مقالة منهجية

إنتاجية عالية، تعدد والمستهدفة [بروتيوميك CSF الفحص لقياس المؤشرات الحيوية الاعصاب وئي E الإسوية الحالة

DOI:

10.3791/54541

⸱

أكتوبر 20, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Translational Omics, Genetics and Genomic Medicine Deptartment, Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 2Dementia Research Centre, Institute of Neurology, University College London, 3Clinical Neurochemistry Laboratory, Institute of Neuroscience and Physiology, Department of Psychiatry and Neurochemistry, The Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, 4Neurology Unit, Department of Pathophysiology and Transplantation, University of Milan, 5Great Ormond Street Hospital for Children, University College London

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف الإنتاجية العالية، متعدد، واستهدفت السائل النخاعي البروتين (CSF) فحص وضعت مع إمكانية الترجمة السريرية. اختبار يمكن quantitate علامات محتملة وعوامل الخطر لالتنكس العصبي، مثل المتغيرات ئي E (E2، E3 وE4)، وقياس التعبير عنها أليلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العديد من الأمراض العصبية لا تزال تفتقر إلى علاجات فعالة. والمؤشرات الحيوية يمكن الاعتماد عليها لتحديد وتصنيف هذه الأمراض تكون مهمة في تطوير علاجات جديدة في المستقبل. في كثير من الأحيان المؤشرات الحيوية الجديدة المحتملة لا تجعل في العيادة بسبب القيود في تنميتها وارتفاع التكاليف. ومع ذلك، البروتينات المستهدفة باستخدام رد فعل متعددة مراقبة اللوني السائل، جنبا إلى جنب / قياس الطيف الكتلي (MRM LC-MS / MS)، وتحديدا باستخدام ثلاثية الطيف كتلة رباعي، هو أسلوب واحد التي يمكن استخدامها لتقييم بسرعة والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية للترجمة السريرية في مختبرات التشخيص . تقليديا، وقد استخدم هذا النظام الأساسي على نطاق واسع لقياس الجزيئات الصغيرة في المختبرات السريرية، ولكن هذا هو القدرة على تحليل البروتينات، التي تجعلها بديلا جذابا لELISA (انزيم مرتبط-Immunosorعازمة الفحص) المستندة إلى الأساليب. نحن هنا وصف كيف البروتينات استهدافا يمكن استخدامها لقياس علامات المضاعفة من الخرف، بما في ذلك كشف وتحديد الكميات من عوامل الخطر المعروفة ئي E الإسوي 4 (ApoE4).

من أجل جعل الفحص مناسبة للترجمة، تم تصميمه ليكون سريعا وبسيطة ومحددة للغاية وفعالة من حيث التكلفة. ولتحقيق ذلك، يجب أن يكون الأمثل في كل خطوة في تطوير فحص للبروتينات والأنسجة الفردية يتم تحليلها في ويصف هذا الأسلوب سير العمل العادي بما في ذلك مختلف النصائح والحيل لتطوير المستهدفة البروتينات MRM LC-MS / MS للترجمة .

