في هذه المخطوطة ، نقدم منصة عالية الإنتاجية وشبه آلية لعلم التبريد لإنتاج صور مركبة محاذاة لمقاييس استجابة متعددة من عدة جولات من التصوير الفلوري على الأجزاء المجمدة من الأنسجة المعدنية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عالية الإنتاجية، متعدد صورة Cryohistology من تمعدن الأنسجة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هناك حاجة متزايدة للتنميط الظاهري الفعال وعلم الأنسجة المرضي لمجموعة متنوعة من الأنسجة. تتجلى الحاجة إلى التنميط الظاهري هذه مع المشاريع الطموحة لتعطيل كل جين في جينوم الفأر. يحتاج مجتمع البحث إلى وسائل سريعة وغير مكلفة للأنماط الظاهرية للأنسجة عبر الأنسجة. غالبا ما تستغرق التحليلات النسيجية للأنسجة الهيكلية وقتا طويلا وشبه كمية في أحسن الأحوال ، وتتطلب بانتظام تفسيرا ذاتيا للشرائح من الأفراد المدربين. هنا ، نقدم نموذجا تبريديا للتنميط الظاهري الفعال وغير المكلف للأنسجة المعدنية. أولا ، نقدم طريقة جديدة للتقطيع بالتبريد المستقر بالشريط الذي يحافظ على مورفولوجيا الأنسجة المعدنية. ثم يتم لصق هذه الأقسام بشكل صارم على الشرائح الزجاجية وتصويرها بشكل متكرر على عدة جولات من التلوين. ثم تتم محاذاة الصور الناتجة إما يدويا أو عبر برنامج الكمبيوتر لإنتاج مجموعات مركبة من عدة طبقات من الصور. يسمح البروتوكول بالتوطين المشترك للعديد من الإشارات الجزيئية لخلايا معينة داخل قسم معين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس إشارات الفلورسنت هذه بشكل موضوعي عبر برامج الكمبيوتر. يتغلب هذا البروتوكول على العديد من أوجه القصور المرتبطة بأنسجة الأنسجة المعدنية ويمكن أن يكون بمثابة منصة للتنميط الظاهري عالي الإنتاجية والمحتوى العالي للأنسجة العضلية الهيكلية للمضي قدما.
المقدمة
وغالبا ما يتطلب الأبحاث البيولوجية phenotyping كفاءة، والتي كثيرا ما يرتبط مع بعض النوع من التحليل النسيجي 1-3. وهذه الحاجة هي أكثر وضوحا مع المشاريع الطموحة لتعطيل كل جين في الماوس الجينوم 4. ويمكن لهذه التحليلات النسيجية تتراوح من تقييم مورفولوجيا الخلايا و / أو الخصائص التشريحية للتعبير رسم خرائط جينات معينة أو البروتينات إلى الخلايا الفردية. في الواقع، واحدة من المساهمات الأساسية من الأنسجة في مجال علم الجينوم هو القدرة على ربط إشارة الجزيئية محددة لمنطقة أو خلية معينة نوع.
الطرق التقليدية في الأنسجة، وخاصة لأنسجة العضلات والعظام، وغالبا ما تكون مضيعة للوقت وشاقة، تتطلب أسابيع لإصلاح بعض الأحيان، ويزيل الكلس، القسم، وصمة عار، وصورة العينة ثم تحليل الصور عن طريق تفسير بشري. تحليل الإشارات الجزيئية متعددة، سواء عن طريق المناعية، في hybridizat الموقعيتطلب أيون، أو البقع الخاصة، مقاطع متعددة وحتى عينات متعددة لأداء مناسب. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الاستجابات متعددة لا يمكن أن يشترك في تتمركز في نفس الخلية، وأحيانا لا يمكن أن يشترك مترجمة إلى منطقة محددة ضمن عينة معينة. كما يتحرك علم الجينوم وepigenomics الملعب في العصر الرقمي، يجب مجال النسيجي أيضا أن تحذو حذوها لتوفير كفاءة والإنتاجية العالية، والتحليل الآلي من مجموعة متنوعة من العلامات الجزيئية في قسم النسيجي واحد.
في الواقع، هناك طلب لتحسين تقنيات النسيجية التي يمكن ربط الإشارات الجزيئية متعددة لخلايا معينة في عينة معينة. في الآونة الأخيرة، نشرنا طريقة cryohistological الإنتاجية العالية جديد لتقييم العديد من تدابير الاستجابة في قسم معين من الأنسجة المعدنية 5-14. وتنطوي العملية على استقرار cryosection مع cryotape المجمدة، والتمسك قسم مسجلة بشكل صارم لشريحة المجهر، وإجراء عدة جولات من تلطيخ والتصوير على كل قسم. ثم يتم محاذاة هذه الجولات من الصور يدويا أو عن طريق أتمتة الكمبيوتر قبل تحليل الصور (الشكل 1). هنا، نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لهذه العملية وتقديم أمثلة حيث تحسنت هذه التقنيات فهمنا من العمليات البيولوجية المختلفة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وافقت جامعة جنة رعاية الحيوانات المؤسسي واستخدام مركز الصحة كونيتيكت جميع الإجراءات الحيوانية.
