Method Article

والطريقة غير الغازية ومن الناحية الفنية غير كثيفة للتحريض وPhenotyping التجريبية البكتيرية والالتهاب الرئوي في الفئران

DOI:

10.3791/54508

⸱

September 28th, 2016

 , 
1Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS), National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وصفت العديد من الطرق في الأدب لنمذجة الالتهاب الرئوي الجرثومي في الفئران. هنا، نحن تصف غير الغازية، وغير مكلفة، طريقة سريعة لإحداث الالتهاب الرئوي عن طريق الطموح (أي استنشاق) من اللقاح البكتيري pipetted في البلعوم. طرق المصب لتقييم الاستجابة المناعية الفطرية الرئوية هي أيضا مفصلة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع لا يزال يمثل مشكلة صحية عامة رئيسية، ونماذج الفئران من الالتهاب الرئوي البكتيري قد سهلت مؤخرا التقدم قبل السريرية كبيرة في فهمنا للالمرضية الخلوية والجزيئية الكامنة. والنماذج الحية الماوس التقاط علم وظائف الأعضاء المتكاملة ومرونة الاستجابة دفاع المضيف في بطريقة لم تكشف من قبل، فيفو النهج السابق مبسطة بديلة. وقد وصفت العديد من الطرق في الأدب للتلقيح داخل الرئة من البكتيريا في الفئران، بما في ذلك هباء، والتسليم داخل الأنف، بطريق الفم إقناء؛ إدخال القنية القصبة الهوائية في ظل ظروف "العمياء" وتصور، وعبر الجلد إقناء؛ إدخال القنية القصبة الهوائية. كل الطرق لها المزايا النسبية والقيود. هنا، نحن تصف بالتفصيل طريقة غير الغازية، من الناحية الفنية غير كثيفة، وغير مكلفة، وسريع للتسليم داخل القصبة الهوائية من البكتيريا التي ينطوي الطموح (أي استنشاق) عن طريق الماوسلقيحة المعدية pipetted في البلعوم وهو تحت التخدير العام. هذه الطريقة يمكن استخدامها لتسليم الرئوي من مجموعة واسعة من العوامل البيولوجية والكيميائية غير الكاوية، وسهلة نسبيا للتعلم، حتى بالنسبة للمختبرات لديهم خبرة سابقة الحد الأدنى للإجراءات الرئوية. بالإضافة إلى وصف طريقة الالتهاب الرئوي التنفسي، ونحن نقدم أيضا إجراءات خطوة بخطوة لمعايرة اللاحقة في الجسم الحي الاستجابة المناعية الفطرية الرئوية من الفأرة، على وجه الخصوص، وأساليب لقياس إزالة البكتيريا والاستجابة المناعية الخلوية من مجرى الهواء المصاب. هذا نهج متكامل وبسيط لتقييم التهاب رئوي يسمح للتقييم السريع والقوي للتأثير التلاعب الوراثية والبيئية على الحصانة الفطرية الرئوية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال المجتمع المكتسبة الالتهاب الرئوي هو السبب الرئيسي للوفاة من العدوى في الولايات المتحدة، مع تغير ضئيل عموما في معدلات الوفيات على مدى السنوات ال 40 الماضية على الرغم من التحسينات في التطعيم واستراتيجيات المضادات الحيوية 1،2. وعلى الرغم من عدم إحراز تقدم ملموس على مستوى الصحة العامة، في السنوات الأخيرة تم إحراز تقدم كبيرة في فهمنا للالمرضية الجزيئية والخلوية من الالتهاب الرئوي، مع العديد من هذه الخطوات جعل الأمام ممكن عن طريق استخدام نماذج الماوس من التهاب في الرئتين. وقابلية الإستطراق الوراثي للفأرة، والتشابه من الفئران وجهاز المناعة البشرية، ومجموعة واسعة من الكواشف المناعية التي تستهدف الفئران التي أصبحت متاحة تجاريا سهلت معا التقدم السريع في هذا المجال.

وقد اعتمدت نماذج الماوس من الالتهاب الرئوي الجرثومي وصفها في الأدب عموما على واحد من أربعة مسارات التقنية للتلقيح الممرض: ط) هباء. ب) INTRتسليم anasal. ج) تسليم بطريق الفم. والرابع) الحقن داخل الرغامى الجراحية (أي القصبة الهوائية) 3. جميع طرق العدوى لها مزايا وعيوب 3. ولا سيما، والتعرض النسبي لمجرى الهواء العلوي، وقدرتها على خليط من النباتات فموي أنفي، ومتطلبات للتخدير العام، وتقلب من اللقاح تسليمها إلى الرئة البعيدة، توزيع فصي من مسببات الأمراض تسليمها، ومتطلبات الخبرة التقنية، والاعتلال الإجرائي تختلف على نطاق واسع عبر هذه اقتراب.

عادة تشمل استخدام تقنيات عدوى الفم؛ بالفم القصبة الهوائية (translaryngeal) إقناء؛ إدخال القنية إما عن طريق نهج "أعمى" (غير تصور)، أو تحت الحنجرة مباشرة تصور 3-5. كلتا الطريقتين، بينما قوية، تتطلب قدرا كبيرا من التدريب وتحمل أيضا خطر الصدمة لمجرى الهواء العلوي. في هذا التقرير، وصفنا أسلوبا فنيا غير كثيفة، غير الغازية، وغير مكلفة، وسريع العدوى بطريق الفم، ثpipetted البكتيريا بموجب (الكلبسيلة الرئوية في المثال المقدمة) في البلعوم من الماوس تخدير يتم تسليمها إلى الرئتين عن طريق الطموح (أي استنشاق). نحن وآخرون استخدموا تقنية الالتهاب الرئوي التنفسي بنجاح 6-9. ويمكن تمديد هذه الطريقة الرئة التسليم تنوعا وتعلمت بسهولة إلى تقديم العديد من وكلاء غير الكاوية إضافية إلى الرئتين، بما في ذلك السيتوكينات والبروتينات الأخرى، الجزيئات المرتبطة الممرض (على سبيل المثال، lipopolysaccharide في)، والخلايا (أي نقل بالتبني)، والسموم (مثل بليوميسين). بالإضافة إلى مناقشة الاعتبارات الفنية الهامة، ونحن أيضا وصف نهج متكامل، الكمي لتقييم استجابة المضيف لاحقة إلى الالتهاب الرئوي، بما في ذلك قياس المصب إزالة البكتيريا (أي مستعمرة تشكيل وحدة [كفو] الكميات في الرئة والطرفية الأجهزة) والكريات البيض تراكم في المجال الجوي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب وفقا لقانون رعاية الحيوان وسياسة دائرة الصحة العامة الأميركية على الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية بعد مراجعة من قبل رعاية الحيوان واستخدام اللجنة لعلوم الصحة البيئية.

1. إعداد ك. الرئوية الثقافة

الحذر: تنفيذ جميع الخطوات في 2 (BSL2) هود مستوى السلامة الحيوية أو غيرها من مجال معين BSL2 وتجاهل النفايات في المبادئ التوجيهية BSL2 المعهد.

