مقالة منهجية

الأجسام المضادة وصفها مع الأصباغ نيون عن طريق المغناطيسي البروتين والبروتين الخرز G

11.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54545

⸱

سبتمبر 15, 2016

 ,  , 
1Promega Corporation

في هذه المقالة

ملخص

هذه الطريقة على حبة لوصفها الأجسام المضادة مع جزيئات صغيرة يمكن وصفها من كمية صغيرة من الأجسام المضادة مباشرة من وسائل الاعلام الخلية. هذا الأسلوب هو متوافق مع أمين والكيمياء ثيول، ويمكن التعامل مع عينات متعددة في نفس الوقت، يدويا أو باستخدام منصات الآلي.

الملخص

الأجسام المضادة المسمى مع جزيئات صغيرة مثل الأصباغ الفلورية، والأدوية السامة للخلايا، واستشفاف المشعة هي أدوات أساسية في البحوث الطبية الحيوية، المناعي، ومؤخرا كعوامل علاجية. الأساليب التقليدية للأجسام المضادة وسم مع جزيئات صغيرة تتطلب تنقية الأجسام المضادة في تركيز عال نسبيا، تنطوي على خطوات غسيل الكلى متعددة وحدت الإنتاجية. ومع ذلك، العديد من التطبيقات، بما في ذلك مجال الأجسام المضادة المخدرات تقارن (ADCS)، وسوف تستفيد من وسائل جديدة من شأنها أن تسمح بوضع العلامات على أجسام مضادة مباشرة من وسائل الاعلام الخلية. هذه الأساليب قد تسمح الأجسام المضادة إلى أن عرض في فحوصات ذات الصلة من الناحية البيولوجية، على سبيل المثال، بوساطة مستقبلات الأجسام المضادة استيعاب فحص في حالة ADCS. هنا، نحن تصف (الطريقة على حبة) الطريقة التي يمكن وصفها كميات صغيرة من الأجسام المضادة مباشرة من وسائل الاعلام الخلية. هذا النهج يستخدم قدرة عالية المغناطيسي البروتين والبروتين G الخرز تقارب لالتقاط الأجسام المضادةمن وسائل الإعلام خلية يليه وضع العلامات مع جزيئات صغيرة باستخدام إما أمين أو الكيمياء ثيول وشطف لاحق من الأجسام المضادة المسمى. أخذ الأصباغ الفلورية كبديل عن جزيئات صغيرة، ونحن لشرح وضع العلامات على حبة من ثلاثة أجسام مختلفة الماوس مباشرة من وسائل الإعلام خلية باستخدام كل من أمين وثيول وضع العلامات الكيمياء. تقارب ملزم عالية من الأجسام المضادة لبروتين ألف والبروتين G يضمن استرداد عالية، فضلا عن نقاء عالية من الأجسام المضادة المسمى. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام الخرز المغناطيسي يسمح عينات متعددة ليتم التعامل معها يدويا، وبالتالي تحسين كبير وضع العلامات الإنتاجية.

المقدمة

الأجسام المضادة المسمى مع جزيئات صغيرة ربما تكون الكواشف المستخدمة الأكثر شيوعا في 1،2 علم الأحياء. وتستخدم الأجسام المضادة المسمى مع الأصباغ الفلورية والبيوتين على نطاق واسع في مجال التصوير، المناعية، التدفق الخلوي، البقع الغربية، ومناعي بين التطبيقات الأخرى 3-6. الأجسام المضادة رديولبلد 3،7 يجد استخدام واسع النطاق في مجال التصوير والعلاج، والأجسام المضادة المسمى مع الأدوية السامة للخلايا (ADCS) هي التي تقدم خيارات جديدة لعلاج السرطان، وسبق أن وافق اثنان ADCS للاستخدام العلاجي 8. على الرغم من استخدامها واسعة النطاق، ظلت الطرق للأجسام المضادة وصفها دون تغيير مفاجئ وعادة ما تنطوي على تفاعلات متعددة وتحلية الخطوات 9-12. طرق حل تعمل بشكل جيد جدا في الحالات التي تحتاج سوى عدد قليل من الأجسام المضادة ليكون المسمى وتتوفر في شكل منقى للغاية في تركيز عال وبكميات كافية. ومع ذلك، من أجل التطبيقات الجديدة مثل ADCS، هناكتحتاج إلى تسمية الأجسام المضادة في مرحلة هجين في وقت مبكر بحيث يمكن فرزهم عن الخصائص ذات الصلة من الناحية البيولوجية، على سبيل المثال، بوساطة مستقبلات الأجسام المضادة استيعاب 13-16. في مرحلة هجين، وأحجام عينة محدودة، ويتم التعبير عن الأجسام المضادة في تركيزات منخفضة وعدد من العينات كبيرة، وبالتالي طرق وضع العلامات حل يستند ليست مناسبة.

لتبسيط وتحسين الإنتاجية الطرق الأجسام المضادة العلامات التقليدية، وقد تم اقتراح عدد قليل من الطرق البديلة 17،18. نهج واحد هو استخدام البروتين غير المغناطيسية والخرز تقارب معبأة في أعمدة صغيرة لالتقاط الأجسام المضادة يليه وضع العلامات رد فعل وشطف من البروتين المسمى وتنقيته. وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لتسمية الأجسام المضادة مباشرة من وسائل الإعلام خلية، ومع ذلك، فإن استخدام الأعمدة يمكن أن يكون شاقة. وقد تم مؤخرا أفاد طريقة حبة المغناطيسي على أساس 19 التي تلغي استخدام الأعمدة ويحسن الإنتاجية ولكن نظراإلى الضد محدود القدرة من الخرز ملزمة، نانوغرام فقط إلى كميات ميكروجرام انخفاض الأجسام المضادة يمكن أن يكون المسمى.

ونحن مؤخرا طورت واستخدمت قدرة عالية المغناطيسي البروتين والبروتين G الخرز (> 20 ملغ من مفتش الإنسان / مل من الخرز مستقرة) لتسمية الأجسام المضادة الموجودة في وسائل الاعلام الخلايا مع جزيئات صغيرة 20. قدرة عالية من الخرز يسمح عشرات إلى مئات ميكروغرام من الأجسام المضادة ليكون المسمى مريح والاستجابة السريعة المغناطيسي من الخرز يبسط معالجة وتجهيز عدد كبير من العينات في وقت واحد. باستخدام الأصباغ الفلورية كبديل عن جزيئات صغيرة، وتبين لنا أن هذه الطريقة متوافقة مع أمين وثيول وضع العلامات الكيمياء ويوفر المبالغ المستردة عالية من الأجسام المضادة وصفت ونقية جدا.

هذا البروتوكول والفيديو المصاحب وصف على حبة وضع العلامات الأجسام المضادة الماوس الحالية في وسائل الإعلام الخلية باستخدام المغناطيسي البروتين والبروتين G الخرز. البروتوكول هوويصف الجزء 1 القبض على الأجسام المضادة على حبة من العينات البيولوجية: تنقسم إلى أربعة أقسام. وبعد القبض، ووصف وضع العلامات الأجسام المضادة مع صبغة الفلورسنت باستخدام الكيمياء أمين أو باستخدام الكيمياء ثيول في الفقرتين 2 و الباب 3، على التوالي. وأخيرا، يصف القسم (4) وطريقة لحسابات تركيز الأجسام المضادة وصبغ إلى نسبة الأجسام المضادة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الأجسام المضادة القبض على سعة عالية البروتين المغناطيسي (أ) أو البروتين المغناطيسي الخرز G

  1. بشكل موحد إعادة تعليق الخرز المغناطيسية التي تهز لطيف. إبقاء الزي تعليق عندما aliquoting الخرز.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من الطين حبة لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل. ضع في الوقوف المغناطيسي لمدة 10 ثانية. إزالة بعناية المخزن المؤقت التخزين.
  3. إضافة 250 ميكرولتر من العازلة ملزم الأجسام المضادة.
  4. خلط ووضع في موقف المغناطيسي لمدة 10 ثانية. إزالة بعناية العازلة ملزمة.
  5. إضافة 1.0 مل من العينة تحتوي على 50-100 ميكروغرام من الأجسام المضادة لالخرز. عينات يمكن تنقية الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة في وسائل الإعلام الخلية.
  6. خلط العينة لمدة 60 دقيقة في RT باستخدام خلاط دوامة أو نهاية الإفراط في نهاية خلاط.
  7. وضع أنبوب في موقف المغناطيسي لمدة 10 ثانية، وإزالة طاف.
  8. إضافة 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة عازلة ملزم / غسل وتخلط. ضع في الوقوف المغناطيسي لمدة 10 ثانية، وإزالة ملزم عازلة / الغسيل. كرر هذا لياليتيب لمجموعه اثنين من يغسل.
  9. انتقل إلى القسم 2 إلى الأجسام المضادة التسمية باستخدام الكيمياء أمين أو إلى القسم 3 إلى الأجسام المضادة التسمية باستخدام الكيمياء ثيول.

2. الجسم المضاد وصفها عن طريق أمين الكيمياء

  1. المترافقة الجسم المضاد
    1. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة أمين الاقتران إلى الخرز.
    2. حل الأصباغ الفلورية-أمين رد الفعل (AlexaFluor 532-SE) في 10 ملغ / مل بإضافة 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى 1.0 ملغ من الصبغة. مزيج من قبل vortexing. جعل هذا الحل فقط قبل الاستخدام.
    3. إضافة 2.5 ميكرولتر من صبغ رد الفعل للأمين 100 ميكروغرام من الأجسام المضادة.
      ملاحظة: عادة ينصح 5-20 فائض المولي من صبغ رد الفعل. ومع ذلك، وأضاف كمية صبغ رد الفعل إلى رد الفعل يحتاج إلى أن يكون الأمثل تجريبيا اعتمادا على صبغة المطلوب لنسبة الأجسام المضادة وخصائص الأجسام المضادة الذاتية.
    4. خلط العينة لمدة 60 دقيقة في RT باستخدام خلاط دوامة أو نهاية الإفراط في نهاية خلاط. تأكد من أن تبقى حبات في suspensioن.
    5. وضع أنبوب في موقف المغناطيسي لمدة 10 ثانية، وإزالة طاف.
    6. إضافة 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة عازلة ملزم / غسل وتخلط. ضع في الوقوف المغناطيسي لمدة 10 ثانية. إزالة والتخلص ملزم عازلة / الغسيل. كرر هذه الخطوة ما مجموعه اثنين من يغسل.
  2. الأجسام المضادة الانتعاش
    1. إضافة 50 ميكرولتر من شطف العازلة إلى الخرز.
    2. مزيج لمدة 5 دقائق على RT باستخدام خلاط دوامة أو نهاية الإفراط في نهاية خلاط. تأكد من أن تبقى حبات في تعليق.
    3. وضع أنبوب في موقف المغناطيسي لمدة 10 ثانية. إزالة عينة مزال ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة الجديدة تحتوي على 5 ميكرولتر من العازلة التعادل.
    4. كرر العملية أكثر مرة واحدة وتجميع عينات مزال.
    5. Quantitate تركيز الأجسام المضادة وصبغ إلى الضد نسبة كما هو موضح في القسم 4.

3. الجسم المضاد وصفها عن طريق ثيول الكيمياء

  1. الحد من الأجسام المضادة
    1. إضافة 250 ميكرولترمن العازلة اقتران ثيول والمزيج. وضع أنبوب في موقف المغناطيسي لمدة 10 ثانية. إزالة والتخلص من العازلة. كرر هذه الخطوة مرتين.
    2. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة اقتران ثيول.
    3. إضافة Dithiothreitol (DTT) إلى التركيز النهائي من 2.5 ملم.
    4. خلط العينة لمدة 60 دقيقة في RT باستخدام خلاط دوامة أو نهاية الإفراط في نهاية خلاط. تأكد من أن تبقى حبات في تعليق.
    5. وضع أنبوب في موقف المغناطيسي لمدة 10 ثانية وتجاهل العازلة.
    6. إضافة 250 ميكرولتر من العازلة اقتران ثيول وتخلط. وضع أنبوب في موقف المغناطيسي لمدة 10 ثانية. إزالة والتخلص من العازلة. كرر هذه الخطوة ما مجموعه اثنين من يغسل.
    7. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة اقتران ثيول.
  2. المترافقة الجسم المضاد
    1. حل صبغ ثيول رد الفعل في 10 ملغ / مل بإضافة 100 ميكرولتر من DMSO إلى 1.0 ملغ من الصبغة. مزيج من قبل vortexing. جعل هذا الحل فقط قبل الاستخدام.
    2. إضافة 2.5 ميكرولتر من صبغ ثيول رد الفعل ل100 ميكروغرام المضادةالجسم.
      ملاحظة: عادة ينصح 5-20 فائض المولي من صبغ رد الفعل. ومع ذلك، وأضاف كمية صبغ رد الفعل إلى رد الفعل يحتاج إلى أن يكون الأمثل تجريبيا اعتمادا على صبغة المطلوب لنسبة الأجسام المضادة وخصائص الأجسام المضادة الذاتية.
    3. خلط العينة لمدة 60 دقيقة في RT باستخدام خلاط دوامة أو نهاية الإفراط في نهاية خلاط. تأكد من أن تبقى حبات في تعليق.
    4. وضع أنبوب في موقف المغناطيسي لمدة 10 ثانية، وإزالة طاف.
    5. إضافة 250 ميكرولتر من العازلة اقتران ثيول وتخلط. ضع في الوقوف المغناطيسي لمدة 10 ثانية، وإزالة العازلة. كرر هذه الخطوة ما مجموعه اثنين من يغسل.
  3. أزل الجسم المضاد
    1. إضافة 50 ميكرولتر من شطف العازلة إلى الخرز.
    2. مزيج لمدة 5 دقائق على RT باستخدام خلاط دوامة أو نهاية الإفراط في نهاية خلاط. تأكد من أن تبقى حبات في تعليق.
    3. وضع أنبوب في موقف المغناطيسي لمدة 10 ثانية. إزالة عينة مزال ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة الجديدة تحتوي على 5 ميكرولتر من neut غيرعازلة ralization.
    4. كرر العملية أكثر مرة واحدة وتجميع عينات مزال.
    5. Quantitate تركيز الأجسام المضادة وصبغ إلى الضد نسبة كما هو موضح في القسم 4.

نسبة 4. حساب صبغ إلى الضد

  1. قياس الامتصاصية من المكورات الأجسام المضادة صبغ عند 280 نانومتر (A280) وفي λmax لصبغ (AMAX).
  2. حساب تركيز الأجسام المضادة:
    الأجسام المضادة تركيز (ملغ / مل) = A280 - (ألف كحد أقصى × CF) / 1.4
    حيث CF = عامل التصحيح للصباغة (المقدمة من قبل الشركة المصنعة).
  3. حساب نسبة الصبغة إلى الأجسام المضادة:
    صبغ إلى الأجسام المضادة نسبة (DAR) = (ألف كحد أقصى × 150000) / أب تركيز (ملغ / مل) × ε صبغ
    حيث ε صبغ = معامل الانقراض من الصبغة في أقصى الامتصاصية والوزن الجزيئي من الأجسام المضادة = 150000 دا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويرد التخطيطي لوصفها الأجسام المضادة مع جزيئات صغيرة باستخدام قدرة عالية المغناطيسي البروتين والبروتين G حبات في الشكل 1. الأجسام المضادة القبض على البروتين المغناطيسي الخرز G يمكن أن يكون المسمى مع جزيئات صغيرة، على سبيل المثال الأصباغ الفلورية، وذلك باستخدام إما الكيمياء أمين التي تصف الأمينات الأولية من الأحماض الأمينية ليسين أو باستخدام الكيمياء ثيول التي تصف في خفض التجولات في المنطقة المفصلي من الأجسام المضادة. تقارب بين الأج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وكان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير طريقة لتسمية الأضداد، موجودة في وسائل الإعلام خلية في تركيزات منخفضة، مع مجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة. هذه طريقة تسمح لعدد كبير من الأجسام المضادة، خلال المراحل المبكرة من اكتشاف الأجسام المضادة، ليكون المسمى مع جزيئات صغيرة وفحص باستخدام فحص بيولوجيا. واحدة من هذه مقايسة هو بوساطة مستقبلات الأجسام المضادة استيعاب فحص حيث قد تختلف داخليا بين الأجسام المضادة حتى مع الانتماءات الملزمة مماثلة. وبالتالي، فمن المهم لفحص الأجسام المضادة خصيصا لخصا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون هم موظفون في شركة Promega.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Magne Protein A BeadsPromega Corporation  G8781
ماغني بروتين G الخرزشركة Promega Corporation   G7471
AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)Life TechnologiesA20001
AlexaFluor 532-ME (Malemide)Life TechnologiesA10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimide)Life TechnologiesA20347
Fluorescein-ME (Maleimide)Life TechnologiesF-150
حامل مغناطيسيPromegaZ5332

المراجع

  1. Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
  2. Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
  3. Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
  4. Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
  5. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099(2014).
  6. Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
  7. Kraeber-Bodere, F., et al. Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer. Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).
  8. Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
  9. Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
  10. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. 380-382 (1996).
  11. Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
  12. Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
  13. Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
  14. Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708(2015).
  15. Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
  16. Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
  17. Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
  18. Strachan, E., et al. Solid-phase biotinylation of antibodies. J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).
  19. Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
  20. Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
  21. Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
  22. Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7(2004).
  23. Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
  24. Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
  25. Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

A

مقالات ذات صلة