يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

رواية عزل-ملزم RNA والبروتينات التي السريع المنهجية

9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54467

⸱

سبتمبر 30, 2016

 , 
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology, 2Department of Biomolecular Sciences, Weizmann Institute of Science

في هذه المقالة

ملخص

تكمن تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي في صميم العديد من العمليات الخلوية. هنا ، نصف طريقة في الجسم الحي لعزل الحمض النووي الريبي المحدد وتحديد البروتينات الجديدة المرتبطة به. هذا يمكن أن يلقي ضوءا جديدا على كيفية تنظيم الحمض النووي الريبي في الخلية.

الملخص

تلعب البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBPs) < p class = 'jove_content'> أدوارا مهمة في كل جانب من جوانب استقلاب الحمض النووي الريبي وتنظيمه. يعد تحديدهم تحديا كبيرا في علم الأحياء الحديث. فقط عدد قليل من الطرق في المختبر وفي الجسم الحي تمكن من تحديد RBPs المرتبطة ب mRNA مستهدف معين. ومع ذلك ، فإن قيودها الرئيسية هي تحديد RBPs في بيئة غير خلوية (في المختبر) أو عزل منخفض الكفاءة للحمض النووي الريبي ذي الأهمية (في الجسم الحي). تم تصميم منهجية تنقية وتحديد البروتين المرتبط بالحمض النووي الريبي (RaPID) للتغلب على هذه القيود في الخميرة وتمكين العزل الفعال للبروتينات المرتبطة في الجسم الحي. لتحقيق ذلك ، يتم تمييز الحمض النووي الريبي المثير للاهتمام بحلقات MS2 ، ويتم التعبير عنه بشكل مشترك مع بروتين اندماج لبروتين مرتبط ب MS2 وبروتين مرتبط بالستربتافيدين (SBP). ثم تخضع الخلايا للتشابك والتحلل ، ويتم عزل المجمعات من خلال حبات الستربتافيدين. يمكن بعد ذلك تحديد البروتينات التي تنقية مع الحمض النووي الريبي الموسوم عن طريق قياس الطيف الكتلي. استخدمنا هذا البروتوكول مؤخرا لتحديد البروتينات الجديدة المرتبطة ب PMP1 mRNA المرتبط ب ER. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا ل RaPID ، ونناقش بعض قيوده ومزاياه.

المقدمة

البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي (الممارسات التجارية التقييدية) تمثل حوالي 10٪ من س. بروتينات خميرة 1،2 وحوالي 15٪ من البروتينات الثدييات 3-5. كانوا متورطين في العديد من العمليات الخلوية مثل معالجة مرنا بعد النسخي والتنظيم، الترجمة، نشوء حيوي الريبوسوم، الحمض الريبي النووي النقال aminoacylation وتعديل، وإعادة عرض لونين، وأكثر من ذلك. فريق فرعي هامة من الممارسات التجارية التقييدية هي بروتينات ملزمة مرنا (mRNPs) 6،7. في سياق نضوج مرنا، الممارسات التجارية التقييدية مختلفة تربط نص وتوسط معالجة النووي والتصدير من النواة، توطين الخلوية والترجمة وتدهور 6-8. وهكذا، فإن مجموعة متميزة من الممارسات التجارية التقييدية منضم إلى نص معين في أي نقطة زمنية يحدد التجهيز لها، وفي نهاية المطاف مصيرها.

تحديد الممارسات التجارية التقييدية المرتبطة مرنا يمكن أن تحسن بشكل كبير من فهمنا للعمليات التي يقوم تنظيمها بعد النسخي. تنوعا الوراثية، وقد استخدمت أساليب المجهرية، والكيمياء الحيوية والمعلوماتية الحيوية لتحديد البروتينات المشاركة في التنظيم مرنا (إعادة النظر في 11/9). ومع ذلك، سوى عدد قليل من هذه الأساليب تمكن من التعرف على البروتينات المرتبطة مرنا هدف معين. من المذكرة هو الخميرة ثلاثة نظام الهجين (Y3H)، الذي يستخدم مرنا من الفائدة كطعم لفحص مكتبة التعبير في خلايا الخميرة. وعادة ما تكون لاحظت الحيوانات المستنسخة إيجابية من خلال مجموعة مختارة النمو أو مراسل التعبير 12-14. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو وجود عدد كبير من البروتينات التي يمكن مسحها في بيئة الخلوية والقدرة على قياس قوة التفاعل الحمض النووي الريبي البروتين. وتشمل النواحي العدد الكبير نسبيا من نتائج إيجابية كاذبة بسبب غير محددة وملزمة، وقدرة عالية على النتائج السلبية الكاذبة الواجبة، في جزء منه، إلى misfolding فريسة البروتين الانصهار أو الحمض النووي الريبي الطعم.