  1. للنمو تعليق ك. الرئوية، أذاب المخزون الجلسرين من البكتيريا وتطعيم ثقافة العمل عن طريق نقل 1 مل من ك. الأسهم الرئوية إلى 50 مل من مرق الصويا زيتية (TSB) في 500 مل أو أكبر قارورة.
  2. جعل الأسهم الجلسرين وذلك بإضافة 900 ميكرولتر من مثقف سجل مرحلة ك. الرئوية إلى 100 ميكرولتر من الجلسرين معقم وتجميد في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل، فمن المستحسن -80 درجة مئوية.
  3. البكتيريا الثقافة من الصورةتيب 1.1 عن طريق هز قارورة بين عشية وضحاها (14-18 ساعة) عند 37 درجة مئوية في 200-225 rpm.In أجل تعزيز النمو مرحلة السجل، وتمييع 1-5 مل من هذه الثقافة بين عشية وضحاها في قارورة تحتوي على 50 مل تسب في الصباح و المكان مرة أخرى عند 37 درجة مئوية مع الهز ل~ 2.5 ساعة.
  4. نقل 1 مل من ك. ثقافة الرئوية من الخطوة الأخيرة في أنبوب 1.5 مل وتدور في 7500 x ج لمدة 2 دقيقة. وينبغي أن يكون بيليه الأبيض مرئية. إزالة طاف دون الإخلال بيليه، و resuspend بلطف البكتيريا مع ماصة في 1 مل من محلول ملحي، وتدور مرة أخرى في 7500 x ج لمدة 2 دقيقة.
    1. تنفيذ هذه الخطوة غسل 2X، تنشئة النهائي، بيليه غسلها في 1 مل من محلول ملحي معقم.
  5. أداء التخفيفات، سجل الحكمة المسلسل من هذا اللقاح أنيق. على سبيل المثال، إضافة 400 ميكرولتر من اللقاح إلى 3.6 مل من محلول ملحي معقم بشكل متسلسل إلى اتخاذ سلسلة 10 -1 -10 -9 التخفيف.
  6. تحديد OD 600 من ك غسلها الرئوية عن طريق وضع 1 مل من01:10 و 1: 100 التخفيفات في cuvettes القابل للتصرف وقياس OD 600، المسح أولا بمحلول ملحي معقم. قياس مكررة لضمان الدقة. وOD 600 من 1.0 ما يعادل تقريبا 4-7 × 10 8 كفو / مل. لاحظ أن العلاقة بين التطوير التنظيمي وكفو / مل قد لا تكون خطية.
    1. استخدام OD 600 من التخفيفات لحساب تركيز ك. الرئوية، وتطبيق OD: تحويل كفو / مل أعلاه، والعوملة في التخفيف.
  7. استخدام ك. تركيز الرئوية لإعداد جرعة اللقاح كفو المطلوب في <100 حجم ميكرولتر للتسليم في الفئران (أنظر أدناه).
  8. أيضا لوحة 100 ميكرولتر من 10 -6 -10 -9 التخفيفات و 100 ميكرولتر من محلول ملحي على لوحات زيتية الفردية أجار الصويا (TSA) في RT. احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل وتعداد المستعمرات البكتيرية وذلك لحساب تركيز المحدد الذي تم استخدامه في تجربة وللسيطرة على التلوث.
    ملاحظة: تركيز البكتيريا الفعلي من اللقاح النهائي قد يكون ± 500 خلية / مل التي تنبأ بها الامتصاصية. يجب المجربون تأكيد مثالي OD 600: كفو / مل العلاقة في الدراسات التجريبية السابقة لاستخدامها في الجسم الحي في الفئران، وإعادة تعديل تجريبيا OD 600: كفو / تحويل مل على أساس الخبرة الشخصية.