1. التثبيت وتضمينها
- الموت ببطء الحيوان عبر CO 2 الخنق أو طرق أخرى معتمدة.
- حصاد الأنسجة من الاهتمام (على سبيل المثال، أطرافهم، فقرات، الخ) ووضعه في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة في 4 درجات مئوية حتى الثابتة بشكل صحيح. عناية خاصة للحفاظ على وضع تشريحي ثابت قبل التثبيت. على سبيل المثال، وتحديد أطرافه مع المفاصل في انثناء ثابت، والتناوب الداخلي، والدوران الخارجي زوايا 11. عادة، وتحديد أطرافه الماوس كاملة ل1-3 أيام.
تحذير: الفورمالين غير سامة، ويجب أن يتم التعامل معها في غطاء الدخان في حين ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
ملاحظة: الإطار الزمني لتثبيت يعتمد على حجم العينة. إذا سمحت التجربة، وقطع مفتوحة عظم شأنها تحسين تثبيت للمقصورة نخاع.قد تتطلب بعض العينات نضح تثبيت 15 للحد من الخلفية الفلورسنت (على سبيل المثال، إشارات الفلورسنت باهتة داخل نخاع العظام). - نقل العينات المأخوذة من الفورمالين إلى 30٪ سكروز المحرز في برنامج تلفزيوني 1X واحتضان لمدة 12-24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: بمجرد المحتضنة لمدة 12-24 ساعة، ويمكن بعد ذلك أن توضع العينات في -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. ينصح بهذا الأسلوب لتخزين التجارب التي الباحثين تنوي تضمين عينات متعددة في نفس الكتلة ولكن قد لا يحصد كل من هذه العينات في نفس الوقت (على سبيل المثال، والتجارب مع نقاط زمنية متعددة). - إزالة عينات من السكروز وتشريح بعيدا أي نوع من الأنسجة الزائدة.
- ملء cryomold (حجم القالب يعتمد على حجم العينة) جزء من الطريق مع البرد تضمينها المتوسطة. وضع العينة في القالب بحيث قطع الطائرة لمنطقة الفائدة موازية مع الجزء السفلي من القالب.
ملاحظة: مثال على وضع الأنسجة محددة والتوجهيمكن العثور عليها في الشكل 2A - B. - وضع cryomold على قطعة من الثلج الجاف حتى طبقة رقيقة من البرد تضمين تجميد المتوسطة، وبعد ذلك يحدد العينة في المكان. ملء حجم المتبقية من cryomold مع البرد تضمينها المتوسطة مع الحفاظ على cryomold على بيليه الثلج الجاف.
- وضع cryomold في وعاء يحتوي على 2-ميثيل بيوتان قبل فتور من قبل الثلج الجاف. مرة واحدة يتم تجميد العينات تماما، وإزالة cryomolds والتخلص من فائض 2-ميثيل بيوتان. التفاف cryomolds في السيلوفان وضعها في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية الثلاجة لمدة التخزين.
ملاحظة: يمكن أن عينات تجف مع مرور الوقت عند تخزينها في البرد تضمين المتوسطة، وخاصة في -20 درجة مئوية. نوصي تخزين العينات لمدة أطول من 1-2 أشهر في البرد تضمين المتوسطة في -80 درجة مئوية أو 30٪ سكروز في -80 درجة مئوية (راجع الخطوة 1.3).
2. استقرت الشريط الأنسجة باجتزاء
- إزالة كتل عينة من الثلاجة ووضعها في cryostaر مع درجة حرارة يقع بين -20 و -25 درجة مئوية.
- إزالة كتلة من cryomold وتقليم بعيدا البرد الزائد تضمين المتوسطة بشفرة حلاقة.
- وضع بعض البرد تضمين المتوسطة على القرص العينة ثم محاذاة كتلة هذا أن سطح القرص عينة موازية للسطح السفلي من كتلة وبالتالي تأسيس الطائرة القطع المناسبة للمنطقة من الفائدة.
- ضع القرص العينة في ناظم البرد والسماح للالبرد تضمين المتوسطة لتجميد.
- ضع القرص عينة على رأس عينة وضبط الرأس مثل أن التخفيضات شفرة موازية لسطح كتلة العينة.
- تقليم كتلة أسفل إلى مستوى داخل المنطقة من الفائدة وتهوين أي حلاقات من سطح الكتلة.
- قطع قطعة من cryotape كبيرة بما يكفي لتغطية المنطقة من اهتمام وقبل البرد في ناظم البرد.