هو الأمثل لتطوير طريقة استخدام الإصدارات تصنيعه حسب الطلب من الببتيدات quantotypic زيتية، الذي معايرة MS للكشف وثم ارتفعت إلى CSF لتحديد التحديد الصحيح للالببتيد الذاتية في الفصل الكروماتوغرافي قبل التحليل في مرض التصلب العصبي المتعدد. لتحقيق ابسولوالشركة المصرية للاتصالات الكميات ومستقرة الإصدارات القياسية الداخلي المسمى النظير من الببتيدات مع قصيرة الأمينية علامات الحمض تسلسل ويحتوي موقع انشقاق التربسين، تدرج في مقايسة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التأثير المتنامي من الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر، ليوي الجسم الخرف ومرض باركنسون، وأصبحت قضية اجتماعية واقتصادية في كثير من البلدان (1). وهناك حاجة في المؤشرات الحيوية الإضافية التي يمكن استخدامها لتحديد وتصنيف المرضى في المراحل المبكرة من المرض، ورصد أي علاجات جديدة محتملة. ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو إنشاء خط أنابيب عام عن وسيلة مبسطة والاقتصادية وأسرع من التحقق من علامات CSF المحتملة من التنكس العصبي. الأساس المنطقي لاستخدام البروتينات المستهدفة أو الببتيد MRM LC-MS / MS كطريقة سهولة تعديل لتقييم متعددة المؤشرات الحيوية البروتين المحتملة من التجارب الاكتشاف. هذه يمكن زيادة المضاعفة على الانفصال السريع الكروماتوغرافي (<10 دقيقة) وتقييمها. ضمن هذه الشاشة متعددة لالمؤشرات الحيوية العصبية، أدرجنا المعروفة الخرف عامل خطر ئي الإسوي E4 (ApoE4) لذلك نحن كاليفورنيان تحديد وقت واحد وضعه ومستوى التعبير، من قبل أن يلغي الحاجة لاجراء اختبارات التنميط الجيني منفصلة 2. يستخدم LC MS / MS بشكل روتيني كأسلوب من خيار لquantitating بدقة جزيئات صغيرة على وسائل أخرى مثل ELISA أو المقايسة المناعية الشعاعية (RIA). هذا التحول في استخدام التكنولوجيا MS للبروتينات تحليل، وقد تحركها القضايا مع التكنولوجيات القائمة على المناعة. وتشمل هذه عبر خصوصية، دفعة لاختلاف دفعة، ومحدودية مدة الصلاحية، والتكلفة العالية. لذلك، البروتينات المستهدفة سرعان ما أصبحت بديلا المتزايد على وسائل الأجسام المضادة تستند مثل غرب النشاف، ريا وإليسا. ومع ذلك، فإن القدرة على تعدد العديد من علامات إلى فحص واحدة هي الميزة الرئيسية لهذه التقنية خلال أساليب تعتمد على مناعة 3. هذه التقنية هي التي تنطبق على العديد من الأنسجة، واستخدمت بوصفها استراتيجية تحقق للدراسات العديد من البروتينات بما في ذلك البلازما (4) والبول 5،6.

الشركة المصرية للاتصالاتchnique يمكن تطبيقها على أي مختبر لديه وصول والخبرة في استخدام ثلاثية الطيف الشامل رباعي. تصميم الببتيد هو بسيط نسبيا مع تزايد استخدام قواعد البيانات المفتوحة المصدر. سوق تنافسية من التوليف الببتيدات مخصص يجعلهم أكثر بكثير بأسعار معقولة. الببتيدات الثقيلة، ومع ذلك، غالية الثمن، وبالتالي ينبغي تقييم علامات على المجموعة الصغيرة قبل أن ينتقل إلى نطاق أوسع. هناك احتمال متزايد لهذه التقنية لاستخدامها في إعدادات التشخيص السريري، مع معظم المستشفيات الكبيرة ذات ثلاثية المنصات القائمة رباعية والتي يمكن بسهولة أن تتكيف لتشغيل المقايسات البروتين المستهدفة. واحد من هذا القبيل تطبيق طريقة، مما يجعلها في وضع التشخيص الروتيني، هو تطبيقه مؤخرا لحديثي الولادة فحص بقعة الدم لفقر الدم المنجلي فقر الدم 7.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يتم إعطاء التخطيطي من البروتوكول العام هو موضح هنا في اللوحة 1 جميع العينات المستخدمة في تطوير هذه الطريقة هي فائض عينات التشخيص السريري وأن تحصل على موافقة أخلاقية من لجنة لندن بلومزبري الأخلاق.

figure-protocol-1
ويتم اختيار الشكل 1. تخطيطي يوضح العملية الشاملة لإنشاء المستهدفة CSF MRM LC-MS / MS الفحص. الببتيدات المرشح علامة للحصول على تقييم من أهداف البروتين. من خلال استخدام الببتيدات تصنيعه حسب الطلب، يتم إنشاء LC-MS / MS أسلوب متعدد المستهدفة. بعد التقييم، والفحص يمكن استخدامها لتقييم فعالية من علامات محتملة من التنكس العصبي.

1. الببتيد اختيار وتصميم

ملاحظة: معايير الببتيد علامة هو أنه يجب أن تكون فريدة من نوعها (proteotypic قوية>) وتمثل وفرة كمية من البروتين (quantotypic). لتحديد ما إذا كان الببتيد هي فريدة من نوعها أو لا، فإن "الانفجار" أداة البحث في الموقع يونيبروت (http://www.uniprot.org/blast/) يمكن استخدامها.

  1. تحديد قائمة من البروتينات الهدف (علامات)، أي APOE (انظر الجدول 2).
    ملاحظة: إذا تم تحديد علامة من السابقة التجارب التنميط البروتين 8، ثم حدد الببتيد الذي يعطي أفضل استجابة من أن مجموعة البيانات.
  2. إذا كانت هذه المعلومات غير متاحة، استخدام المواقع مفتوحة المصدر، كما هو الحال في سيليكون التربسين هضم البروتينات المستهدفة، وذلك باستخدام أداة برمجية مثل MS-دايجست.
  3. اختيار الببتيد الذي هو تريبسيني وليس عرضة للنشر التعديلات متعدية.
    ملاحظة: يمكن التحقق من هذه المعلومات على موقع يونيبروت www.uniprot.org. تجنب الببتيدات عرضة للتعديل الكيميائية أثناء إعداد نموذج LC-MS.
    4. <لى> ترتيب العرف التوليف من الببتيد الذي تم اختياره.
    ملاحظة: الببتيدات ماركر يمكن توليفها مخصصة من قبل مختلف الشركات التجارية. لAPOE الببتيد quantotypic تستخدم لقياس المستويات الإجمالية APOE عازمة على أن تكون AATVGSLAGQPLQER. تسلسل الببتيد proteotypic المستخدمة لتحديد المتغيرات E2 وE4 هي الببتيدات زيتية لموقف 158 (RLAVYQAGAR وCLAVYQAGAR) وموقف 112 (LGADMEDVCGR وLGADMEDVR)، على التوالي.

2. إعداد الببتيدات قياسي

ملاحظة: من أجل اختيار أفضل التحولات الكمية، والكشف عن مصفوفة (CSF) يحتاج إلى أن يكون الأمثل. الطريقة الأكثر فعالية لتحسين الببتيدات المضاعفة هي لإنشاء برك من الببتيدات بتركيزات معروفة. ويمكن بعد هذه المجموعات أن تستخدم لتطوير أسلوب والمنحنيات القياسية.

  1. و resuspend الببتيدات الاصطناعية (ترد تفاصيل الببتيد في الجدول 2) إلى 1 ملغ / مل الأسهمتركيز وفقا لتعليمات بتصنيع. افتراضيا، إذا تعليمات ليست متاحة، الببتيدات resuspend في 50:50 (ت / ت) الأسيتونتريل (ACN) / H 2 O.
  2. إعداد 1:10 التخفيفات من الببتيد من تركيز الأسهم وتجمع 1000 بمول كل الببتيد في أنبوب microcentrifuge ملزمة منخفضة. تجف عليها في مكثف السرعة بطالة التجمع النهائي ومخزن في -20 درجة مئوية. إعداد عدة برك لاستخدامها في المستقبل.
  3. قسامة 100 ميكرولتر من السائل النخاعي في أنابيب ملزمة منخفضة. تجميد تجفيف السائل النخاعي.
  4. و resuspend قسامة من المجمعة 1000 بمول الببتيدات في المخزن الهضم (100 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.8، 6 M اليوريا و 2 M ثيوريا، 2٪ ASB14) للحصول على تركيزات من 10 و 1 بمول / ميكرولتر.
  5. ارتفاع الببتيدات مجمعة في 100 مكل تجميد المجفف من السائل النخاعي في 0، 1، 2، 5، 10 و 15 تركيزات PM. إضافة 20 نانوغرام من البروتين لا علاقة سليمة مثل الخميرة إينولاز لتكون بمثابة معيار الداخلية والرقابة على كفاءة الهضم من طن تبريدypsin.
  6. أعلى حتى من قسامات السائل النخاعي مع هضم المخزن المؤقت إلى المبلغ النهائي من 20 ميكرولتر. دوامة.
  7. إضافة 1.5 ميكرولتر من dithiothreitol (30 ملغ في 1 مل من 100 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.8) ويهز في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  8. إضافة 3 ميكرولتر من iodoacetamide (35 ملغ في 1 مل من 100 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.8) ويهز في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة في الظلام.
  9. إضافة 165 ميكرولتر من ده 2 O.
  10. إضافة 10 ميكرولتر من 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر تسلسل درجة المعدل حل التربسين معلق في 50 ملي العازلة بيكربونات الأمونيوم، ودرجة الحموضة 7.8. احتضان في حمام مائي عند 37 درجة CO / N ووقف عملية الهضم من خلال تجميد العينات. متجر هضم عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى على استعداد لتحليل.

3. الأمثل للكشف الببتيد MS

  1. نسخ ولصق تسلسل الببتيد على الوجه الأمثل، إلى البرمجيات المناسبة، على سبيل المثال، أفق 9. انقر على تسلسل الببتيد للحصول على المعلوماتمن المتوقع كتلة السلائف أيون والمنتجات الأيونات.
  2. تمييع الببتيد من تركيز الأسهم (انظر القسم 2.1) أبعد إلى 1 نانوغرام / مل تركيز على تطوير طريقة MS.
  3. مباشرة لبث الببتيدات في مطياف الكتلة في معدل التدفق الأمثل (عادة 0،1-0،8 مل / دقيقة) ومع 0-5٪ من الطاقة الاصطدام.
  4. الحصول على MS الطيف من أجل التعرف على التجارب أيونات السلائف اتهم تتضاعف 8. اختيار أيون السلائف (م / ض) أن يعطي أكثر كثافة (doubly- أو ينصح أيونات السلائف اتهم ثلاثة أسباب).
  5. Reinfuse الببتيد وتطبيق الطاقة الاصطدام إلى تفتيت الببتيد التي يسببها الاصطدام التفكك (CID). تحسين مخروط والتصادم الطاقات للحصول على أفضل نمط تجزئة (الأيونات شظية اتهم منفردة أو مزدوجة، وكتلة جزء أيون يفضل أكبر من أيون الأم، وينصح).
  6. تحقق من أن التحولات التي تم الحصول عليها تجريبيا تطابق التحولات ولدت في سيليكون </ م> (كما هو موضح في الخطوة 3.1). حفظ قائمة الانتقال في ملف طريقة MRM باستخدام 2 على الأقل التحولات على أشده في أيون السلائف. وتشمل 2 التحولات: 1 لتحديد الكميات و1 للتأكيد في الفحص النهائي.
    ملاحظة: بعض الشركات المصنعة MS لها وظيفة (أي المياه Intellistart) لMRM الآلي أو تحسين تحليل SRM. إذا كان ذلك ممكنا لبث الببتيدات مع مراحل النقالة جنبا إلى جنب في 50-70٪ إيه سي بنسبة 0.1٪ الاتحاد الانجليزي.

تطوير أسلوب 4. LC-MRM

ملاحظة: تحليل خليط من الببتيدات الاصطناعية من قبل اللوني السائل (UPLC) إلى جانب نظام لالثلاثي رباعية مطياف الكتلة والأداء الفائق. ضمان مصدر نظيف. المذيبات (أ) هو ده 2 0 مع 0.1٪ الاتحاد الانجليزي. وإيه سي المذيبات B بنسبة 0.1٪ الاتحاد الانجليزي.

