يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54542

⸱

نوفمبر 10, 2016

 ,  ,  , 
1Cardiovascular & Metabolic Disease, MedImmune, 2Lab Automation and Support, MedImmune

في هذه المقالة

ملخص

يمكن أن يؤثر امتصاص الببتيد < p class = 'jove_content '> للأواني البلاستيكية أثناء التخفيفات التسلسلية التقليدية القائمة على الأطراف بشكل كبير على تحديد الفاعلية ويربك فهم علاقات الهيكل والنشاط المستخدمة لتحديد الرصاص ومراحل تحسين الرصاص لاكتشاف الأدوية. هنا يتم وصف طرق التخفيف التسلسلي الصوتي الآلي غير الملامس لعينات الببتيد.

الملخص

كما هو الحال مع اكتشاف المخدرات جزيء صغير، وفحص لمستقبلات الببتيد يتطلب التخفيف المتسلسل من الببتيدات لإنتاج منحنيات التركيز على الاستجابة. فحص الببتيدات يتيح طبقة إضافية من التعقيد وسائل التعامل مع عينة القائم على طرف التقليدية تعرض الببتيدات إلى مساحة كبيرة من بلستيكور، وتوفير فرصة زيادة عن فقدان الببتيد عن طريق الامتصاص. منع التعرض المفرط للبلستيكور يقلل من فقدان الببتيد عبر التمسك البلاستيك وبالتالي يقلل من عدم الدقة في التنبؤ رجولية، والتي وصفناها سابقا فوائد الصوتية عدم الاتصال الاستغناء عنه في المختبر فحص عالية الإنتاجية من مستقبلات الببتيد 1. نحن هنا مناقشة حل أتمتة متكاملة لعدم الاتصال إعداد الصوتية من التخفيفات المسلسل الببتيد في صفيحة معايرة دقيقة باستخدام المثال من فحص مستقبلات الببتيد في الماوس مثل الجلوكاجون الببتيد 1 مستقبلات (GLP-1R). طرقنا تسمح للارتفاعفحوصات للكشف عن منبهات -throughput خلية المستندة وهي قابلة للتطوير لدعم زيادة الإنتاجية عينة، أو السماح لأعداد متزايدة من نسخ لوحة فحص (على سبيل المثال، لوحة من أكثر خطوط الخلايا المستهدفة) بسهولة.

المقدمة

وGLP-1R هو هدف المخدرات التي أنشئت في علاج السكري من النوع 2 2. ناهض الببتيد الأصلي لهذا المستقبل، GLP-1، لديه في الجسم الحي نصف عمر من 2-3 دقيقة 3. الربط من GLP-1 إلى البروتين إلى جانب النتائج مستقبلات هدفه G في إنتاج المصب من الثاني مخيم رسول من خلال الأصلي اقتران بروتين G لتفعيل محلقة أدينيليل. قياس المخيم المتراكمة يوفر فحص قوي لمراقبة تنشيط مستقبلات وللكشف عن النشطة GLP-1 نظائرها مع الخصائص الفيزيائية المفضلة. مثل هذا الفحص يتطلب التخفيف المتسلسل للعينات اختبار لبناء منحنيات التركيز على الاستجابة، وهذا أمر معقد ولا سيما عند تسليم عينات الببتيد. وقد وصفت الأخطاء المحتملة من إعداد التخفيف المتسلسل القائم على طرف سابقا 1،4،5. والببتيدات كثف لبلستيكور، مما أدى إلى تقديرات قوة لا يمكن الاعتماد عليها. فقدان الببتيد يمكن التقليل من خلال رانه إدراج زلال المصل البقري (BSA) في مخازن واستخدام بلستيكور siliconized و، ولكن بروتين ملزمة لا يزال لا يمكن التنبؤ بها. على وجه الخصوص، وقد وصفت الاختلاف في ربط GLP-1 إلى حاويات التجريبية 6. وهناك مضاعفات أخرى في هذا كلاء الاستقرار المستخدمة في بلستيكور المختبر يمكن أن تتسرب من النصائح وصفيحة معايرة دقيقة إلى مخازن فحص المائية وتتدخل في وظيفة البروتين 7 و 8. لذلك، أساليب للحد من التعرض لبلستيكور ضرورية لزيادة دقة القياسات.