ملاحظة: يمكن خفض قطع متعددة من أحجام متناسقة وتخزينها داخل cryostفي خلال باجتزاء. - إزالة الدعم غير ملتصقة من cryotape من خلال استيعاب الشريط بواسطة علامات التبويب غير لزجة الفضة / الذهب باستخدام ملقط ثم وضع الشريط على كتلة الجانب زجة باستمرار.
- ممارسة الضغط على لcryotape باستخدام الأسطوانة (الشكل 2C).
- جعل القسم (5-8 ميكرون) باستخدام المحرك التلقائي أو اليدوي قطع عجلة من ناظم البرد.
ملاحظة: ومن الممارسات الجيدة لعقد حافة cryotape كما أنه يأتي على خشبة المسرح مثل أن القسم لا تسقط من على خشبة المسرح خلال باجتزاء (الشكل 2D). - وضع الجانب قسم الأنسجة حتى على شريحة المجهر بلاستيكية داخل ناظم البرد.
- إزالة الشريحة البلاستيكية من ناظم البرد والسماح للالبرد تضمين المتوسط وتذوب مثل أن القسم تتمسك سطح الشريحة.
- كرر باجتزاء لمسلسل أقسام أو مناطق أخرى من الفائدة.
- الانتهاء مرة واحدة، وتخزين المقاطع في مربع الشرائح لر 4 -20 أو -80 درجة مئوية تبعا لطول التخزين المطلوبة وتدابير الاستجابة المصب. على سبيل المثال، استخدام الشرائح التي سوف تكون ملطخة عن النشاط الأنزيمي (انظر 5،2-5،3) في غضون شهر إذا المخزنة في 4 درجات مئوية.
3. التصاق أقسام لمجهر الشرائح
- الأشعة فوق البنفسجية يمكن علاجها طريقة اللصق.
- تسمية شريحة المجهر.
ملاحظة: للحصول على زيادة التشغيل الآلي، والعينات والشرائح يمكن أن توصف مع الباركود. - تطبيق قطرة من مادة لاصقة البصرية تنشيط للأشعة فوق البنفسجية لمدة الشرائح الزجاجية واستخدام حافة شريحة بلاستيكية لانتشار طبقة رقيقة من مادة لاصقة على سطح الشرائح الزجاجية.
- قطع التبويب الفضة / الذهب ووضع الجانب قسم الأنسجة مسجلة حتى على لاصق من الشريحة الأولى. تطبيق القسم في حركة متجددة من حافة واحدة إلى أخرى من أجل التقليل من تشكيل فقاعات شرك تحت الشريط.
ملاحظة: يتم استخدام الشريحة الأولى إلى ما قبل الرطب السفلي من ركان الشريط قبل وضعه على الثانية شريحة (دائمة) (الخطوة 3.1.4). - إزالة المقطع مسجلة من الشريحة الأولى ووضعه على طبقة لاصقة من الشريحة الثانية (الشكل 3A). مرة أخرى، واتخاذ الحذر لتجنب الوقوع في الشرك من الفقاعات.
ملاحظة: هذه الخطوة يأخذ الممارسة لإتقان. - مرة واحدة يتم وضع عدد مناسب من المقاطع لتجربة معينة على كل شريحة، تمحو لاصقة الزائد من المناطق المحيطة بها.
- تفقد كل قسم عن كثب بحثا عن فقاعات أو الألياف تحت الشريط. تنفيذ هذا التفتيش تحت المجهر أو العدسة المكبرة. إذا كانت هناك عوائق، وإزالة القسم الفردي، وإزالة العوائق، ومن ثم تطبيق ذلك على شريحة زجاجية.
- مرة واحدة يتم تحديد أن عدم وجود عوائق في إطار الأبواب مسجلة، وضع شرائح المجهر تحت ضوء أسود للأشعة فوق البنفسجية ل5-10 دقيقة لتشعبي لاصقة.
- تسمية شريحة المجهر.
- طريقة اللصق الشيتوزان.
- إعداد عشره 1٪ لاصقة الشيتوزان. تحضير محلول حمض الخليك عن طريق إذابة 0.25 مل من حمض الخليك المركز في 100 مل من الماء DI (0.25٪ ت / ت). حل 1 غرام من مسحوق الشيتوزان في 100 مل من محلول حمض الخليك وتحريك يا حل / N أو حتى يذوب كل مسحوق الشيتوزان.
ملاحظة: الحل هو مستقر في RT. - إيداع قطرة من حل الشيتوزان لكل قسم التي سيتم وضعها على الشريحة.
- قطع التبويب الفضة / الذهب من الشريط ووضع كل جانب الأنسجة قسم مسجلة حتى على لاصق (الشكل 3A). استخدام عناية كبيرة لتجنب الوقوع في الشرك من الفقاعات.
- متى وضعت كل أقسام على الشريحة، إمالة الشريحة أعلى على أحد أطرافها طويلة وسحب الشيتوزان المفرط إلى الحافة السفلية باستخدام ملقط.