بديل للنهج الوراثي purifi تقاربالموجبة من الحمض النووي الريبي مع البروتينات المرتبطة بها. بولي والتي تحتوي على من mRNAs يمكن عزلها من خلال استخدام جزئية الأعمدة دينارا، والكشف عن البروتينات المرتبطة بها عن طريق قياس الطيف الكتلي. يتم حفظها تفاعل الحمض النووي الريبي البروتين في سياق الخلوي من قبل يشابك، الأمر الذي يجعل الرابطة التساهمية قصيرة المدى. استخدام العمود DT بنسبة ضئيلة غلة نظرة عالمية للبروتيوم بأكمله الذي يرتبط مع أي بولي والتي تحتوي على مرنا 3،5،15. ومع ذلك، هذا لا يوفر قائمة من البروتينات التي ترتبط مع مرنا بشكل خاص. جدا متاحة لإنجاز مثل هذا تحديد عدد قليل من الطرق. يستتبع طريقة زوج ترنسفكأيشن من الحمض النووي مع التكامل إلى الهدف مرنا 16،17. ويرد الحمض النووي أيضا إلى الببتيد، والذي يسمح يشابك إلى الممارسات التجارية التقييدية في المناطق المجاورة القريبة من موقع التفاعل. بعد يشابك، وحامض الممارسات التجارية التقييدية-الببتيد النووي يمكن عزل ويتعرضون لتحليل البروتينات. في الآونة الأخيرة، وكانت منهجية القائم على أبتمرطبقت بنجاح لمقتطفات من خطوط الخلايا الثديية 18. تم وضع أبتمر RNA مع تحسين التقارب إلى streptavidin وتنصهر لسلسلة من الفائدة (عنصر والاتحاد الافريقي الغني (ARE) في هذه الحالة). كان يعلق على أبتمر-ARE RNA لحبات streptavidin ومختلطة مع المحللة الخلية. وتنقيته البروتينات التي ترتبط مع تسلسل ARE وتحديد الطيف الكتلي (MS). على الرغم من أن هذه الطريقة الكشف عن الجمعيات التي تحدث خارج الإعدادات الخلوية (أي في المختبر)، فإنه من المرجح أن يتم تعديل في المستقبل وذلك لتقديم الأبتامرات في الجينوم وتمكين وبالتالي عزل البروتينات المرتبطة مرنا أثناء وجوده في الوسط الخلوي (أي في الجسم الحي). في الخميرة، حيث يتم وضع التلاعب الجيني جيدا، وطريقة سريعة (وضعت في مختبر البروفيسور جيف Gerst) تقدم وجهة نظر في الجسم الحي الجمعيات 19. السريع يجمع بين MS2- محددة وملزمة من البروتين معطف MS2 قوي (CP) إلى تسلسل الحمض النووي الريبي MS2، والمجال ملزم streptavidin (متوسط ​​ضغط الدم الانقباضي) لstreptavidin الخرز مترافق. وهذا يمكن تنقية فعالة لمن mRNAs الموسومة MS2 من خلال حبات streptavidin. وعلاوة على ذلك، والتعبير من 12 نسخ من حلقات MS2 يسمح ما يصل الى ستة MS2-البرامج القطرية لربط في الوقت نفسه إلى الحمض النووي الريبي وزيادة كفاءة عزلتها. ولذلك اقترح هذا البروتوكول لتمكين تحديد البروتينات المرتبطة مرنا رواية أخرى يتعرضون عينات مزال لتحليل البروتينات التي مطياف الكتلة.