  1. استخدام نظام LC-MS مجهزة عمود UPLC محملة C-18 مرحلة (1.6 ميكرون قطر، 90 المسام Å، 2،1 مم × 50 مم طول) وتعلق على عمود ما قبل المرحلة نفسها.
  2. تذويب هضم CSF على الجليد، الطرد المركزي في 16000 ز لمدة 10 دقيقة ونقل 60 ميكرولتر إلى 300 ميكرولتر قوارير الزجاج إدراج وتخزين بقية الظهر عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  3. حقن أعلى تركيز من نقطة منحنى القياسية باستخدام 10 دقيقة 1-40٪ ACN الخطي التدرج (انظر الجدول رقم 1 لضبط التدرج)
  4. فتح مما أدى اللوني والاحتفاظ مذكرة الوقت واثنين من كبار أشد التحولات (الكمية) في الببتيد مع كل التحولات بإنشائه في الخطوة 3.
  5. وبناء على هذه المعلومات، وتحديث أسلوب MRM 10 دقيقة (تم إنشاؤه في الخطوة 3.6) مع قنوات توقيت لقياس الببتيدات (انظر الشكل 2 للحصول على مثال). للحفاظ على حساسية، والحفاظ على كل قناة مع نقاط في ذروة أكبر من 8 ومدة بقاء أكبر من 0.01 ثانية للانتقال واحد على الأقل لكل الببتيد.
  6. تشمل "التأخير المذيبات" في طريقة MRM: واحدة في بداية حتى 10 ثانية قبل الذروة شطف الأول وآخر في نهاية الأسلوب، 20 ثانية بعد آخر الذروة شطف. القيام بذلك عن طريق اختيار "التأخير المذيبات" في أحداث الأسلوب في ملف طريقة MS.
  7. تشغيل منحنى القياسية من خلال أسلوب MRM توقيتها وضمان عدم وجود التدخل قمم غير محددة مع التحولات (ولدت في الخطوة 3.6) عن طريق التحقق من الخطي.
  8. تحديد ما إذا كان الببتيد يمكن اكتشافها عن طريق تشغيل التحكم المجمعة غير ارتفعت وCSF المرض من خلال هذه الطريقة.
  9. إزالة الببتيدات التي هي دون الحد من الكشف عن الفحص.

figure-protocol-2
الشكل 2. مثال على دينامية MRM MS الطريقة. موقوتة قنوات التحولات الببتيد ويمكن تصنيف وفقا لمرات الاحتفاظ المعمول بها. تمكين MRMs لإدراجها في الأزياء توقيت كما أزل الببتيدات علامة مختارة من العمود اللوني، ويقلل من عدد من هيئة تنظيم الاتصالاتnsitions على مدى فترة زمنية ويزيد من حساسية مقايسة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. إضافة معايير الداخلية

ملاحظة: كما هو موضح سابقا 10، يمكن إدراج المعايير الداخلية مستقرة المسمى النظير في الفحص. ويرجع ذلك إلى حساب هذه المعايير، وينصح لتقييم أولا الببتيدات في المصفوفة.

  1. تحديد الببتيدات مثالية الأمثل للكشف في السائل الدماغي الشوكي: اختيار الببتيدات التي هي الأكثر المتكررة، وفقا لأعلى كثافة وبدون قمم التدخل.
  2. تصميم الببتيدات المقابلة لتشمل الثقيلة العلامات الأحماض الأمينية 13 C 15 N التي تزيد من كتلة الببتيد لا يقل عن 6 دا بالنسبة لالببتيد الذاتية. أيضا، إضافة علامة من 4-6 الأحماض الأمينية إضافية إما إلى N- أو C-محطة من الحماسي الثقيلةالمد للسيطرة على الهضم زيتية.
  3. تمييع المعايير الداخلية مستقرة المسمى النظير في المخزن الهضم (راجع الخطوة 2.4). تحديد الكمية المثالية من مستقر المعيار الداخلي المسمى النظائر التي سيتم ارتفعت في السائل النخاعي من خلال ارتفاعه في مختلف المستويات اعتمادا على abundancies لوحظ سابقا خلال التنمية. تهدف إلى تحقيق ما يقرب من 1: 1 نسبة مستقرة مستوى المسمى النظير لالببتيد الذاتية.
    ملاحظة: المعايير الداخلية مستقرة المسمى النظير يمكن توليفها من قبل مختلف الشركات التجارية.