2. الفئران داخل الرغامى (عليه) طموح ك. الرئوية من البلعوم

  1. تأكد من أن الفئران تم تحديدها بشكل فريد من علامة الذيل، والوشم، أو غيرها من المعرف المعتمدة.
  2. وضع جرعات اللقاح من البكتيريا باستخدام ماصة P200 قبل إزالة الفئران من الأيزوفلورين من أجل تسريع الإجراءات. للحصول على أفضل النتائج مع ذلك الطموح، واستخدام حجم <100 ميكرولتر لمنع تجاوز. هنا، استخدم 2000 كفو / 50 ميكرولتر من ك. الرئوية.
  3. تخدير الفئران في غرفة واضحة مع الغاز الأيزوفلورين (على سبيل المثال، 2٪ الأيزوفلورين في معدل التدفق من 1 لتر / دقيقة) أو حسب institالمبادئ التوجيهية utional. يتم تحديد عدد من الفئران لتخدير معا حسب مستوى الراحة من مجرب، وعادة 1-2 في وقت واحد. مراقبة التنفس وتأكيد مستوى التخدير مرة واحدة نفسا عميقا واضحة و2-3 ثانية يمكن عدها بين الأنفاس.
    ملاحظة: إذا كان هناك قلق حول آثار الخلط المحتملة لتقلب التخدير (استنشاق)، والتخدير يمكن أن يتحقق بدلا من ذلك مع حقن داخل الصفاق من الكيتامين / زيلازين. مع الطريقة الموصوفة أعلاه، التخدير العميق تستغرق سوى دقائق قليلة. إذا هو فعل المزيد من التخدير لفترات طويلة، وينبغي استخدام مرهم العين لمنع جفاف العين.
  4. مرة واحدة يتم تخدير الماوس، وضعه في موقف ضعيف مستلق جزئيا، مع وقف التنفيذ من قبل القواطع العلوية من الشريط المطاطي تمتد بين أوتاد على لوحة زجاجي مائلة (الشكل 1).
  5. سحب بلطف اللسان الماوس إلى جنب مع زوج من الملقط حادة غير مخدد وجرعة الإيداع في تجويف الفم مع pipett P200ه. الحذر الشديد لتجنب إحداث صدمة إما اللسان أو البلعوم.
  6. مع الحفاظ على اللسان تراجعت، تسد بلطف الأنف مع إصبع القفاز حتى يستنشق الماوس. مواصلة لتغطية الأنف حتى اتخذت الماوس اثنين أو أكثر من استنشاق، وليس السائل مرئيا في تجويف الفم. تغطية الأنف يساعد على ضمان أن الماوس سوف يستنشق الجراثيم في الرئتين، والفئران هي الاستراحات الأنف تلزم.
  7. إزالة الماوس من لوحة التلقيح والعودة إلى قفصه، ووضع الماوس على ظهرها لمنع الفراش أو الحطام من عرقلة فتحتي الأنف بينما الماوس يتعافى من التخدير.
  8. مرة واحدة وقد تم مداوي جميع الفئران ولقد استيقظ من التخدير، والفئران منزل في حجرة / غرفة تحتوي على الفئران الوحيد الذي تم مداوي مع ك. الرئوية. مراقبة الفئران يوميا، بما في ذلك وزن الجسم إذا تجاوز 48 ساعة بعد العدوى.
  9. استخدام الهريس اليومي و / أو الحرارة تكميلية إذا السماح للفئران لتجاوز 48ساعة.

