحقن في الفراغ يجب أن تنتقل من الهيليوم إلى النيتروجين، والتي يمكن أن تمنع تشكيل المرحلة الدهون البلورية في معظم العينات، على حساب وجود تدفق العينة أقل استقرارا.

اتساق هلامية من نظام الإجراءات الجزائية لديه ميزة كبيرة لاستخدامها كوسيلة الكريستال الناقل، لأنه يسمح تعديل معدل التدفق الكريستال عبر طائفة واسعة، ومناسبة لجمع البيانات البلورات التسلسلية في مصادر XFEL والسنكروترون الحديثة. مطابقة معدل التدفق وضوح الشمس مع نبض XFEL النتائج نسبة الرسوب في خفض كبير في استهلاك وضوح الشمس من حيث الحجم جompared لحقن السائل. نظام الإجراءات الجزائية هو وسيلة الناقل مناسبة لتسليم ليس فقط من بلورات النائب نمت في ذلك، ولكن أيضا لبلورات من البروتينات القابلة للذوبان 21. وقد تم مؤخرا إدخال العديد من وسائل الإعلام وضوح الشمس الناقل لزجة بديلة 22-24، وتوسيع ترسانة من الأدوات والكواشف لإجراء التجارب البلورات التسلسلية. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت البلورات التسلسلية مع نظام الإجراءات الجزائية كوسيلة تسليم وضوح الشمس في مصادر السنكروترون التقليدية، على الأقل بالنسبة لبلورات الانعراج جيدا 24،25. وترقيات في المستقبل من مصادر السنكروترون التي تعزز الأشعة السينية كثافة من حيث الحجم، فضلا عن إدخال تحسينات في مجال التكنولوجيات كاشف، وجعل البلورات التسلسلية وسيلة أكثر سهولة وجاذبية للتصميم هيكل.

وقد أثبت نظام الإجراءات الجزائية-SFX فعاليته عن النائب تقرير الهيكلي. لالنظم البيولوجية الصعبة (مثل GPCRs أو مجمعات الجزيئات) حيث لالدو، بلورات ذات جودة الحيود من الصعب أن ينمو، قد نظام الإجراءات الجزائية-SFX تقديم جذابة، إن لم يكن، والخيار الوحيد القابل للتطبيق لحل هيكل قرار الذري. مع كل مزاياها، أي باستخدام نظام الإجراءات الجزائية بمثابة النموذج لبلورة النائب والتسليم وضوح الشمس، وانخفاض استهلاك البروتين، وعدم وجود أضرار الإشعاع، درجة حرارة الغرفة جمع البيانات، وإمكانيات الدراسات وقت حل 26،27 وأي شرط الحصاد وضوح الشمس، LCP- يجب SFX لعب دورا هاما في مستقبل البيولوجيا البنيوية.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 GM108635 وU54 GM094618، جائزة منحة مايو كلينيك-جامعة ولاية أريزونا التعاوني البذور وجبهة الخلاص الوطني STC جائزة 1231306. نشكر A. وكر للمساعدة في إعداد المخطوط.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
LCP المضيف الدهون monoolein (9.9 MAG)Nu Chek PrepM239استضافة الدهون للبروتين المراد تبلوره LCP
المضيف مونولين الدهون (9.9 MAG)SigmaM7765  استضافة الدهون لبلورة البروتين
LCP المضيف الدهون monopalmitolein (9.7 MAG)Nu Chek PrepM219استضافة الدهون للبروتين المراد تبلوره
LCP المضيف الدهون 7.9 MAGAvanti Polar Lipids850534استضافة الدهون للتعب لتجنب تكوين المرحلة البلورية الرقائقية (Lc) أثناء حقن
العينة محلول البروتين المنقى المركز إلى 20-50 مجم / ملالبروتين المستهدف
كلوروفورمفيشر ScientificC606-1يستخدم لإذابة الدهون
الميثانولسيجما ألدريتش179337-500 مليستخدم لغسل المحاقن
أحد عشر 100 &# 956 ؛ ل محاقن هاملتون محكمة الغلق بدون إبرهاميلتون7656-01لإعداد LCP
ثمانية مقرنات حقنةFormulatrixSKU 209526لإعداد LCP
إبرة تحميل حاقنLCP هاميلتون7804-01 نمط النقطة 3 ، الطول 1 بوصةلتوزيع LCP وتحميل الحاقن
إبرة قابلة للإزالةهاميلتون7768-01لإزالة محلول الترسيب
Parafilm MParafilmPM992تستخدم لختم الحقن
مناديل تنظيف العدسات الخالية من الوبرفيشرNC9592151
أنابيب مرشح الطرد المركزي ، Ultrafree-MC ، 0.5 مل ، Durapore 5 & micro ؛ mMilliporeUFC3 0SV 00تستخدم لتصفية المحاليل المترسبة والدهون شرائح
المجهر ، 1 بوصة × 3 بوصة & nbsp ؛GoldSeal3010
زجاجتان للغسيل بأطراف دقيقة. أحدهما مملوء ب milli-Q أو الماء المقطر ، والآخر بالميثانولVWR89094-640تستخدم هذه لتنظيف المحاقن والإبر والمقرنة. يستخدم الميثانول أولا ، ثم الماء.
قفازاتMicroflexXC-310-Lلتجفيف المحاقن والإبر والحلقات والمقرنات نظارات
علب الهواء المضغوطة مستودعOffice (Dust-Off)527494لتنظيف الحقن
سخان الكتلة الجافة مع جهاز التحكم في درجة الحرارة الرقميFisher11-720-10BQ تستخدم لإذابة الدهون
جهاز طرد مركزي على الطاولةفيشر05-413-340حلول الغزل
نظيفة صغيرة - غطاء ضغط إيجابي محمول مقاس 12 بوصة مع مرشح HEPASentry Air Systems، Inc.SS-112-PCRتنظيف إعداد
عينة مجهر تكبير ستيريو مجهز بمستقطب خطي ومحلل دوار   ؛نيكونSMZ1500فحص كثافة الكريستال
مجهر الأشعة فوق البنفسجيةJAN ScientificUVEX-Pاختياري ، لأغراض التصوير البلوري
SHG تصويرFormulatrixSONICCاختياري ، لأغراض التصوير البلوري
السلامة غرفة

المراجع

  1. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
  2. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
  3. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  4. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  5. DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505(2008).
  6. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat Commun. 5, 3309(2014).
  7. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).
  8. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  9. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  10. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  11. Liu, W., et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science. 337 (6091), 232-236 (2012).
  12. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
  13. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J Vis Exp. (49), (2011).
  14. Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase. Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).
  15. Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, Elsevier. (2009).
  16. Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. Monoolein: a magic lipid? Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).
  17. Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).
  18. James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , Arizona State University. 1-126 (2015).
  19. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  20. Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
  21. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).
  22. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).
  23. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
  24. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
  25. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2, 168-176 (2015).
  26. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  27. Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. 513, 261-265 (2014).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة