مقالة منهجية

كشف اللونية من البكتيريا عن طريق محك الاختبار

9.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54546

⸱

سبتمبر 17, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

في هذه المقالة

ملخص

نصف بروتوكولا للكشف اللوني عن الإشريكية القولونية باستخدام اختبار عباد الشمس المعدل الذي يستفيد من انقسام الحمض النووي الريبي واليورياز والخرز المغناطيسي.

الملخص

هناك طلبات متزايدة على طرق بسيطة ولكنها لا تزال فعالة يمكن استخدامها للكشف عن مسببات الأمراض المحددة لنقاط الرعاية أو التطبيقات الميدانية. يجب أن تكون هذه الأساليب سهلة الاستخدام وأن تنتج نتائج موثوقة يمكن تفسيرها بسهولة من قبل كل من المتخصصين وغير المحترفين. يعد اختبار عباد الشمس لدرجة الحموضة بسيطا وسريعا وفعالا لأنه يبلغ عن الرقم الهيدروجيني لعينة الاختبار عبر تغيير بسيط في اللون. لقد طورنا نهجا للاستفادة من اختبار عباد الشمس للكشف عن البكتيريا. تستغل الطريقة DNAzyme الخاص بالحمض النووي الريبي الخاص بالبكتيريا لتحقيق وظيفتين: التعرف على البكتيريا ذات الأهمية وتوفير آلية للتحكم في نشاط اليورياز. من خلال استخدام الخرز المغناطيسي الثابت بمقترن DNAzyme-urease ، يتم نقل وجود البكتيريا في عينة الاختبار إلى إطلاق اليورياز من الخرز إلى المحلول. يتم نقل اليورياز المنطلق إلى محلول اختبار لتحلل اليوريا إلى الأمونيا ، مما يؤدي إلى زيادة الأس الهيدروجيني الذي يمكن تصوره باستخدام اختبار عباد الشمس الكلاسيكي.

المقدمة

تعد مسببات الأمراض البكتيرية أحد الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات العالمية. تشكل تفشي العدوى المكتسبة من المستشفيات ومسببات الأمراض المنقولة بالأغذية والملوثات البكتيرية في البيئة تهديدات خطيرة ومستمرة للصحة والسلامة العامة. لمنع هذه الفاشيات ، هناك حاجة إلى أدوات فعالة تسمح بالكشف عن مسببات الأمراض في الوقت المناسب في ظل مجموعة متنوعة من الإعدادات. إن الاختبارات البسيطة ولكنها لا تزال فعالة والتي تكون محمولة وفعالة من حيث التكلفة مرغوبة إلى حد كبير، لا سيما في المناطق المعرضة للفاشيات ولكنها لا تستطيع تحمل تكاليف مرافق الاختبار باهظة الثمن. 1-3 على الرغم من وجود العديد من الطرق للكشف عن البكتيريا ، إلا أن العديد منها غير مناسب كأدوات فحص أو اختبار في الموقع لأنها تتطلب أوقات اختبار طويلة وأدوات باهظة الثمن وإجراءات اختبار معقدة.

تعتبر اختبارات قياس الألوان

جذابة بشكل خاص للتطبيقات الميدانية أو في نقاط الرعاية حيث يمكن اكتشاف تغيرات اللون بسهولة بالعين المجردة. اختبار عباد الشمس لدرجة الحموضة بسيط وسريع وفعال. على الرغم من أنها تقنية قديمة جدا ، إلا أنها لا تزال تستخدم على نطاق واسع حتى اليوم بسبب بساطتها وفعاليتها. والمثير للدهشة أن هذا الاختبار البسيط لم يتم تعديله أبدا لتحقيق الكشف عن التحليلات الأخرى قبل أن نطور مؤخرا نهجا لتعديل هذا الاختبار لاختبار الإشريكية القولونية. 4

اختبار عباد الشمس الموسع للإشريكية القولونية يستخدم ثلاثة مكونات إضافية: بكتريا قولونية تنشيط الحمض النووي الريبي المنشط DNAzyme (EC1) ، و 5 يورياز ، والخرز المغناطيسي. تشير أزمات الحمض النووي إلى جزيئات الحمض النووي الاصطناعية أحادية الشريطة ذات النشاط التحفيزي. 6 يمكن عزلها عن تجمعات الحمض النووي ذات التسلسل العشوائي باستخدام الاختيار في المختبر. 7،8 إنها مستقرة للغاية ويمكن إنتاجها بشكل فعال من حيث التكلفة باستخدام تخليق الحمض النووي الآلي عالي الكفاءة. 9 لهذه الأسباب ، تم فحص إنزيمات DNAzymes ، وخاصة DNAzymes التي تشق الحمض النووي الريبي ، على نطاق واسع لتطبيقات الاستشعار الحيوي. تم تطوير 6،10،11 مستشعرات DNAzyme التي تشق الحمض النووي الريبي للكشف عن أيونات المعادن ، و 12-16 جزيئا صغيرا ، و 17،18 مسببات الأمراض البكتيرية5،19-21 والخلايا السرطانية. 22 نظرا للتوافر الكبير لأزمات الحمض النووي الريبي التي تشق الحمض النووي الريبي المستحثة عن الهدف ، يمكن توسيع أي اختبار يستخدم DNAzyme للكشف عن مجموعة متنوعة من التحليلات.

يتم اختيار

Urease لقدرته على تحلل اليوريا إلى الأمونيا ، 23،24 مما يؤدي إلى زيادة الأس الهيدروجيني. اليورياز أيضا عالي الكفاءة ومستقر وقابل للاقتران مع الجزيئات الحيوية الأخرى. لذلك ، افترضنا أن اقتران DNAzyme لانقسام الحمض النووي الريبي مع اليورياز سيسمح باستخدام اختبار عباد الشمس للكشف عن أهداف أخرى. 5

يتم نقل عمل DNAzyme الذي يشق الحمض النووي الريبي إلى زيادة الأس الهيدروجيني بوساطة اليورياز من خلال استخدام الخرز المغناطيسي الذي يتم تجميده مع DNAzyme-urease المترافق. نظرا لأن نشاط DNAzyme قيد التحقيق يعتمد بشكل صارم على الإشريكية القولونية ، فإن وجود هذه البكتيريا في محلول الاختبار سيؤدي إلى إطلاق اليورياز من الخرز المغناطيسي إلى المحلول ، والذي يتم أخذه بعد ذلك واستخدامه لتحلل اليوريا في محلول مراسل يحتوي على صبغة حساسة للأس الهيدروجيني. النتيجة النهائية لهذا الإجراء هي تغيير اللون الذي يمكن الإبلاغ عنه بسهولة بواسطة الصبغة أو ورق الأس الهيدروجيني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الكواشف والمخازن

  1. 0.5 M ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)
    1. في دورق 2 لتر، إضافة 186.1 ز EDTA إلى 800 مل من الماء منزوع الأيونات المقطر ([ده 2 O). ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 8.0 باستخدام كريات هيدروكسيد الصوديوم. إضافة ده 2 O إلى الحجم النهائي من 1.0 لتر ونقل حل لزجاجة autoclavable عن التعقيم وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. EDTA 10 × تريس، بورات (10X TBE)
    1. في 4 لتر ​​كوب من البلاستيك، إضافة 432 غرام تريس، قاعدة، و 200 غرام حامض البوريك، 80 مل من 0.5 M EDTA (8.0 درجة الحموضة) وده 2 O إلى الحجم النهائي من 4 ل. مزيج باستخدام بقضيب حتى كل المكونات تذاب. نقل حل لقوارير الزجاج 1 لتر من التعقيم وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  3. 10٪ بولي أكريلاميد تغيير طبيعة الأوراق المالية
    1. في 4 لتر ​​كوب من البلاستيك، إضافة 1681.7 ز اليوريا، 400 مل 10X TBE، 1 لتر من 40٪ مادة الأكريلاميد / bisacrylamide (29: 1) حل وده 2 O حتى وحجم إينال هو 4 L. ميكس باستخدام بقضيب حتى يذوب اليوريا. نقل الحل إلى 1 لتر الزجاجات العنبر الزجاج وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  4. 2X جل تحميل العازلة (2X GLB)
    1. في كوب زجاج 200 مل، إضافة 44 ز اليوريا، 8 ز السكروز، 10 ملغ برموفينول الأزرق، و 10 ملغ سيانول زايلين FF، 400 ميكرولتر من 10٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل، و 4 مل من 10 × TBE. إضافة ده 2 O إلى الحجم النهائي من 40 مل وتذوب المكونات مع التدفئة خفيفة عند 50 درجة مئوية في حين خلط مع شريط مغناطيسي. نقل 1 مل قسامة إلى 1.5 مل أنابيب microfuge وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: استخدام المسبقة يتطلب تسخين وجيزة في 90 درجة مئوية إلى تنحل أي مواد صلبة.
  5. 1 M تريس، هيدروكلوريد (تريس، حمض الهيدروكلوريك) (7.5 درجة الحموضة)
    1. في زجاجة، إضافة 12.1 غرام من تريس القاعدة و 70 مل من ده 2 O وتخلط حتى يذوب الصلبة. ضبط درجة الحموضة إلى 7.5 باستخدام 1 M حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك). إضافة ده 2 O إلى الحجم النهائي من 100 مل، الأوتوكلاف وستوإعادة في 4 درجات مئوية
  6. 5 M كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)
    1. في زجاجة، ويحل 58.4 غرام من كلوريد الصوديوم في 150 مل من ده 2 O. ضبط مستوى الصوت إلى 200 مل مع DDH 2 O. تخزينها في 4 درجات مئوية.
  7. الحمض النووي الاحتياطي شطف
    1. في زجاجة، وخلط 2.0 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 8.0 مل من 5 M كلوريد الصوديوم و 0.4 مل من 0.5 M EDTA (8.0 درجة الحموضة). ضبط مستوى الصوت إلى 200 مل مع DDH 2 O، الأوتوكلاف وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  8. 1 M 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (7.4 درجة الحموضة)
    1. في زجاجة، ويحل 2.38 غرام من HEPES في 80 مل من ده 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام 5 N هيدروكسيد الصوديوم وإضافة ده 2 O إلى الحجم النهائي من 100 مل.
  9. 1 M كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2)
    1. في زجاجة، إضافة 2،03 غرام من MgCl 2 -6H 2 O وتبرزي حجم 100 مل مع DDH 2 O.
  10. رد فعل العازلة (RB)
    1. في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، إضافة 50 ميكرولتر من 1 M HEPES (7.4 درجة الحموضة)، و 1.5 مل من 5 M كلوريد الصوديوم، 0.75 مل من 1 M MgCl 2، و 5 ميكرولتر من توين-20. إضافة ده 2 O إلى الحجم النهائي من 50 مل. مزيج من حل وتصفية في أنبوب مخروطي آخر باستخدام فلتر يحركها حقنة (0.22 ميكرون)، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  11. الاحتياطي ملزم (BB)
    1. في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، إضافة 500 ميكرولتر من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 8.8 غرام من كلوريد الصوديوم، و 50 ميكرولتر من 1 M من MgCl 2، و 5 ميكرولتر من توين 20. اضافة ده 2 O إلى الحجم النهائي 50 مل. مزيج من حل وتصفية في أنبوب مخروطي آخر باستخدام فلتر يحركها حقنة (0.22 ميكرون)، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  12. الركيزة الحل (SS)
    1. في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، إضافة 5.8 غرام من كلوريد الصوديوم، 3 مل من 1 M MgCl 2، 1.5 غرام اليوريا، و 40 مل من ده 2 O. ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 5.0 باستخدام 10 ملم حمض الهيدروكلوريك. لأنه لم يتم تخزينها مؤقتا الحل، وضبط درجة الحموضة باستخدام حمض الهيدروكلوريكبعناية من خلال إضافة قسامات حمض الهيدروكلوريك الصغيرة. إضافة ده 2 O إلى الحجم النهائي من 50 مل.
    2. مزيج من حل وتصفية في أنبوب مخروطي آخر باستخدام فلتر يحركها حقنة (0.22 ميكرون)، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  13. لوريا Bertani (LB) مرق
    1. في كوب، ويحل 20.0 غرام من مسحوق LB في 1 لتر من ده 2 O. نقل إلى زجاجة، الأوتوكلاف، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  14. 1.5٪ LB أجار
    1. في قارورة 250 مل، إضافة 1.5 غرام أجار و 100 مل من مرق LB. الأوتوكلاف وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  15. لوحات أجار
    1. تنحل أجار LB في الميكروويف وتبريد حل ل~ 50 درجة مئوية. صب الحل في أطباق بتري، مما يجعل ~ 5 لوحات، والسماح لهم لترسيخ.

2. تحضير وتنقية E. coli- استجابة DNAzyme EC1

  1. توليف EC1 بواسطة قالب وساطة الأنزيمية من ربط
    1. تنقية بالاتصالاتأليغنوكليوتيد] توليفها ercially BS1، DE1، وT1 (تسلسل المنصوص عليها في الجدول رقم 1) بنسبة 10٪ تبديل طبيعة الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (dPAGE) وفقا لبروتوكولات موحدة.
    2. إعداد الأوراق المالية 100 ميكرومتر من BS1، DE1، وT1. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    3. في أنبوب 1.5 مل microfuge، إضافة 38.5 ميكرولتر من ده 2 O و 5 ميكرولتر من DE1، و 5 ميكرولتر من 10X T4 عازلة رد فعل عديد النوكليوتيد كيناز التي يقدمها المورد انزيم (500 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، و 100 ملي MgCl 2، 50 ملي dithiothreitol (DTT)، 1.0 ملي إنتاج الأسبرميدين).
    4. إضافة 1 ميكرولتر من ثلاثي فوسفات الأدينوزين (ATP) (100 ملم). إضافة 5 وحدات من كيناز T4 عديد النوكليوتيد (10 U / ميكرولتر). مزيج من قبل pipetting بعناية خليط التفاعل.
    5. احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    6. إخماد رد فعل عن طريق التسخين إلى 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    7. إضافة 118 ميكرولتر من ده 2 O و 5 ميكرولتر من BS1، و 5 ميكرولتر من T1. حرارة التفاعل إلى 90 درجة مئوية لمدة 2 ميلن ثم بارد لدرجة حرارة الغرفة أكثر من 10 دقيقة.
    8. إضافة 20 ميكرولتر من 10 × T4 DNA العازلة رد فعل يغاز التي يقدمها المورد انزيم (400 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.8)، و 100 ملي MgCl 2، 100 ملي DTT و 5 ملي ATP). إضافة 10 وحدة من يغاز T4 الحمض النووي (5 U / ميكرولتر) وتخلط بعناية من قبل pipetting.
    9. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
    10. إضافة 20 ميكرولتر من 3 خلات الصوديوم M (NaOAc) (الرقم الهيدروجيني 5.2)، و 500 ميكرولتر من البرد الإيثانول بنسبة 100٪. مزيج الحل من قبل vortexing ووضع الأنبوب في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    11. الطرد المركزي microfuge في 20000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة بعناية طاف قبل pipetting.
    12. غسل بيليه مع الباردة الايثانول 70٪ وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 20000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. مرة أخرى إزالة طاف وتجفيف بيليه في ظل فراغ لمدة 10 دقيقة.
    13. Resuspend والحمض النووي مع 15 ميكرولتر من ده 2 O ثم إضافة 15 ميكرولتر من 2X GLB.
    14. دوامة بقوة والحرارة إلى 90 درجة مئوية لمدة2 دقيقة. تنقية الحمض النووي بالطول بنسبة 10٪ dPAGE كما هو موضح أدناه.
  2. إعداد 10٪ dPAGE
    1. لوحات نظيفة اثنين من الزجاج (لوحة واحدة كاملة وحقق واحدة)، واثنين من 0.75 ملم الفواصل سميكة، ومشط 12-جيدا. وضع لوحة كوب واحد على سطح مستو مع اثنين من الفواصل على كل جانب ولوحة حقق على القمة. مقطع لوحات اثنين معا باستخدام مقاطع أربعة المقدمة من المورد.
