Method Article

جيل من اللونين مستضد ميكروأرس للكشف في وقت واحد من مفتش والغلوبولين المناعي الأجسام المضادة الذاتية

DOI:

10.3791/54543

⸱

September 15th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multi-Organ Transplant Program, University Health Network, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Divison of Neurosurgery, University Health Network, 4Division of Cardiac Surgery, University Health Network

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف هنا طريقة لإنشاء مصفوفات مستضد دقيقة قابلة للتخصيص يمكن استخدامها للكشف المتزامن عن الأجسام المضادة الذاتية IgG و IgM في الدم من البشر والفئران. تسمح هذه المصفوفات بالكشف الكمي والإنتاجية العالية للأجسام المضادة ضد أي مستضدات أو حواتم ذات أهمية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأجسام المضادة الذاتية ، وهي أجسام مضادة ضد المستضدات الذاتية ، موجودة في العديد من الحالات المرضية ويمكن أن تكون بمثابة علامات لنشاط المرض. عادة ما يتم الكشف عن مستويات الأجسام المضادة الذاتية لمستضدات معينة باستخدام تقنية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). ومع ذلك ، يمكن أن يستغرق فحص الأجسام المضادة الذاتية المتعددة باستخدام ELISA وقتا طويلا ويتطلب كمية كبيرة من عينة المريض. تقنية المصفوفة الدقيقة للمستضد هي طريقة بديلة يمكن استخدامها للكشف عن الأجسام المضادة الذاتية بطريقة متعددة الإرسال. في هذه التقنية ، يتم ترتيب المستضدات على شرائح مجهر مطلية بشكل خاص باستخدام مصفوفة دقيقة آلية. يتم فحص الشرائح بعينات مصل المريض ، وبالتالي تتم إضافة الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلورسنت للكشف عن ارتباط الأجسام المضادة الذاتية في المصل بالمستضدات. يتم الكشف عن تفاعلات الأجسام المضادة الذاتية وقياسها كميا عن طريق مسح الشرائح باستخدام ماسح ضوئي يمكنه اكتشاف إشارات الفلورسنت. نصف هنا طرق إنشاء مصفوفات مستضد دقيقة مخصصة. تتم طباعة المصفوفات الحالية الخاصة بنا ب 9 دبابيس صلبة ويمكن أن تتضمن ما يصل إلى 162 مستضدا مرقطا في نسختين. يمكن تخصيص المصفوفات بسهولة عن طريق تغيير المستضدات في لوحة المصدر التي يستخدمها المصفوفة الدقيقة. لقد طورنا مخططا للكشف عن الأجسام المضادة الثانوية بلونين يمكنه التمييز بين تفاعلات IgG و IgM على نفس سطح الشريحة. تم تحسين نظام الكشف لدراسة ارتباط الأجسام المضادة الذاتية للإنسان والفئران.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأجسام المضادة الذاتية موجودة في العديد من الحالات المرضية ويمكن أن يكون لها نشاط ممرض مباشر1. يعد تحديد الأجسام المضادة الذاتية أمرا مهما لتشخيص أمراض معينة ، وتشخيص نتائج المرض ، ولتصنيف المرضى الذين قد يستفيدون من علاجات محددة2. عادة ما يتم تحديد الأجسام المضادة الذاتية في مصل المريض باستخدام تقنية ELISA. ومع ذلك ، فإن فحص مستضدات متعددة بهذه التقنية شاق ويستهلك كمية كبيرة من عينة المريض. لذلك هناك حاجة إلى تقنيات جديدة لتحديد الأجسام المضادة الذاتية على نطاق أوسع.

تقنية المصفوفة الدقيقة للمستضد هي تقنية بروتينية تسمح بتحديد الأجسام المضادة الذاتية بطريقة متعددةالإرسال 3. في الخطوة الأولى من هذه ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تمييع المستضدات وتوليد مستضد ميكروأرس