- وضع الشرائح في هذا التوجه على رأس منشفة ورقية في صندوق الشرائح. والجاذبية تسبب ثم الشيتوزان الزائد لتسقط على منشفة، مما أسفر عن طبقة مسطحة وموحدة من الشيتوزان.
- جيش التحرير الشعبى الصينىم مربع الشرائح مع غطائه مسنود مفتوحة في الثلاجة يا / N للسماح للالشيتوزان لتجف.
ملاحظة: انظر الجدول 1 للاطلاع على مقارنة بين طريقتين لاصقة.
- إعداد عشره 1٪ لاصقة الشيتوزان. تحضير محلول حمض الخليك عن طريق إذابة 0.25 مل من حمض الخليك المركز في 100 مل من الماء DI (0.25٪ ت / ت). حل 1 غرام من مسحوق الشيتوزان في 100 مل من محلول حمض الخليك وتحريك يا حل / N أو حتى يذوب كل مسحوق الشيتوزان.
4. تطبيق علامات الإشارة إلى الشرائح
- إعداد مرجعية الحل علامة عن طريق تذويب 50 ميكرولتر من الأخضر و50 ميكرولتر من المجهرية الحمراء في 100 ميكرولتر من المياه. تخزين الحل في الظلام عند 4 درجات مئوية.
- وضع 10 ميكرولتر أو 20 ميكرولتر طرف الماصة في حل microsphere. إضافة قطرة صغيرة من الحل microsphere إلى كل قسم المتاخمة لمنطقة الفائدة (الشكل 3C). كن حذرا حتى لا تحصل المجهرية داخل المنطقة من الفائدة.
- تجفيف الشرائح في RT (محمية من الضوء) لمدة 30 دقيقة إذا تجهيز الشرائح في ذلك اليوم. إذا لم يكن كذلك، وضع الشرائح في مربع الشريحة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: ما دام الحل microsphere يجف قبل ترطيب الشرائح، وميلستبقى crospheres الالتزام بها الشرائح خلال جولات متعددة من تلطيخ / التصوير.
5. جولات متعددة من تلطيخ
ملاحظة: عن طريق اختيار تسلسل متوافق من التصوير، والتلوين، والخطوات reimaging، فمن الممكن للكشف عن وشارك في توطين العديد من الإشارات البيولوجية على قسم الأنسجة نفسه. كل جولة من التصوير / تلطيخ / reimaging لابد من تطويرها لمسألة النسيجي معين. يتضمن تسلسل التصوير / تلطيخ / reimaging عادة الحصول على إشارات الفلورسنت الذاتية (على سبيل المثال، GFP الخلوي، والأصباغ تمعدن في الجسم الحي تحقيقات التصوير) في الجولة الأولى من التصوير تليها المناعية المضاعفة الفلورسنت وجولات متعددة من البقع النشاط الأنزيمية. وأخيرا، فإن القسم يمكن أن تكون ملطخة باستخدام الأصباغ اللونية (على سبيل المثال، H & E، طولويدين الأزرق، سفرانين O، الخ) لتسليط الضوء على بنية الأنسجة. عرض في هذا القسم هي طرق مخصصة مقتبس منالبروتوكولات المتاحة تجاريا.
- Calcein تلطيخ الأزرق للالمعدنية المتراكمة
ملاحظة: Calcein تلطيخ الأزرق ينتج سطح معدني ثابت وهذا هو قابلة للتحليل الصور الآلي خلافا الساحة المظلمة أو تفاضلي تدخل النقيض (DIC) التصوير. مشكلة مع تلطيخ الأزرق calcein هي أن الطيف الفلورسنت يتداخل مع التتراسيكلين ووضع العلامات الديميكلوسيكلين. ولذلك، إذا كانت العينة تحتوي هذه التسميات المعدنية، صورة التسميات في الجولة الأولى من التصوير قبل تلطيخ مع calcein الأزرق.- إذا التقط إشارات الذاتية داخل أنسجة قبل هذه الخطوة تلطيخ، غمر الشرائح من الجولة التصوير سابقة في جرة coplin مليئة 1XPBS حتى تسقط زلات غطاء بعيدا عن الشرائح. إزالة وتجفيف زلات الغطاء.
- إعداد 30 ملغ / مل من calcein حل الأزرق في 2٪ NaHCO 3 (الذي أدلى به حل ز 2 NaHCO 3 في 100 H 2 O مل وضبطجي لدرجة الحموضة 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك). قسامة وتخزين الحل في -20 درجة مئوية.
- تزج الشرائح في جرة coplin التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة على ترطيب أقسام، إن لم يكن رطب بالفعل من الجولة السابقة.
- إزالة الشرائح وتجفيف الظهر وحواف مع منشفة ورقية.
- تطبيق 100-500 ميكرولتر من محلول أزرق calcein لكل شريحة واحتضان لمدة 10 دقيقة في غرفة الرطوبة في RT.
- شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة مع 3 تغييرات.
- تطبيق ~ 200 ميكرولتر من 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X إلى كل شريحة وجبل انزلاق الغطاء.
- إزالة الجلسرين الزائد وتجف أسفل الشرائح.
- مقاومة للطرطرات حمض الفوسفاتيز (TRAP) تلطيخ النشاط الأنزيمي
وأعرب عن TRAP من أنواع خلايا متعددة في النسب المكونة للدم بما في ذلك الخلايا الآكلة: ملاحظة. تلطيخ TRAP المعروضة هنا يستخدم الصفراء الفلورسنت الركيزة حمض الفوسفاتيز. وإشارات الفلورسنت بعض اوفerlap مع مجموعة فلتر الأصفر مخصصة بما في ذلك التتراسيكلين / تسميات ديميكلوسيكلين تمعدن، calcein وصمة عار الأزرق، ودابي مباين.- غمر الشرائح من الجولة التصوير سابقة في جرة coplin مليئة برنامج تلفزيوني 1X حتى تسقط زلات غطاء بعيدا عن الشرائح. إزالة وتجفيف زلات الغطاء.
- إعداد العازلة 1 عن طريق إذابة 9.2 غرام من الصوديوم اللامائية خلات و 11.4 غرام من طرطرات الصوديوم ثنائي القاعدة ثنائي الهيدرات في الماء ويصل الحجم النهائي إلى 1000 مل. ضبط درجة الحموضة إلى 4.2 مع حمض الخليك الجليدية المركزة (~ 1،5-2 مل). تخزين الحل في 4 ° مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
- إعداد العازلة 2 عن طريق إذابة 40 ملغ من نتريت الصوديوم في المياه ويصل الحجم النهائي إلى 1 مل. تخزين الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
- في يوم تلطيخ، وإعداد رد فعل العازلة عن طريق خلط 7.5 مل من العازلة 1 و 150 ميكرولتر من العازلة 2.
- تطبيق عازلة رد فعل دون الركيزة إلى الشريحةالصورة عن 10-15 دقيقة للتوازن الأنسجة في الرقم الهيدروجيني أقل.
ملاحظة: حجم النموذجي هو ~ 200 ميكرولتر ولكن يحتاج إلى أن تكون كبيرة بما يكفي لتغطية جميع الأقسام. - تمييع الصفراء الفلورسنت الركيزة حمض الفوسفاتيز بين 01:50 و 1: 100 في المخزن المؤقت رد فعل.
سيتم تمليها التخفيف من النشاط TRAP ضمن العينة: ملاحظة. - صب رد فعل العازلة الخروج من الشرائح وتطبيق رد فعل العازلة مع الركيزة الفلورسنت الصفراء على الشرائح.
- ضع الشرائح تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية الأسود ل~ 5 دقائق لتنشيط الركيزة.
قد تختلف فترة حضانة اعتمادا على النشاط TRAP ضمن العينة: ملاحظة. - شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة مع 3 تغييرات.
- تطبيق ~ 200 ميكرولتر من 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X إلى كل شريحة وجبل انزلاق الغطاء.
- إزالة الجلسرين الزائد وتجف أسفل الشرائح.
ملاحظة: سوف المخزن المؤقت TRAP الحمضية يزيل الكلس الأقسام. فائدة إضافية من decalcificaنشوئها هو أن بعض الألوان سيكون متاحا مرة أخرى لتلطيخ المصب (على سبيل المثال، والعلامات تمعدن). على سبيل المثال، سيتم إزالة تلطيخ الأزرق calcein خلال تلطيخ TRAP. لذلك، دابي مباين يمكن تصوير في هذه القناة خلال جولة لاحقة.
- الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) تلطيخ النشاط الأنزيمي
ملاحظة: أنواع الخلايا متعددة تشارك مع تمعدن بما في ذلك الخلايا بانية العظم والتمعدن غضروفية تعبر عن AP. الركيزة الحمراء السريعة المستخدمة في هذا البروتوكول يثير على حد سواء الحمراء واللونية الإشارة الحمراء الفلورسنت. وبسبب هذا، فإن الركيزة اللونية إرواء إشارات الفلورسنت في المناطق التي ترسب الركيزة. ولذلك، فمن الأفضل أن تفعل هذا وصمة عار بعد تصوير إشارات الفلورسنت التي يمكن أن تطفئ من الركيزة AP.- غمر الشرائح من الجولة التصوير سابقة في جرة coplin مليئة برنامج تلفزيوني 1X حتى تسقط زلات غطاء بعيدا عن الشرائح. ريمولقد وتجفيف زلات الغطاء.
- إعداد 1 M تريس عن طريق إذابة 12.1 غرام من تريس في 100 مل من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 9.5 مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
- إعداد 1 M MgCl 2 هيدرات عن طريق إذابة 20.33 غرام من MgCl 2 في 100 مل من الماء منزوع الأيونات.