3. القصبات الغسل السائل (BALF) جمع وتحليل

  1. الموت ببطء الفئران في المبادئ التوجيهية المؤسسية. هنا، واستخدام الحقن القاتلة من 150 ملغم / كغم من بنتوباربيتال الصوديوم أو الجرعة المكافئة من حل القتل الرحيم التجارية تليها استنزاف، وهذا يتجنب المضاعفات المحتملة إلى الرئتين المرتبطة CO 2 الاستنشاق وخلع عنق الرحم.
  2. موقف الماوس على ظهره وتعقيم الماوس عن طريق الرش الفراء مع الايثانول 70٪ وخاصة على منطقة الصدر والرقبة.
  3. اجراء خفض طولية أسفل عظمة القص، ثم عقد القص مع ملقط، نيك الحجاب الحاجز، والسماح للرئة أن يسقط مرة أخرى إلى تجويف الصدر. تقطيع من خلال تجويف الصدر على جانبي الأوعية الدموية وحتى ذلك الحين من خلال الرقبة، وفضح القصبة الهوائية.
  4. كما تحيط القصبة الهوائية من قبل العضلات الطولية على جانبي، وقطع بعناية عن طريق الوسط ودفع الأنسجة على الجانبين، كماهذا يتجنب قطع الأوعية الدموية المحيطة بها، والتي يمكن أن يعرض الدم إلى القصبة الهوائية. إذا رصدت الأوعية الدموية، وتنظيف المنطقة المحيطة بها مع الشاش قبل الوصول إلى تجويف القصبة الهوائية.
  5. استخدام مقص جراحي أو إبرة لنيك القصبة الهوائية حوالي ربع الطريق نزولا من الرأس وإدراج قنية تعلق على حقنة 1 مل مسبقة مع 1 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) caudally إلى القصبة الهوائية. إذا باستخدام الفئران <8 أسابيع من العمر أو الإناث، والحد من حجم lavaging إلى 600-800 ميكرولتر.
  6. دفع حجم في الرئة ببطء، مما يتيح لجميع فصوص لتضخيم ثم سحب حجم مرة أخرى للخروج مع حقنة، وتكرار 3X. إذا PBS هو الخروج من الخياشيم لم يتم دفع قنية بعيدا بما فيه الكفاية إلى القصبة الهوائية أو التضخم يحدث بسرعة كبيرة جدا. بدلا من ذلك، إذا الرئتين لا تضخم بشكل جيد، وقد دفعت قنية في غاية الآن، لذلك الانسحاب قليلا.
  7. جمع يغسل المجمعة في أنبوب 15 مل على الجليد.
  8. غزلالسائل المجال الجوي غسيل في 1200 x ج لمدة 5 دقائق، وجمع طاف في أنبوب 1.5 مل وتجميد في -80 درجة مئوية. وفي وقت لاحق، واستخدام طاف (أي BALF) لقياس البروتين، السيتوكينات، ولمختلف فحوصات الكيمياء الحيوية الأخرى. يمثل بيليه الخلايا من الفضاء الشعبى.
  9. إذا خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) واضحة في بيليه الخلية على أساس اللون أو ليز مع 1 مل من تحلل ACK العازلة لمدة 1 دقيقة تليها إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X لوقف رد فعل تحلل وتمييع العازلة. التعامل مع جميع العينات مماثل، إما للعلاج أو لا مع العازلة تحلل ACK.
  10. خلايا تدور في 1200 x ج لمدة 5 دقائق، صب وطاف، وجلب الخلايا يصل في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
  11. دوامة وعدد الخلايا على عدادة الكريات لتعداد مجموع الخلايا المجال الجوي.
  12. وبناء على كثافة خلايا إضافة حوالي 80-150 ميكرولتر (~ 80 ميكرولتر للفأر مصاب و~ 150 فأر ساذج) إلى غرفة الشريحة على جهاز للطرد المركزي cytospin. خلية تدورالصورة على المجهر الشرائح لتلطيخ لاحقة لتحديد السكان الخلية التفاضلية.
  13. تسمح للخلايا لتجف على الشرائح بين عشية وضحاها. خلايا وصمة عار مع ثلاثي وصمة عار (على سبيل المثال، هيما (3) [انظر الجدول]) عن طريق غمس الشرائح 7 مرات في تثبيتي، 9 مرات في صمة عار 1، و 7 مرات في صمة عار 2 (لا يشطف بين البقع)، والسماح ليجف. بعد قد جفت وصمة عار، والشرائح ساترة ويدويا عد فروق بواسطة المجهر. عموما، والعدلات والوحيدات / الضامة تفريقها بسهولة حجمها والتشكل النووي.