  1. تمييع المستضدات في برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي من 0.2 ملغ / مل. طباعة ما يصل إلى 162 مستضدات فريدة من نوعها في مكررة مع تكوين microarrayer مع 9 دبابيس. تشمل مفتش والغلوبولين المناعي المستضدات في المكتبة مستضد الضوابط الإيجابية. يشمل برنامج تلفزيوني فقط كوسيلة لمراقبة سلبية.
  2. إضافة 20 ميكرولتر من كل مستضد لوحة مصدر جيدا 384. إضافة مستضدات لوحة مصدر في الجماعات التي تعكس الإعداد لرأس الطباعة (على سبيل المثال، وترتيب المستضدات في مجموعات من ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم ترتيب المستضدات في لوحة جيدا 384 وطباعتها على الشرائح من قبل microarrayer الروبوتية كما هو مبين في الشكل رقم 1 يبين الشكل 2 شرائح توضع في الإطار مع غرف حضانة وشريحة فحصها بعد المعالجة. ويبين الشكل 3 الشرائح الموجبة والسالبة السيطرة. وسبرت الشريحة السلبية فقط مع الأجسام المضادة الثانوية، وحققت في الشرائح مراقبة إيجابية مع المصل من المريض مع الذئبة الحمامية الجهازية. باستخدام اثنين من الأجسام الم.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول صفها هنا يسمح لتقدير حجم الأجسام المضادة باستخدام تقنية مستضد ميكروأري. ميكروأرس المستضد توفر العديد من المزايا ELISA التقليدية في الكشف عن الأجسام المضادة. أولا وقبل كل شيء، مجموعة متنوعة من مولدات المضادات بما في ذلك الأحماض النووية والبروتينات والببتيدات، ولست] خلية يمكن المحتشدة على الشرائح المغلفة النيتروسليلوز، وبالتالي السماح للفحص المضاعفة من الأجسام المضادة. وبالإضافة إلى ذلك، ميكروغرام فقط من المستضد ضرورية لتوليد صفائف منذ ورصدت nanoliters المستضد على كل شريحة........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.C. تم دعمه من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من مؤسسة القلب والسكتة الدماغية في كندا وبرنامج التدريب في الطب التجديدي (المعاهد الكندية للبحوث الصحية). تم دعم F.Y.Y.H. من قبل برنامج التدريب في الطب التجديدي. تم تمويل هذا العمل بمنحة من Astellas Pharma Canada. نود أيضا أن نشكر الدكتور مارك مينينغيني (جامعة تورنتو) على استخدام ماسح Axon microarray الخاص به.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ribosomal P0Diarect14100إلى 0.2 مجم / مل في PBS
البشري IgGJackson Immuno009-000-003مخفف إلى 0.2 مجم / مل في PBS
البشري IgMJackson Immune009-000-012مخفف إلى 0.2 مجم / مل في
ماوس PBS IgGSigma-AldrichI5381مخفف إلى 0.2 مجم / مل في ماوس PBS
IgMBiolegend401601يخفف إلى 0.2 مجم / مل في PBS
مزدوج الشريطة DNASigma-AldrichD1626مخفف إلى 0.2 مجم / مل في PBS
أحادي الشريطة DNASigma-AldrichD8899مخفف إلى 0.2 مجم / مل في PBS
microarrayerVirtekVersArray Chipwriter Proالعديد من أنواع المصفوفات مناسبة
دبابيس الطباعة الصلبةArrayit CorporationSSP015
برنامج للمصفوفة الدقيقة الروبوتيةVirtekChipwriter Pro & nbsp ؛
شرائح سريعة (2 وسادة)GVS Northa America10485317
إطار سريعGVS Northa America10486001
غرف حضانة سريعة (2 وسادة)GVS Northa America10486242
384 لوحة بئرWhatman7701-5101
ألواح السدادةVWR60941-062
أغطيةألواح رقائق معدنيةVWR60941-124
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
مصل عجل الجنينInvitrogen12483020
Cy3 الماعز المضاد للإنسان IgGJackson Immune109-165-096استخدام مخزون العمل في 50٪ glyercol
Cy5 الماعز المضاد للإنسان IgMJackson Immuno109-175-129استخدام مخزون العمل في 50٪ glyercol
Cy3 الماعز استخدام مخزون العمل المضاد للفأر IgGJackson Immuno115-165-071في 50٪ glyercol
Cy5 الماعز المضاد للفأر IgMJackson Immune115-175-075استخدام مخزون العمل في 50٪ glyercol
Microarray Scannerالأجهزة الجزيئيةAxon 4200A
Microarray Softwareالأجهزة الجزيئيةGenepix 6.1
التجميعeisenlab.orgCluster 3.0
Heatmapeisenlab.orgTreeview 1.60
Microarray الإحصائيبرنامج جامعة ستانفوردSAM 4.0 (تحليل أهمية المصفوفات الدقيقة)
يخفف برنامج برنامج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Antigen MicroarrayAutoantibody DetectionTwo color DetectionIgG IgM DetectionMicroarray PrintingSerum ProbingFluorescent ScanningPBS BlockingSecondary AntibodySlide Alignment

Related Articles