الصوتية موزعات السائلة تركز إشارة الصوتية عالية التردد على سطح عينة السائل، مما أدى إلى طرد قطرات نانولتر دقيقة إلى لوحة فحص المجاورة 9. استخدام اللفظ الصوتي القياسي في صناعة الأدوية لإعداد وفحص مكتبات كبيرة مجمع الاصطناعية، ولقد تم التحقق من صحة هذه التكنولوجيا بشكل جيد لmolecul صغيروفاق 10. على حد علمنا، نحن المجموعة الأولى لوصف الاستغناء الصوتية لإعداد الببتيدات المؤتلف والاصطناعية ولقد ذكرت سابقا تحسين دقة بالمقارنة مع الطرق التقليدية القائمة على طرف 1.

توضح هذه المقالة دمج إعداد الببتيد التخفيفات المسلسل ومباشرا من عدم الاتصال نقل الصوتية الصعود إلى التعامل مع لوحة نظام الروبوت الآلي بالكامل. وقد وصف عدد من الأساليب التي تشمل نقل الصوتية عينات سابقا 11. نحن نستخدم طريقة من خطوتين لإعداد تركيزات الأسهم المتوسطة ولتمييع متسلسل نظائرها الببتيد لتوليد منحنى الاستجابة للجرعة كاملة. يتم تحضين الببتيدات مستعدة مع الخلايا معربا عن الماوس الهدف GLP-1R، ونحن نستخدم فحص المتاحة تجاريا متجانسة مضان وقت حل (HTRF) لقياس تراكم مخيم داخل هذه الخلايا كما قراءات من أكتيف ناهض الببتيدإيتي. فحص قوي وقابلة لالإنتاجية العالية شكل 384 بشكل جيد وتطبيقها بشكل روتيني إلى كل من التنمية فحص وفحص المخدرات المشاريع 12.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الببتيد التخفيف المسلسل

  1. إعداد عازلة فحص: هانكس مخزنة محلول ملحي (HBSS) تستكمل مع 25 ملي HEPES، 0.1٪ BSA و 0.5 ملم 3-إيسوبوتيل-1-الميثيل (IBMX)، ودرجة الحموضة 7.4.
  2. استخدام موزع كاشف المجمع لإضافة منهجي 5 ميكرولتر من العازلة الفحص إلى كل بئر من خمس لوحات حجم فحص منخفضة 384 أيضا.
    1. استخدام البرامج الداخلية لإنشاء برنامج الاستغناء عن 5 ميكرولتر حجم بالإضافة إلى كل بئر من لوحة 384 جيدا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. تزج الاستغناء أنابيب الكاسيت في المخزن فحص وسائل الوزراء.
    3. وضع 384 كذلك انخفاض حجم لوحة فحص على الناقل لوحة.
    4. اضغط على زر البداية.
  3. تمييع جميع العينات الببتيد، بغض النظر عن مركبة التخزين، إلى عازلة فحص لإنتاج الأوراق المالية الببتيد 100X.
    ويمكن الحصول على الببتيدات التي تتطلب الفحص في المياه المالحة الفوسفات مخزنة (PBS) أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كما يراه مناسبا (على سبيل المثال، DMSO ث ملاحظة:لديهم سوء تأثير ضار على الببتيدات مع تعديلات ثانوية مثل من مضاد).
  4. الاستغناء عن 25 ميكرولتر الأسهم الببتيد 100X إلى أعمدة 1-5 من صفيحة المؤهلين سمعيا البولي بروبلين 384 بئر. وسميت هذه لوحة "مصدر لوحة A '. تأكد من أن لوحات مصدر، ولكن ليس لوحات جهة، ومسطحة القاع وتتفق على التحمل الصوتية المحددة كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة للأدوات السمعية.
  5. الاستغناء عن 25 ميكرولتر سيطرة إشارة 100X في الآبار A23 و A24 لوحة مصدر A.
  6. الاستغناء عازلة فحص 10 ميكرولتر في أعمدة 11-15 وعازلة فحص 30 ميكرولتر في أعمدة 21-22 لوحة مصدر A.
  7. الاستغناء عازلة فحص 10 ميكرولتر في أعمدة 6-10 والأعمدة 16-20 من الثانية المؤهلين سمعيا 384 جيدا صفيحة البولي بروبلين. وسميت هذه لوحة "لوحة مصدر B '.
  8. أجهزة الطرد المركزي لوحات مصدر A و B في 300 x ج لمدة 1 دقيقة. تتضمن لوحة التوازن المناسب.
  9. استخدام flui الصوتيةد موزعات دمجها في نظام روبوتي الآلي لإعداد ثلاثة متتابعة 1: 100 التخفيفات المتوسطة (العازلة في الفحص) من أسهم الببتيد 100X من العمود 1 في مصدر A.
    ملاحظة: البرمجة يتطلب إعادة صياغة لوحة وبرامج الاستجابة للجرعة (على النحو المنصوص عليه من قبل الشركة المصنعة للموزع السائل الصوتية) للسماح ثلاث تحويلات الصوتية بين مصدر A و B مصدر (انظر الشكل 1 لتخطيطات لوحة). الخطوة 1.9 من التفاصيل على وجه التحديد استخدام موزعات السوائل المستخدمة في هذا المختبر تحت السيطرة الروبوتية الآلي (انظر المواد الجدول):
    1. لوحات مصدر تحميل ولوحات الفحص إلى لوحة الباب فندق الروبوتات.
    2. فتح الآلي البرمجيات الروبوتية وتحميل لوحة إعادة صياغة والاستجابة للجرعة بروتوكولات توسيع البرنامج. انقر على "تشغيل".
      ملاحظة: أتمتة يرشد إلى موزع السائل الصوتية لنقل 250 نيكولا لانغ من أعمدة 1-5 من مصدر لوحة وفي أعمدة 10/6 من لوحة مصدر B، وacousti الثانيج السائل موزع قادر على التعامل مع كميات السوائل أكبر لالردم مع العازلة مقايسة 15 ميكرولتر إلى المزيج. الأتمتة ثم ينقل لوحة مصدر B لأجهزة الطرد المركزي المتكاملة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة (يتم تضمين لوحة التوازن مناسبة لجميع الخطوات الطرد المركزي). يتم إرجاع لوحة مصدر باء لموزع السائل الصوتية لنقل 250 نيكولا لانغ من الأعمدة 6-10 من مصدر لوحة B إلى أعمدة 11-15 من مصدر لوحة (أ) وإعادة ملء مع العازلة مقايسة 15 ميكرولتر إلى المزيج. أتمتة عمليات نقل مصدر لوحة من ألف إلى الطرد المركزي المتكاملة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة. لوحة مصدر وبعد ذلك عاد إلى موزع السائل الصوتية لنقل 250 نيكولا لانغ من الأعمدة 11-15 من مصدر لوحة وفي أعمدة 16-20 من مصدر لوحة باء وإعادة ملء مع العازلة مقايسة 15 ميكرولتر إلى المزيج. الأتمتة ثم ينقل لوحة مصدر B لأجهزة الطرد المركزي المتكاملة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: وأخيرا بروتوكول الاستجابة للجرعة يوجه صرفها الصوتية لنقلحجم المطلوب من كل واحد من 4 آبار لوحة مصدر تخفيفه بشكل متسلسل (في كل لوحة مصدر ألف ولوحة مصدر B) لبناء منحنى 11 نقطة كاملة من نسختين في لوحات الفحص (معبأة سلفا مع العازلة مقايسة 5 ميكرولتر في الخطوة 1.2 أعلاه ). نقل أتمتة لوحة الفحص لأجهزة الطرد المركزي المتكاملة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة.