- إعداد 2 M كلوريد الصوديوم عن طريق إذابة 11.68 جم كلوريد الصوديوم في 100 مل من الماء منزوع الأيونات.
- إعداد 100X (20 ملغ / مل) حل سهم سريع الأحمر TR الملح عن طريق إذابة مسحوق 1 غرام في 50 مل من الماء منزوع الأيونات. جعل 100 مكل ومخزن في -20 درجة مئوية.
- إعداد 100X (10 ملغ / مل) حل سهم الفوسفات نفثول AS-MX عن طريق إذابة مسحوق 500 ملغ في 50 مل من ن، ن ثنائي ميثيل الفورماميد. جعل 100 مكل ومخزن في -20 درجة مئوية.
- في يوم تلطيخ، وإعداد عازلة AP بإضافة 1 مل من 1 M تريس، 0.5 مل من 1 M MgCl 2، 0.5 مل من 2 M كلوريد الصوديوم وجلب الحجم النهائي إلى 10 مل باستخدام الماء منزوع الأيونات (تركيزات النهائي: 100 ملم تريس، 50 ملي MgCl 2، 100 مم كلوريد الصوديوم).
- وضع AP بuffer على كل شريحة واحتضان في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقيقة في RT.
- إعداد عازلة الركيزة ا ف ب عن طريق تمييع 100X مخزونات سريع الأحمر TR الملح ونفثول AS-MX ل1x أخرى في المنطقة العازلة AP.
- صب عازلة AP الخروج من الشرائح واستبدالها مع عازلة AP الركيزة. احتضان الشرائح ل5-10 دقائق في غرفة الرطوبة في RT.
سيتم تمليها فترة حضانة حسب النشاط AP العينة: ملاحظة. - غسل الشرائح 3X في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- جبل غطاء ينزلق مع حل دابي counterstaining (1: 1000 تخفيف من دابي في 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X).
- طولويدين الأزرق O (السل) تلطيخ مولد اللون
ملاحظة: لأن يتم تصوير جميع الخطوات السابقة في ظل تصاعد مائي مؤقت في 50٪ الجلسرين / حل برنامج تلفزيوني، وتصوير الخطوة اللونية أيضا في ظل ظروف المائية. ومع ذلك، فإن الحل تلطيخ قد تميل ليتش مع مرور الوقت. لذلك، يقترح لصورة الأزرق طولويدين في أقرب وقت ممكن بعد تلطيخ.- غمر الشرائح من جولة التصوير سابقة في جرة coplin مملوءة بالماء منزوع الأيونات حتى تسقط زلات غطاء بعيدا عن الشرائح. إزالة وتجفيف زلات الغطاء.
- بعد إزالة زلات غطاء، مع استبدال الماء العذب واحتضان الشرائح لمدة 10 دقيقة على الأقل بحيث تتم إزالة الأملاح من برنامج تلفزيوني بشكل كاف من الأنسجة.
- يعد حل مرض السل 0.025٪ في الماء منزوع الأيونات.
- ضع الشرائح في حل السل عن 1-5 دقائق.
ملاحظة: فترة حضانة يعتمد على تفضيل المستخدم ولكن يجب أن تبقى متناسقة عبر جميع العينات. - مكان الشرائح في جرة coplin مع الشرائح المياه وغسل منزوع الأيونات 3X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- جبل تغطية زلة مع 30٪ الجلسرين المذاب في الماء منزوع الأيونات (وليس برنامج تلفزيوني 1X وهذا سوف يسبب وصمة عار ليتش الخروج من الأنسجة). ملاحظة: يمكن أن تكون بديلا الجلسرين المتوسطة المتزايدة مع شراب الفركتوز، مما يساعد على منع انتشار وصمة عار من الأنسجة. إلىتحضير شراب الفركتوز، حل 30 غراما من الفركتوز في 10 مل من الماء منزوع الأيونات والحرارة إلى 60 درجة مئوية حتى يذوب.
6. جولات متعددة من التصوير
- تحميل الشرائح في الأدراج المجهر (الشكل 3D).
ملاحظة: صواني هي الربيع المحملة. - إدراج الصواني في كومة علبة من المجهر مسح الشريحة (الشكل 3E).
- انقر على صورة قائمة لتحميل الملف الشخصي لكل شريحة مع أوقات التعرض المناسبة لكل fluorophore. انقر على اسم الشريحة على سبيل المثال كل شريحة يدويا أو لديك برنامج قراءة الباركود المقدمة على التسمية الشريحة. انقر على زر بدء الفحص معاينة لالتقاط صورة معاينة الشريحة.
- تعيين المناطق ذات الاهتمام في المعالج كشف الأنسجة وحفظها لجولات لاحقة من التصوير. مرة واحدة كل شريحة هي الإعداد، بدء عملية المسح الضوئي عن طريق النقر على زر البداية المسح الضوئي.