6. LC-MRM الفحص من عينات المريض السائل النخاعي

  1. ارتفاع الأمثل كمية من المعايير ذات العلامات النظائر المستقرة في 100 ميكرولتر من السائل النخاعي وتجميد يجف الخليط.
  2. Resuspend وCSF في 20 ميكرولتر من هضم العازلة وتنفيذ عملية الهضم كما هو موضح في نقطة 2،7 حتي 2،10.
  3. تحليل العينات باستخدام أسلوب LC-MRM وضعت في الخطوة 4.
  4. للتحليل الكمي، تشغيل الحماسي القياسيةالمد والجزر في تركيزات 0 -15 بمول في منحنى القياسية. راجع الخطوة 2.5 لإعداد المنحنى القياسي.

تحليل 7. البيانات

ويستند كمية البيانات على نسبة كثافة من المعايير الداخلية الذروة الأساسية (الببتيدات المسمى الثقيلة): ملاحظة. معلومات مفصلة عن تحليل البيانات / MRM SRM وقد وصفت سابقا 10. ويمكن بعد ذلك البيانات نسبة استخدامها في منحنى القياسية لتحديد مستويات مطلقة أو حساب لهم من التركيز وأضاف الببتيد الثقيل المسمى.

  1. تحليل البيانات LC-MRM باستخدام البرمجيات القياسية الشركات المصنعة الطيف كتلة "10. بدلا من ذلك، استخدام البرمجيات الأفق لتحليل البيانات MRM الكمية 10.
  2. تحقق حساسية على المدى عن طريق التحقق من الاستجابة لمعايير داخلية مثل إينولاز الخميرة ارتفعت أو معيار ثابت المسمى النظير في كل شوط. تأكد من أن معامل الاختلاف (CV) ليست أكبر من25٪.
  3. مراجعة يدويا الشرح البيانات للتأكد من دقتها. تحليل كل الببتيد ونسبة إلى مستقر معيار داخلي مناسب المسمى النظير، أي استخدام الإصدار المسمى النظائر المستقرة من الببتيد إذا كانت متوفرة.
  4. للحصول على القيم المطلقة لبمول لكل 100 ميكرولتر من السائل النخاعي، تشغيل البيانات نسبة من خلال منحنيات مستوى المناسبة التي تم تشغيلها في نفس الوقت.
  5. حساب معامل الاختلاف (CV). يجب أن تكون السيرة الذاتية لكل الببتيد أقل من 25٪ وأقل من 15٪ لالببتيدات وفرة عالية.
    ملاحظة: بمول القيمة المطلقة لكل 100 القيم CSF ميكرولتر يمكن استخدامها في التحليل الإحصائي المصب لاحق.

8. ئي E شكل الإسوي الحالة

ملاحظة: لتحديد APOE وضع الإسوي، وجود الببتيدات المقابلة لا يمكن أن يؤديها من خلال تحديد وجود كل الإسوي.

  1. النظر في APOE في 100 ميكرولتر من عتبة CSF من> 1000 إشارة-to الضوضاء بأنها إيجابية لهذا الببتيد. انظر الشكل 5 لالببتيدات المطلوبة / غائبة لتحديد حالة الإسوي المريض. تحديد التعبير أليلية عن طريق حساب٪ من كل الإسوي إلى إجمالي التعبير APOE.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام الطريقة الموصوفة أعلاه، وقد تم تطوير فحص تعدد الإرسال عالية الإنتاجية 10 دقيقة تتألف من 74 الببتيدات من 54 البروتينات، ومقايسة لعلامات من الاضطرابات العصبية مرض الزهايمر ويوي الجسم الخرف (الائتلاف الحزبي) 8 الشكل 3 يظهر اللوني تعدد الإرسال المنشورة قبل 8 من علامات الببتيد كبيرة من الفحص. ونظرا لالببتيدات المدرجة في فحص والتحولات الكمي في الجدول 2. البيانات الناتجة عن هذه الطريقة تعطي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما هو الحال مع جميع المقايسات MS مقرها، والخطوات الحاسمة في الأسلوب هي تحديد الكميات المناسبة والدقيقة من المعايير الداخلية. إذا كان يتم استخدام الكميات المطلقة، ثم المبالغ الصحيحة من الببتيدات ارتفعت في المنحنى القياسي حاسمة أيضا.