2. خلية التحضير

  1. cryopreserved الصيني الهامستر المبيض (CHO) خلايا ذوبان التعبير عن مستقبلات الماوس الهدف GLP-1 بسرعة في حمام 37 درجة مئوية المياه و resuspend العازلة في فحص 20 مل.
  2. تعليق خلية أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة (RT). تشمل التوازن المناسب.
  3. تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في المخزن فحص 10 مل.
  4. تمييع الأسهم الخلية 1: 1 في التريبان الأزرق وتحديد كثافة الخلايا قابلة للحياة باستخدام عداد الخلية الآلي. Resuspend الخلايا في المخزن فحص عند 1.6 × 10 6 خلايا لكل مل (أي ما يعادل 8000 خلية لكل أهلا وسهلالتر من وحات الفحص).
  5. استخدام موزع كاشف المجمع لإضافة 5 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل بئر من لوحات الفحص (التي تحتوي على الببتيدات تخفيفه بشكل متسلسل في المخزن فحص 5 ميكرولتر) واحتضان على RT لمدة 30 دقيقة.

3. HTRF كشف مخيم الفحص

  1. جلب HTRF المخيم عدة الاختبار لRT لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
  2. إعداد كل كاشف HTRF (cryptate و D2) بشكل منفصل في 1:20 التخفيف في تحلل العازلة (صياغة الملكية، وتوفرها الشركة المصنعة من مخيم كشف الفحص).
    ملاحظة: تنبيه: تحلل عازلة يحتوي على الفلورايد البوتاسيوم (KF) التي هي سامة ومشوه 13. للتخلص منها، لوحات فحص تحتوي على KF يجب أن تكون مختومة وحرقها، ويجب أن تضعف أي النفايات السائلة إلى <1 مليمول / لتر مع الماء قبل التخلص منها في الحوض.
  3. استخدام موزع كاشف المجمع لإضافة 5 ميكرولتر cryptate كاشف لجميع الآبار لوحات الفحص.
  4. استخدام موزع كاشف المجمع لإضافة 5 ميكرولتر D2 كاشف لكولومNS 1-22 من لوحات الفحص.
  5. على الفور يدويا ماصة العازلة تحلل 5 ميكرولتر في الآبار A23-D24 لوحات الفحص لإعطاء غير محددة ملزمة (جهاز الأمن القومي) آبار المراقبة، و 5 ميكرولتر من كاشف D2 في الآبار E23-P24.
  6. أجهزة الطرد المركزي لوحات فحص لمدة 1 دقيقة في 200 x ج في RT لخلط الآبار.
  7. تغطية لوحات فحص لتقليل التبخر والصور وتبييض واحتضانها في RT لمدة 1 ساعة.
  8. قياس مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) إشارة باستخدام الإثارة في 320 نانومتر، والانبعاثات في 620 نانومتر و 665 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.