ملاحظة: لا يمكن للنظام تعقد ما يصل إلى 100 سليدي في وقت واحد. - بمجرد الانتهاء من التصوير، وتصدير الصور من كل قناة والتصوير الجولة الفردية. TIF أو ملفات .JPG لتجميع الصور وتحليلها.
7. صورة الجمعية
- الطريقة اليدوية باستخدام برنامج فوتوشوب (أو ما شابه ذلك برامج تحرير الصور قادرة على إنتاج صور الطبقات).
- فتح كل صورة قناة الفردية من كل جولة التصوير.
- تجميع الصور الفردية على هيئة طبقات في صورة واحدة مركبة. للقيام بذلك، انقر على طبقة في لوحة طبقة من صورة واحدة. ثم اسحب طبقة على صورة أخرى. وهذه عملية السحب والإسقاط خلق طبقة جديدة في الصورة. هل هذا لجميع الصور الأخرى. بدلا من ذلك، استخدام برنامج نصي (ملف> مخطوطات> تحميل الملفات إلى المكدس ...) لأتمتة هذه العملية عن طريق تحميل ملفات الصور متعددة على هيئة طبقات في كومة الصورة.
- مرة واحدة يتم سرد كل صورة كطبقة الفردية في صورة مركبة، انقر مرتين على اسم الطبقة لإعادة تسمية لاyers حسب الحاجة لتمييز قنوات مختلفة.
- من أجل أن نرى من خلال كل طبقة وخلق صورة مركبة حقا، تغيير وضع مزيج من أجل كل طبقة من "عادي" إلى "الشاشة" ضمن لوحة طبقة.
ملاحظة: لتسريع هذه الخطوة، تغيير طبقة واحدة على الشاشة، ثم انقر بزر الماوس الأيمن على طبقة، حدد "نسخة نمط الطبقة"، ثم تسليط الضوء على جميع الطبقات الأخرى واختر "لصق نمط الطبقة" لتطبيق اسلوب شاشة إلى أخرى طبقات. - إذا رغبت في ذلك، والحد من التعتيم (قيمة التغيير إلى 10-40٪) من الطبقة اللونية (أي طولويدين الأزرق) لتصور إشارات الفلورسنت أفضل من خلال طبقة اللونية.
ملاحظة: مجهر المسح تجانب المستخدمة في هذا البروتوكول يحمل الشرائح في 3 الحواف، وبالتالي تقليل كمية الدوران التي يمكن أن تحدث إلى الشريحة خلال كل جولة من التصوير. وبالتالي، فمن الأسهل بكثير للمستخدم لمحاذاة الصور يدويا دون الحاجة إلى تدوير الصور المستمدةمن جولات مختلفة من التصوير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وسير العمل العام من أجل عالية الإنتاجية، متعدد صورة Cryohistology
يمثل الشكل 1 سير العمل عام يستخدم لوصف هذه التقنية. وهو يتضمن العديد من الخطوات من التثبيت من خلال عدة جولات من التصوير وأخيرا صورة المحاذاة / التحليل. هذه العملية يمكن أن تستغرق أقل قدر أسبوع للذهاب من عينة التثبيت من خلال 4 جولات من التصوير، وهو وق...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا قدمنا بروتوكول cryohistology مفصل للمشاركة في توطين وتحديد العديد من الإجراءات البيولوجية عن طريق مواءمة الصور من جولات متعددة من تلطيخ / التصوير في مقطع واحد. الطريقة الموضحة باستخدام cryotape يكون مفيدا بشكل خاص لأنها تحافظ على التشكل من الصعب قسم الأنسجة (على سبيل المثال، العظام المعدنية والغضاريف). وبالإضافة إلى ذلك، يتم الالتزام الأنسجة مقطوع بقوة إلى الشريحة الزجاجية، والسماح لجولات متعددة من تلطيخ / التصوير من نفس القسم. على عكس الطرق التقليدية حيث يتم ملطخة ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
يود المؤلفون الاعتراف بمصادر التمويل التالية: NIH R01-AR063702 و R21-AR064941 و K99-AR067283 و T90-DE021989.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10٪ فورمالين محايد | مخزن سيجما ألدريتش | HT501128-4L | العديد من الموردين المتاحين. سام. يمكن استبداله بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد. |
| السكروز | سيجما ألدريتش | S9378 | العديد من الموردين المتاحين. |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | العديد من الموردين المتاحين. |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand # 22-363-554 | يمكن استخدام أحجام مختلفة اعتمادا على الأنسجة |
| يمكن استبدال Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | بأجهزة تبريدية أخرى. ومع ذلك ، فإن الراتنجات القائمة على PVA / PEG عملت بشكل أفضل في أيدينا. |
| 2-ميثيل بوتان | سيجما ألدريتش | M32631 | العديد من الموردين المتاحين. |
| استبدال Cryostat | Leica Biosystems | 3050s | بعلامات تجارية / نماذج أخرى. |
| يمكن استبدال قرص العينة | Leica Biosystems | 14037008587 | بعلامات تجارية / نماذج أخرى. |
| يمكن استبدال شفرات Cryostat | Thermo Scientific | 3051835 | بعلامات تجارية / موديلات أخرى. |
| الشريط الكهربائي | مختبر | Cryofilm 2C | |
| الأسطوانة | علوم المجهر الإلكتروني | 62800-46 | يمكن استبدالها بعلامات تجارية / نماذج أخرى. |
| شرائح المجهر البلاستيكي | علوم المجهر | الإلكتروني 71890-01 | يمكن استبدالها بعلامات تجارية / نماذج أخرى. |