4. تحديد الحمولة البكتيرية في الرئة والأنسجة الطرفية

  1. قبل البداية: إعداد أنابيب التخفيف مع 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X لالرئة والطحال و90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للدم. لوحات التسمية لزراعة البكتيريا وضعت في درجة حرارة الغرفة. وبالتالي، سيكون اقل وقت مرة واحدة وقد تم جمع الأنسجة بين التجانس والطلاء لنمو البكتيريا.
    ملاحظة: نظرا لdeposi غير متجانسة، فمن المستحسن نشوئها من البكتيريا في الرئتين التي يمكن أن تحدث مع طموح أن يتم استخدام الفئران الفردية لتحليل إما مجموع الخلوية الهوائية أو الكلي عبء البكتيري (الثنائية) الرئة.
  2. الموت ببطء الماوس كما في الخطوة 3.1 وبعد ذلك جمع الدم من البطين الأيسر، ووضع في أنبوب heparinized لتجنب تجلط. إزالة جميع فصوص الرئة ومكان في أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X، تليها إزالة الطحال والتنسيب إلى 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X. وضع أنابيب على الجليد. احرص على تنظيف الأدوات مع الإيثانول بين كل الأنسجة / الماوس.
  3. تجانس الأنسجة على الجليد، ويفضل أن يكون مع المجانسة القابل للتصرف التي يمكن تغييرها بين كل عينة. نصائح الخالط يمكن التخلص منها يمكن تعقيمها لإعادة استخدامها بين التجارب.
  4. مرة واحدة وقد تم المتجانس الأنسجة، نفذ التخفيفات المتسلسلة ولوحة. عينات لوحة من معين الأنسجة / التخفيف من نسختين على لوحة TSA واحدة عن طريق رسم خط فاصل على البلاستيك. الطلاء وديوعرض الاقتراحات lution أدناه (في جميع الحالات، ينتشر 10 ميكرولتر من العينة على لوحة)، وتستند على مدار 24 ساعة بعد العدوى التشريح. إذا تحليل عينات 48-72 ساعة، قد تحتاج إلى مطلي بسبب زيادة عبء البكتيريا في نقاط زمنية لاحقة لعدد أكبر من التخفيفات.
    1. للالدم - تمييع 01:10 بإضافة 10 ميكرولتر من الدم إلى 90 ميكرولتر من العقيمة برنامج تلفزيوني 1X. لوحة أنيق و01:10 عينات مخففة في مكررة. مرة واحدة وقد تم مطلي الدم، وتدور في الدم المتبقي في 9300 x ج لمدة 10 دقيقة لاستخراج البلازما لقياس السيتوكينات و chemokines.
    2. لالرئة - تمييع 01:10 - 1: 100 بإضافة 100 ميكرولتر من الرئة المتجانس في 900 ميكرولتر من العقيمة برنامج تلفزيوني 1X متسلسل. لوحة جناسة أنيق وجميع التخفيفات في نسختين.
    3. لالطحال - تمييع 1: 10-1: 100 بإضافة 100 ميكرولتر من الطحال المتجانس في 900 ميكرولتر من العقيمة برنامج تلفزيوني 1X متسلسل. لوحة جناسة أنيق وكل من التخفيفات في نسختين.
  5. السماح للعينات منتشرة لتجف لفترة وجيزة.
  6. عكس لوحات TSA ومكان في ثابتة 37 درجة مئوية الحاضنة بين عشية وضحاها.
  7. تحديد عدد من البكتيريا استعمار عن طريق حساب متوسط ​​المستعمرات البكتيرية من جانبي لوحة ومن كل تخفيف. عامل في التخفيفات الأولية من 5 مل الرئة و 2 مل الطحال لتحديد إجمالي CFUs الأنسجة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصيب C57BL / 6 الفئران مع 2000 كفو من ك. الرئوية 43816 (النمط المصلي 2) عن طريق الفم والبلعوم التطلع إلى الرئتين. عند هذه الجرعة، والفئران عادة ما تبدأ في إظهار أعراض سريرية 12-24 ساعة بعد العدوى بما في ذلك الخمول، والفراء تكدرت، وفقدان الوزن من 5-10٪ (الشكل 2A). في غضون 48-72 ساعة بعد الإصابة، وكثير من الفئران تظهر أعراض المرض والاعتلال التي عادة ما تسبق بمعدل فقدان الوزن 20٪ والنتائج في المواقف منحنية مع انخفاض النشاط وا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نماذج الفئران من الالتهاب الرئوي الجرثومي، في شراكة مع استهداف الجينات وفي التدخلات البيولوجية والدوائية الجسم الحي، وقدمت أفكارا هامة في الاستجابة دفاع المضيف الرئوية. وقد تقدما كبيرا ولا سيما في فهمنا للكيموكينات وجزيئات الالتصاق التي تحكم توظيف العدلات إلى المجال الجوي المصاب 10،11. وفي النماذج الحية من الالتهاب الرئوي، على عكس النهج القائم على خلية أو بديلة، وقد وفرت أيضا أفكارا رئيسية في الغدد الصماء الاتصالات التي تحدث بين الرئة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل برنامج البحوث الداخلية للمعاهد الوطنية للصحة ، المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية (Z01 ES102005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Klebsiella pneumoniae ، النمط المصلي 2ATCC43816
مرق الصويا الترابطيBecton Dickenson211825
Excel Safelet IV القسطرة ، 18 جم × 1 1/4 "كلافلين للمعدات الطبيةMEDC-031122
Hema 3 Solution 1Fisher23-122-937
Hema 3 Solution 2Fisher23-122-952
Hema 3 FixativeFisher23-122-929
27 & frac12; محاقن قياس السلفيشر14-826-87
جامعي بلازما الهيبارين الليثيومفيشر2675187
موزعات يمكن التخلص منها على شكل حرف Lمختبر ScientificDSC
1x PBS ، درجة الحموضة 7.4محضرة داخلياغيرمتوفرةالماء المقطر (5 لتر) ، كلوريد الصوديوم (40 غرام) ، كلوريد الصوديوم (1 غ) ، Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)     
مخزن تحلل ACKمعد داخلياn / aNH4< / sub>Cl (4.145 جم) ، KHCO3< / sub> (0.5 جم) ، EDTA (18.6 مجم) ، يصل إلى 500 مل بالماء المقطر ودرجة الحموضة إلى 7.4