نحن استخدمت مؤخرا السريع لتحديد البروتينات الجديدة المرتبطة الخميرة PMP1 مرنا 20 تم إظهار PMP1 مرنا سابقا لتترافق مع غشاء ER وعثر 3 'المنطقة غير مترجمة لها (UTR) أن يكون محددا رئيسيا في هذه الجمعية 21. وهكذا، الممارسات التجارية التقييدية التي تربط PMP1 3 'UTR من المرجح أن يلعب دورا هاما في توطين لها. يتبع السريع من قبل الكروماتوجرافي السائلأدى ذ الكتلة الطيفي / قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS) في تحديد العديد من البروتينات الجديدة التي تتفاعل مع PMP1 20. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لمنهجية سريعة، والضوابط الهامة التي تحتاج إلى القيام به، ونصائح تقنية قد تحسين المحصول وخصوصية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: إدراج تسلسل يتكون من 12 موقعا ملزم MS2 (MS2 حلقات، MS2L) في موضع الجيني المطلوب، عادة بين الإطار القراءة المفتوحة (ORF) و "UTR 3. ويرد بروتوكول مفصلة لهذا التكامل في أماكن أخرى 22. تحقق الإدراج الصحيح والتعبير PCR، وتحليل الشمالي أو RT-PCR 20،23. فمن المهم للتحقق من أن التكامل لم تتدخل مع توليف من 3'UTR. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أيضا أدخلت MS2-CP، معربا عن البلازميد تنصهر إلى متوسط ضغط الدم الانقباضي تحت تعبير عن المروج محرض (نضوب ميثيونين) إلى خلايا 24. سلالة متطابقة، باستثناء الحلقات MS12 قدم، ينبغي أن تستخدم كوسيلة لمراقبة للكشف عن الإشارات غير محددة.