تحليل 4. البيانات

  1. استخدام يعني جهاز الأمن القومي لطرح خلفية من جميع الآبار.
  2. احسب٪ دلتا F من 665 نانومتر 620 / نسبة نانومتر على النحو التالي:
    نسبة = (A 665nm / 620nm و) × 10 4
    دلتا F = ((نسبة العينة - نسبة جهاز الأمن القومي) / نسبة جهاز الأمن القومي)) × 100
    حيث نسبة جهاز الأمن القومي = الآبار مع عدم وجود كاشف D2.
  3. احسب٪ activatأيون بين الخلايا unstimulated والخلايا حفز مع الحد الأقصى GLP-1 يجند على النحو التالي:
    ٪ تفعيل = (٪ دلتا Fsample -٪ خلايا DeltaFunstimulated) / (٪ خلايا DeltaFGLP-1 حفز -٪ DeltaF الخلايا unstimulated) × 100
  4. تحليل منحنيات تركيز الاستجابة عن طريق التحليل اللوجستي 4-المعلمة، والرسم البياني كما تفعيل٪ كما هو محدد من قبل السيطرة إشارة 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نحن نستخدم بشكل روتيني طريقة من خطوتين لتخفيف الببتيدات عبر نقل الصوتية. للخطوة الأولى، يتم استخدام موزع الصوتية تتماشى مع أتمتة لإنشاء أربعة التخفيفات وسيطة الأسهم الببتيد عبر اثنين من لوحات المصدر (الشكل 1A، ب). للخطوة الثانية، ونحن نستخدم وموزع الصوتية لزيادة تخفيف التخفيفات المخزون من لوحات مصدر A و B لإنشاء مجموعة تركيز 11 نقطة لكل اختبار الببتيد (الشكل 1C). يتم تشغيل كل مجموعة تركيز الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول التطبيق الناجح لصرف الصوتية المؤتمتة لتمييع متسلسل عينات الببتيد على نطاق تركيز 3 × 10 6 تتطلب أقل من 1 ميكرولتر من العينة. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة لزيادة جودة البيانات من خلال التقليل من الببتيد الامتزاز إلى بلستيكور عبر خفض التعرض للعينات إلى حاويات التجريبية وبلستيكور (مثل نصائح ماصة) التي تكون مطلوبة عادة لنقل كاشف والاختلاط. في حين الاستغناء الصوتية لا يستبعد تماما استخدام بلستيكور، فإنه لا تقلل إلى حد كبير ذلك. وعلاوة على ذلك، وإزالة pipet...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هانكس محلول الملح المتوازنسيجما ألدريتشH8264
هيبسسيجما ألدريتشH3375
مصل الأبقار الألبومينسيجما ألدريتشA9418
3-إيزوبوتيل -1-ميثيل زانثينسيجما ألدريتشI7018محضر كمخزون 0.5 متر في DMSO
GLP-1 (7-36) أميدBachemH-6795محضرة كمخزون 1 مجم / مل في PBS ، يشار إليها باسم "التحكم المرجعي 100x" اختبار
الببتيداتالمنتجة داخليا في MedImmuneيتم توفيرها بتركيزات مختلفة في DMSO أو PBS حسب الاقتضاء
ببتيد 100xيتم إنتاجه داخليا في MedImmuneTest الببتيد المخفف في مخزن مؤقت للفحص إلى التركيز النهائي المطلوب 100x
محلول Trypan Blue ، 0.4٪Thermo Fisher Scientific15250-061
Cedex XS Cell AnalyzerInnovatis
Corning 384 لوحة بئر ، منخفضة الحجمSigma-Aldrich4514
Echo المؤهلة 384 بئر من مادة البولي بروبيلين MicroplateLabcyte Inc.P-05525
شركة Echo المؤهلة لمختبر الخزانER-0055
صدى 550 مناولة السائلLabcyte Inc.أحجام نقل القطرات بزيادات قدرها 2.5 نانومتر
Echo 525 Liquid HandlerLabcyte Inc.أحجام نقل القطرات بزيادات قدرها 25 nl
ACell Benchtop Automation HighRes BiosolutionsMC522
برنامج جدولة أتمتة مختبر سيلاريو لروبوتات علومالحياة HighRes Biosolutions
Multidropموزع كاشفThermFisher Scientific5840300يشار إليه باسم "موزع الكاشف السائب"
HTRF cAMP Dynamic 2مجموعة Cisbio Bioassays62AM4PEJ
قارئ EnVision متعدد التسمياتبيركين إلمر
مخزون

المراجع

  1. Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
  2. Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
  3. Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
  4. Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
  5. Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325(2013).
  6. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
  7. McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917(2008).
  8. Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
  9. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
  10. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
  11. Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
  12. Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
  13. Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
  14. Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
  15. Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
  16. Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
  17. Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

GLP 1 AMP
الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.