لا يتطلب لدينا فحص هطول الأمطار من السائل النخاعي أو استخدام أي نوع من الخطوات لأعلى أو لتحلية نظيفة قبل التحليل MS - هو تماما وعاء واحد طريقة رد فعل. نظرا لصغر حجم السائل النخاعي وتع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل وتسهيله من خلال مبادرة GOSomics البحثية من قبل المعهد الوطني للبحوث الصحية ، ومركز البحوث الطبية الحيوية في مستشفى جريت أورموند ستريت ومركز قياس الطيف الكتلي البيولوجي UCL في معهد UCL لصحة الطفل بتبرعات كريمة من مؤسسة Szeban Peto. مركز أبحاث الخرف هو مركز تنسيق لأبحاث الزهايمر في المملكة المتحدة. يقر المؤلفون بدعم أبحاث الزهايمر في المملكة المتحدة ، ووحدة البحوث الطبية الحيوية للخرف في ساحة الملكة NIHR ، ومركز أبحاث الطب الحيوي UCL / H ، ومركز ليونارد وولفسون التجريبي لطب الأعصاب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأسيتونيتريل (ACN), LC-MS grade فيشرA955-1
حمض الفورميك ، درجة LC-MS ،فيشرA117-50
Dithiothreitol (DTT)Sigma   ؛D5545 - 5 جم
حمض الهيدروكلوريك ، 37٪ وزن / ثVWR   ؛BDH3028 - 2.5 إل جي
يودوأسيتاميد   سيجما I1149 - 5 جم
هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)فيشرS318-500
التربسين ، درجة التسلسل ، حمضPromegaV5113
ثلاثي فلورو أسيتيك المعدل (TFA) ، LC-MS الصففيشرA116-50
اليورياسيجماU0631- 500 جم
ماء ، LC-MS ULTRA ChromasolvFluka14263
الببتيدات المركبة المخصصة المحلية 1-4 مجمGenscriptمخصص
الأحماض الأمينية الثقيلة [13< / sup>C ؛ 15< / sup>N] الببتيدات المخصصةGenscriptمخصص
ASB 14Merck Millipore182750 - 25 جم
ThioureaSigmaT7875 - 500 جم
Tris baseSigmaT6066
VanGuard precolumnWaters186007125
Cortecs UPLC C18 + 1.6 &# 956; m  2.1 × 50 مم عمودالمياه186007114
الخميرة Enolase سيجماE6126
300 &# 956; ل قوارير زجاجية علوية برغي شفافةفيشر العلمية03-FISV
Y أغطية برغي شق   ؛فيشر العلمي9SCK- (B)-ST1X
مجفف التجميدEdwards Mudulyo Mudulyo
المكثف / السرعة فراغEppendof المكثف  بالإضافة إلى 5301
Xevo -TQ-S مطياف الكتلةنظام
Acquity UPLCالمياه
نظام

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , Alzheimers Disease International. Available from: http://www.alz.co.uk/research/G8-policy-brief (2013).
  2. Hirtz, C., et al. Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing. Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).
  3. Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10 (1), 19-22 (2013).
  4. Heywood, W., et al. The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome. J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).
  5. Heywood, W. E., et al. Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI. Anal Chem. , (2015).
  6. Manwaring, V., et al. The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients. J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).
  7. Moat, S. J., et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease. Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).
  8. Heywood, W. E., et al. Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay. Mol Neurodegener. 10, 64(2015).
  9. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  10. Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J Vis Exp. (102), e52959(2015).
  11. Craig-Schapiro, R., et al. YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).
  12. Perrin, R. J., et al. Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (1), e16032(2011).
  13. Liguori, C., et al. Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease. JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Targeted ProteomicsMRM LC MS MSCerebrospinal FluidStable Isotope Labeled StandardsMultiple Reaction MonitoringLiquid ChromatographyTandem Mass SpectrometryHigh Throughput Assay

مقالات ذات صلة