| يمكن استبدال شرائح المجهر الزجاجي | Thermo Scientific | 3051 | بعلامات تجارية / نماذج أخرى. |
| لاصق بصري نورلاند ، 61 | نورلاند | البصري ، 61 | |
| أسود للأشعة فوق البنفسجية | جنرال إلكتريك | F15T8-BLB | |
| حمض الخليك الجليدي | سيجما ألدريتش | ARK2183 | العديد من الموردين المتاحين. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | C3646 | العديد من الموردين المتاحين. |
| InSpeck microscopheres الأحمر | ThermoFisher Scientific | I-14787 | |
| InSpeck المجهرية الخضراء | ThermoFisher Scientific | I-14785 | |
| Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | العديد من الموردين المتاحين. |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | العديد من الموردين المتاحين. |
| Alizarin complexone | Sigma Aldrich | A3882 | العديد من الموردين المتاحين. |
| ديميكلوسيكلين | سيجما ألدريتش | D6140 | العديد من الموردين المتاحين. |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | العديد من الموردين المتاحين. |
| الجلسرين | سيجما ألدريتش | G5516 | العديد من الموردين المتاحين. |
| قزم 97 الركيزة الفوسفاتيز حمض الفلورسنت الأصفر | ThermoFisher Scientific | E-6588 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | العديد من الموردين المتاحين. يمكن استبداله ب Hoechst 33342 أو أصباغ نووية أخرى. |
| TO-PRO-3 (Cy5 Counterstain النووي) | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| بروبيديوم يوديد | ThermoFisher Scientific | R37108 | العديد من الموردين المتاحين. |
| أسيتات الصوديوم اللامائية | Sigma Aldrich | S2889 | العديد من الموردين المتاحين. |
| طرطرات الصوديوم ثنائي الهيدرات الأساسي | سيجما ألدريتش | T6521 | العديد من الموردين المتاحين. |
| نتريت الصوديوم | Sigma Aldrich | S2252 | العديد من الموردين المتاحين. |
| تريس | سيجما ألدريتش | 15504 | العديد من الموردين المتاحين. |
| MgCl2< / sub> سداسي هيدرات | سيجما ألدريتش | M9272 | العديد من الموردين المتاحين. |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | العديد من الموردين المتاحين. |
| سريع الأحمر TR الملح | سيجما Aldrich | F8764 | العديد من الموردين المتاحين. يمكن أيضا استبدالها بمجموعات الركيزة الأخرى مثل Vector Blue (Vector Laboratories, Cat # SK-5300) |
| Naphthol AS-MX | Sigma Aldrich | N4875 | العديد من الموردين المتاحين. |
| N ، N ثنائي ميثيل فورماميد | سيجما ألدريتش | D158550 | العديد من الموردين المتاحين. |
| تولويدين الأزرق O | Sigma Aldrich | T3260 | العديد من الموردين المتاحين. |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | يمكن أيضا استخدام ماسحات ضوئية خطية أو مبلطة أخرى. |
| مجموعة مرشحات DAPI | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| مجموعة مرشحات CFP | شركة Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| مجموعة مرشحات GFP | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| YFP مجموعة مرشحات | Chroma Technology Corp. | 49003 | |
| مجموعة مرشحات مخصصة صفراء (ELF 97) | Chroma Technology Corp. | تقليد; HQ409sp ، HQ555 / 30m ، 425dxcr | |
| مجموعة مرشحات TRITC | Chroma Technology Corp. | 49004 | |
| مجموعة مرشحات Cy5 | شركة Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| نظام نقل الشريط CryoJane | علوم المجهر الإلكتروني | 62800-10 | العديد من الموردين المتاحين. |
| CryoJane Tape Windows | علوم المجهر الإلكتروني | 62800-72 | العديد من الموردين المتاحين. |
| CryoJane شرائح لاصقة علوم | المجهر الإلكتروني | 62800-4X | العديد من الموردين المتاحين. |
المراجع
- Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
- Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).
- Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).
- Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).
- Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).
- Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).
- Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).
- Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).
- Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
- Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
- Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).
- Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