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mizgerd, J. P. Acute lower respiratory tract infection. N Engl J Med. 358 (7), 716-727 (2008).
  2. Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. Management of community-acquired pneumonia in adults. Am J Respir Crit Care Med. 183 (2), 157-164 (2011).
  3. Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
  4. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164(2012).
  5. Morales-Nebreda, L., et al. Intratracheal administration of influenza virus is superior to intranasal administration as a model of acute lung injury. J Virol Methods. 209, 116-120 (2014).
  6. Aujla, S. J., et al. IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia. Nat Med. 14 (3), 275-281 (2008).
  7. Chen, K., et al. Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity. Immunity. 35 (6), 997-1009 (2011).
  8. Draper, D. W., et al. ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung. Am J Respir Crit Care Med. 182 (3), 404-412 (2010).
  9. Robinson, K. M., et al. Influenza A exacerbates Staphylococcus aureus pneumonia by attenuating IL-1beta production in mice. J Immunol. 191 (10), 5153-5159 (2013).
  10. Mizgerd, J. P. Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs. Semin Immunol. 14 (2), 123-132 (2002).
  11. Balamayooran, G., Batra, S., Fessler, M. B., Happel, K. I., Jeyaseelan, S. Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs against bacteria. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (1), 5-16 (2010).
  12. Quinton, L. J., et al. Hepatocyte-specific mutation of both NF-kappaB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice. J Clin Invest. 122 (5), 1758-1763 (2012).
  13. Gowdy, K. M., et al. Key role for scavenger receptor B-I in the integrative physiology of host defense during bacterial pneumonia. Mucosal Immunol. 8 (3), 559-571 (2015).
  14. Madenspacher, J. H., et al. p53 Integrates host defense and cell fate during bacterial pneumonia. J Exp Med. 210 (5), 891-904 (2013).
  15. Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
  16. Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. J Immunol. 177 (1), 621-630 (2006).
  17. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  18. Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacterial PneumoniaMouse ModelOropharyngeal AspirationPulmonary Innate ImmunityBacterial ClearanceLung InfectionHost Defense ResponseBronchoalveolar LavageTissue HomogenizationCFU Quantification

Related Articles