1. سريع تنقية

  1. تنمو 500 مل من خلايا الخميرة (استخدام 250-1،000 مل من خلايا الخميرة تبعا لمستوى التعبير عن الجينات في المصالح) معربا عن MS2 الموسومة مرنا 20 وMS2-CP-GFP-SBP انصهار بروتين 24 إلى OD 600 0،8-1،0 في 30 درجة مئوية في المتوسط النمو المناسب (على سبيل المثال، الاصطناعية سكر العنب (SD) متوسطة انتقائية).
  2. خلايا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 4 دقائق على RT وتجاهل طاف.
  3. غسل الخلايا في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، الطرد المركزي كما كان من قبل (الخطوة 1.2)، resuspend في حجم مساو (الخطوة 1.1) من SD دون ميثيونين، واحتضان لمدة 45 - 60 دقيقة في 30 درجة مئوية للحث على التعبير عن MS2 -CP-GFP-متوسط ​​ضغط الدم الانقباضي البروتين الانصهار.
    ملاحظة: أطول وقت الحث قد يسبب تجميع GFP.
  4. جانبا 10 مل من الخلايا واستخراج الحمض النووي الريبي من هذه العينة باستخدام بسيط "الفينول الساخن" طريقة 25. تحذير: الفينول هو شديد السمية، وينبغي أن يتم التعامل معها وفقا لتعليمات السلامة بها.
    ملاحظة: هذا RNA هو إشارة جيدة لنوعية من الحمض النووي الريبي معزولة (الشكل 1A).
  5. 500 مل الخلايا، إضافة 1.35 مل 37٪ الفورمالديهايد لج النهائيةoncentration من 0.1٪ إلى تشعبي المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين. تستمر الحضانة عند 30 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تحذير: الفورمالديهايد عالية السمية، وينبغي التعامل وفقا لتعليمات السلامة بها.
  6. إضافة 26.5 مل من 2.5 M الجلايسين إلى تركيز النهائي من 0.125 م واحتضان لمدة 3 دقائق لوقف يشابك. من هذه الخطوة على، وضع كل شيء على الجليد للحد من تدهور الحمض النووي الريبي.
  7. خلايا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 4 دقائق في 4 درجة مئوية، وأغسلها مع 45 مل الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
  8. Resuspend الخلايا في 1 مل العازلة السريع تحلل لكل 100 مل من زراعة الخلايا الأولية.
  9. تنقسم إلى aliquots من 500 ميكرولتر في أنابيب microfuge المغطاة المسمار وإضافة ~ 400 ملغ من الخرز الزجاجي المبرد إلى كل قسامة (تقريبا كامل 0.2 مل PCR أنبوب).
  10. خلايا ليز في حبة الخافق لمدة 3 دقائق. وضع على الفور المحللة على الجليد.
    ملاحظة: النشرات تحلل الخلية RNases الخلوية، والتي هي السبب الرئيسي لتدهور الحمض النووي الريبي. يحتوي عازلة السريع تحلل على نسبة عالية من ريبونوكلياز inhibitors، مثل الهيبارين غير محدد ريبونوكلياز المانع ومثبطات معينة. العمل بسرعة وحفظ كل شيء بارد ويوصى أيضا.
  11. نقل المحللة إلى أنابيب جديدة. بيرس ثقب صغير في الجزء السفلي من كل microfuge أنبوب بإبرة الساخنة (0.8 ملم × 40 ملم) ووضع أنابيب microfuge على أعلى من 15 مل أنابيب. استخدام رئيس حقنة 5 مل كما محول بين أنابيب microfuge و15 مل أنابيب. أجهزة الطرد المركزي لجمعية أنابيب في 3000 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  12. نقل التدفق من خلال أنبوب 15 مل إلى أنبوب 1.5 مل جديد وأجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لازالة الانقاض الخلية.
  13. supernatants تجمع من جميع الأنابيب 1.5 مل في أنبوب 15 مل واحد، ويوضع جانبا 1/50 و 1/100 حجم المحللة للRNA والبروتين العزلة، على التوالي.
    ملاحظة: ستكون هذه بمثابة عينات "الإدخال" لتحليلها لاحقا (الشكل 1).
  14. إضافة 300 ميكروغرام من أفيدين لكل 500 مل من أناnitial الخميرة الثقافة واحتضان لمدة 30 دقيقة (وهذا يمكن أن تخفض إلى 10 دقيقة) في 4 درجة مئوية تحت المتداول ثابت (10 دورة في الدقيقة).
    ملاحظة: أفيدين كتل البيوتين والبروتينات المعقدة البيروكسيديز من ملزمة لحبات streptavidin.
  15. قبل تغسل حبات streptavidin قبل الحضانة مع المحللة الخلية.
    1. نقل حوالي 300 ميكرولتر من streptavidin الخرز الطين إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وإزالة طاف العلوي. وهذا سيؤدي في 250 ميكرولتر من الخرز. تغسل حبات مرتين مع 1 مل من العازلة تحلل السريع. أجهزة الطرد المركزي لحبات streptavidin في 660 x ج لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية بين كل خطوة.
    2. منع الخرز التي يحتضنها لمدة 1 ساعة مع 0.5 مل من العازلة تحلل السريع، 0.5 مل من 10 ملغ / مل BSA و 10 ميكرولتر من 10 ملغ / مل الخميرة الحمض الريبي النووي النقال. حبات يمكن أن تترك O / N في عرقلة الحل في 4 درجة مئوية مع دوران إذا لزم الأمر.
    3. يغسل مرتين مع 1 مل من سرعة تحلل العازلة.
      ملاحظة: الخرز المغناطيسي يمكن أن تستخدم أيضا للحد من الوقت وbackgrس اوند. هذه، ولكن، لديها قدرة أقل من الخرز سيفاروز.
  16. إضافة 250 ميكرولتر من الخرز streptavidin قبل غسلها إلى المحللة التي تحتوي على أفيدين (من الخطوة 1.14)، واحتضان 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع دوران مستمر (10 دورة في الدقيقة).
    ملاحظة: هذه المرة حضانة تمثل حلا وسطا بين توفير وقت كاف ملزم والتقليل من فرص تدهور الحمض النووي الريبي.
  17. أجهزة الطرد المركزي في 660 x ج لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية لمسح حبات streptavidin ونقل طاف لأنبوب 15 مل الجديد. جانبا 1/50 و 1/100 حجم المحللة للRNA والبروتين العزلة، على التوالي.
    ملاحظة: وسوف تكون هذه العينات "غير منضم".
  18. تغسل حبات مع 1 مل من سرعة تحلل العازلة، يهز بلطف، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل جديد، وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.17. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  19. تغسل حبات مع 1 مل من العازلة السريع غسل، وهذه المرة تدوير (10 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين.
  20. تغسل حبات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه.
  21. تغسل حبات مرة أخرى مع 120 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. أجهزة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه، واتخاذ طاف كامل لRNA واستخراج البروتين كما العينة "غسل".
    ملاحظة: هذه مشاركة غسل العينة تشير إلى التشدد في يغسل وينبغي أن تكون من نفس الحجم كما العينة شطف. وهذا تبسيط تجهيز وتحميل في فحوصات لاحقة.
  22. إلى أزل RNA والبروتينات المرتبطة الحمض النووي الريبي من العمود، إضافة 120 ميكرولتر من البيوتين 6 مم في برنامج تلفزيوني 1X واحتضان لمدة 45 دقيقة على 4 درجات مئوية مع دوران مستمر (10 دورة في الدقيقة).
  23. الطرد المركزي الخرز على النحو الوارد أعلاه ونقل المواد مزال إلى أنبوب 1.5 مل جديد. تدور عينة مزال مرة أخرى ونقل المرحلة العليا لأنبوب 1.5 مل الجديد لضمان عدم المرحل من الخرز.
  24. أخذ عينات لRNA أو استخراج البروتين.
    ملاحظة: حجم اتخذت ينبغي أن يعتمد على مستوى الفحص والتعبير التالي من الحمض النووي الريبي أو البروتينات من الفائدة. كدليل، لتحليل الشمالي 26، تأخذ 80٪ من العينة، لطخة غربية 23،27 أو RT-PCR 28، تأخذ 20٪، وقياس الطيف الكتلي 29 إلى اكتشاف بروتينات جديدة، واتخاذ عينة بأكملها.

2. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. إضافة حجم مساو من 2X يشابك عكس العازلة واحتضان لمدة 45 دقيقة عند 65 درجة مئوية. متابعة مباشرة لاستخراج الحمض النووي الريبي.
    ملاحظة: عكس يشابك العازلة يحتوي على ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، مما يحسن بشكل ملحوظ استخراج الحمض النووي الريبي 20.
  2. استخدام الفينول القياسية: طريقة الكلوروفورم 26 لاستخراج الحمض النووي الريبي من "المدخلات" والعينات "غير منضم" (الخطوات 1.13 و 1.17).
    ملاحظة: هذه العينات تحتوي على كمية كبيرة من الهيبارين المانع ريبونوكلياز، والتي يمكن أن تحول دون اللاحقة عكسي Transcriptase- (RT) باستخدام فحوصات (على سبيل المثال، RT-PCR)، وبالتالي، LiCl هطول الأمطار 30 ينصح لحذفها. و"واش "و" "عينات شطف (الخطوات 1.21 و 1.24) تحتوي على كميات قليلة من الحمض النووي الريبي، وعجلت من خلال الخطوات التالية.
  3. إضافة حجم مساو من 8M Guanidinium، حمض الهيدروكلوريك (GuHCl) ومجلدين من 100٪ من الإيثانول إلى "غسل" والعينات "شطف". احتضان عند -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة.
    ملاحظة: سوف Guanidinium تفسد كفاءة البروتينات، وبالتالي تمنع RNases والبروتياز في العينة.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 20000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وتجاهل طاف. غسل بيليه مع الباردة الايثانول 80٪ وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 20000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  5. حل بيليه الحمض النووي الريبي في 400 ميكرولتر من ريبونوكلياز المياه مجانا ويعجل مرة أخرى لإزالة أي بقايا GuHCl أو غيرها من الملوثات. إضافة 40 ميكرولتر من 3 خلات الصوديوم M، ودرجة الحموضة 5.2 و 800 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪، في احتضان -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
  6. أجهزة الطرد المركزي، ويغسل كما في الخطوة 2.4 وإزالة كافة الإيثانول مع طرف 10 ميكرولتر. Resuspend وبيل RNAوآخرون في 10 المياه مجانا ريبونوكلياز ميكرولتر. رعاية اضافية مثل بيليه RNA هو عادة غير مرئية.
    ملاحظة: نماذج يمكن استخدامها لتحليل الشمالي كما هو موضح في 23 (الشكل 1).

3. البروتين التحضير لغرب وصمة عار أو تحليل الطيف الكتلي

  1. إضافة 1/3 حجم 4X Laemmli عينة العازلة (LSB) لعينات البروتين واحتضان 45 دقيقة عند 65 درجة مئوية لعكس يشابك من الحمض النووي الريبي والبروتينات.
    ملاحظة: نماذج يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. بروتينات تعمل على هلام بولي أكريلاميد SDS (SDS-PAGE) 31. ضبط نسبة من هلام وفقا لحجم من البروتينات لتحليلها.
    ملاحظة: 10٪ هلام الأكريلاميد يعطي مجموعة واسعة من الانفصال وجيد كما تقريب الأول.
  3. نقل البروتينات إلى غشاء كما في تحليل طخة مناعية معيار 27 من أجل السيطرة على كفاءة العزل (الشكل 1C). وصمة عار مع أي Coomassie الأزرق R250 أو الفضة وصمة عار قبل تحليل الطيف الكتلي.
    ملاحظة: وصمة عار الفضة هو الخيار المفضل لأنه أكثر حساسية ويسمح أفضل للكشف عن (الشكل 1B). ويمكن أن يتم تلطيخ مع أي من الحلول التي يجري اعدادها يدويا أو مجموعات تجارية. وينبغي أن تحدد فترة حضانة من هلام في محلول الصبغة النهائية تجريبيا. حضانة طويلة قد تكشف عن البروتينات وفرة منخفضة، ولكن يمكن أن تسبب بروتينات أعرب غاية مثل MS2-CP-SBP-GFP لتكون ملطخة مرارا وقد تخفي البروتينات المحيطة بها في محيطها. بالإضافة إلى ذلك، قد تحدث خلفية عالية. متابعة رد فعل بعناية، وإضافة وقف الحل في الوقت المناسب.
  4. قطع العصابات من هلام ونقلها إلى 1.5 مل أنابيب. عينات في مخزن -20 درجة مئوية، أو ترسل لاستخراج البروتين والهضم التربسين تليها تحليل LC-MS / MS 32.
  5. كنهج البروتين البديل لاستبعاد خطوة الانفصال هلام، هضم المواد مزال من الخطوة 1.24 في ذلكlution باستخدام التربسين وتخضع لتحليل LC-MS / MS 33.
    ملاحظة: حذف هذا الفصل SDS-PAGE يبسط بروتوكول ويزيد الغلة. ومع ذلك، قد تحتوي على عينات آثار المنظفات NP-40، مما يعوق تحليل الطيف الكتلي. للتغلب على هذه المشكلة، اتبع الخطوات التالية:
    1. تشغيل البروتين في SDS-PAGE 31 ل10-15 دقيقة.
    2. قطع جزء كامل من الممر (أي، حيث توجد البروتينات).
      ملاحظة: عينة من البروتين يمكن أن تشمل كمية كبيرة من البروتين MS2-CP-متوسط ​​ضغط الدم الانقباضي قد تحجب الإشارات من البروتينات وفرة منخفضة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

السريع تمكن من عزل الحمض النووي الريبي هدف محدد مع البروتينات المرتبطة بها. حاسمة لنجاحها والحفاظ على الحمض النووي الريبي سليمة قدر الإمكان، وبالتالي الحصول على كمية كافية من البروتينات. لتحديد كفاءة العزل ونوعية من الحمض النووي الريبي، يتم إجراء تحليل الشمالي (الشكل 1A). تحليل الشمالي في الاستفادة من التقارير بشكل مباشر على كفاءة وجودة السريع. وهكذا، فإن الكميات النسبية للطول وتدهور كامل المنتجات يمكن أن تحدد في شوط واحد. تم الكشف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أساليب مختلفة تستخدم في عزل من mRNAs محددة لتحديد البروتينات المرتبطة بها 11،34 35. وتنطبق هذه الأساليب في التجارب المختبرية واستراتيجيات الجسم الحي للتحقيق تفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين. في المختبر طرق احتضان نسخه خارجيا RNA مع المحللة خلية للقبض على الممارسات التجارية التقييدية وعزل المجمعات الأداء الملاحي المطلوب 36،37. تم تقديم نهج فعال من هذا النوع في الآونة الأخيرة، والتي مكنت من تحديد البروتينات الر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر البروفيسور جيف Gerst وبوريس Slobodin للحصول على المشورة المفيدة في إعداد بروتوكول السريع وتوفير البلازميدات اللازمة. كما نشكر الدكتور أفيغيل عتير-انديه لمساعدتها في إنشاء هذا البروتوكول والدكتور تمار زيف من مركز البروتيوميات Smoler لمساعدتها مع تحليل LC-MS / MS. نشكر الأستاذ TG Kinzy (روتجرز) للأجسام المضادة YEF3. وأيد هذا العمل من قبل منحة 2011013 من مؤسسة الثنائية للعلوم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
TrissigmaT1503
SDSbio-lab1981232300
DTTsigmaD9779
الفينول الحمضي (الرقم الهيدروجيني 4.3)سيجماP4682
الفينول الحمضي: الكلوروفورم (5: 1 ، درجة الحموضة 4.3)سيجماP1944
المختبر الحيوي للكلوروفورم3080521
الفورمالديهايدفروتاروم5551820
جلايسينسيجماG7126
NP-40كالبيوكيم492016
الهيبارينسيجماH3393
فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF)سيجماP7626
ليوببتينسيجماL2884
أبروتينينسيجماA1153
مثبط فول الصويا التربسينSigmaT9003
PepstatinSigmaP5318
DNase IPromegaM610A
Ribonuclease   ؛ مثبطتاكارا2313A
الخرز الزجاجيSartoriusBBI-85417010.4-0.6mm القطر 
ميني BeadBeaterBioSpecميني BeadBeater 16
GuanidiniumSigmaG4505
AvidinSigmaA9275
Streptavidin BeadsGE Healthcare 17-5113-01
ألبومين مصل الأبقار (BSA)SigmaA7906
الخميرة tRNASigmaR8508
البيوتينسيجماB4501
مستخلص الخميرةباكتو288620
الببتونباكتو211677
الجلوكوزسيجماG8270
1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)
0.2 متر هيدروكسيد الصوديوم
4x عازلة عينة Laemmli (LSB)0.2 م Tris-Hcl درجة الحموضة 6.8 ، 8٪ SDS ، 0.4 M DTT ، 40٪ جلسرين ، 0.04٪ بروموفينول أزرق.
تحلل الفينول الساخن10 ملي مولار تريس الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 10 ملي EDTA ، 0.5٪ SDS & nbsp ؛
3 م أسيتات الصوديوم الأس الهيدروجيني 5.2
100٪ و 70٪ الإيثانول (EtOH)
تحلل
جم / مل ليوببتين ، 10 وميكرو ؛ جم / مل أبروتينين ، 10 وميكرو ؛ جم / مل مثبط فول الصويا التربسين ، 10 & مايكرو ؛ جم / مل بيبستاتين ، 20 U / مل DNase I ، 100 U / مل ريبونوكلياز   ؛ المانع.
انعكاسية متقاطعة100 ملي مولار تريس درجة الحموضة 7.4 ، 10 ملي متر EDTA ، 20 ملي مولار DTT ، 2٪ SDS.
غسيل RaPID20 ملي Tris-HCl درجة الحموضة 7.5,  300 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5٪ NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus KitBio-Rad  161-0449للكشف عن البروتينات في المواد الهلامية بولي أكريلاميد
SD الوسط الانتقائي  1.7 جم / لتر قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية وكبريتات الأمونيوم ، 5 جم / لتر كبريتات الأمونيوم ، 2٪ جلوكوز ، 350 مجم / لتر ثريونين ، 40 مجم / لتر ميثيونين ، 40 مجم / لتر أدينين ، 50 مجم / لتر ليسين ، 50 مجم / لتر التربتوفان ، 20 مجم / لتر هيستيدين ، 80 مجم / لتر ليوسين ، 30 مجم / لتر تيروزين ، 40 مجم / لتر أرجينين
مضاد للإي إي إي إي 3 (EF3A ، YEF3)هدية من Kinzy TG. (كلية الطب روبرت وود جونسون UMDNJ)1: 5,000
الأجسام المضادة ل GFPسانتا كروزsc-83341: 3,000
مكافحة الأرانب IgG-HRP مترافقةSIGMAA91691: 10,000
عازلة محلول RaPID الخالي من RNase 20 ملي مولار ثلاثية الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.8 ملي مللي كلوريد < > 2 < / فرعي > ، 0.5٪ NP-40 ، 5 مجم / مل الهيبارين ، 1 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT) ، 1 ملي مولار فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) ، 10 & ميكرو ؛2x عازلة مخزن

المراجع

  1. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255(2008).
  2. Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
  3. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
  4. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
  5. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
  6. Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
  7. Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
  8. Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
  9. Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
  10. Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
  11. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203(2014).
  12. Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  13. SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
  14. Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
  16. Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
  17. Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
  18. Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13(2014).
  19. Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
  20. Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17(2015).
  21. Loya, A., et al. The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
  22. Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
  23. Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
  24. Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
  25. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
  26. Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
  27. Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
  28. Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
  29. Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
  30. Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
  31. Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
  32. Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25(2009).
  33. Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
  34. Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
  35. Oeffinger, M. Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
  36. Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
  37. Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
  38. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
  39. Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
  40. Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
  41. Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14(2004).
  42. Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572(2015).
  43. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
  44. Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
  45. de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RNA MS2 RNA
رواية عزل-ملزم RNA والبروتينات التي السريع المنهجية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.