    2. في 150 مل دورق البلاستيك، صب 40 مل من 10٪ dPAGE، 40 ميكرولتر من tetramethylethylenediamine (TEMED)، و 400 ميكرولتر من فوق كبريتات الأمونيوم 10٪ (APS). خلط المكونات وتصب الحل بين لوحات ببطء.
    3. إدراج مشط ومن ثم السماح للهلام لتتبلمر أكثر من 10 دقيقة. مرة واحدة يتم بلمرة هلام، وإزالة ببطء المشط وتدفق الآبار مع DDH 2 O.
    4. تركيب لوحات على الجهاز الكهربائي للهلام. استخدام لوحة معدنية لتبديد الحرارة المتولدة لمنع ارتفاع درجة الحرارة.
    5. صب TBE 1X على غرف العلوية والسفليةوالتأكد من أن الآبار المغمورة جيدا في المخزن المؤقت. تدفق الآبار مع 1X TBE باستخدام ماصة أو حقنة.
    6. تعيين جهاز لتشغيل عند 35 أمبير وما قبل التشغيل لمدة 15 دقيقة قبل عينات التحميل.
  3. شطف من Ligated EC1 من 10٪ dPAGE
    1. الخطوة التالية 2.2.6، تشغيل هلام في 35 مللي أمبير حتى القاع صبغ (برموفينول الأزرق) تصل إلى الجزء السفلي من لوحة من الزجاج. هذا ينبغي أن تأخذ حوالي 1.5 ساعة. إيقاف الطاقة وإزالة لوحات من الجهاز.
    2. وضع لوحات على بضع ورقات من مناشف ورقية وإزالة بعناية الفواصل من لوحات الزجاج. بعناية إزالة لوحة أعلى الزجاج والتفاف هلام مع غلاف بلاستيكي.
    3. الوجه هلام فوق لإزالة لوحة من الزجاج الثانية، وتغطي مع غلاف بلاستيكي مرة أخرى. الحرص على تجنب التجاعيد فى الاغطية البلاستيكية.
    4. تصور المنتج ligated باستخدام الأشعة فوق البنفسجية التظليل (260 نانومتر)، والتي سوف تنتج 4 نطاقات الحمض النووي مميزة (EC1 ligated بالكامل، DE1، BS1، وT1).
    5. المكوس على الشريط العلوي (EC1) بشفرة حلاقة معقمة ونقل إلى أنبوب 1.5 مل microfuge. سحق هلام مع طرف ماصة معقمة (200 ميكرولتر حجم غيض) حتى يتحول إلى عجينة غرامة. إضافة 550 ميكرولتر من العازلة شطف الحمض النووي، وتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم لحماية fluorophore جزءا لا يتجزأ، ويهز لمدة 15 دقيقة.
    6. أجهزة الطرد المركزي في حل هلام في 20000 x ج لمدة 5 دقائق ونقل بعناية 400 ميكرولتر من طاف لأنبوب 1.5 مل microfuge آخر. تجنب سحب القطع هلام خلال pipetting ل.
    7. إلى microfuge أنبوب مع طاف نقل إضافة 40 ميكرولتر من 3 M NaOAc (الرقم الهيدروجيني 5.2)، و 1.0 مل من البرد الإيثانول بنسبة 100٪. مزيج الحل من قبل vortexing ووضع الأنبوب في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    8. الطرد المركزي microfuge في 20000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة بعناية طاف قبل pipetting.
    9. غسل بيليه مع الباردة الايثانول 70٪ وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 20000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. مرة أخرى، وإزالةطاف وتجفيف بيليه في ظل فراغ لمدة 10 دقيقة.
    10. تحديد تركيز EC1 من خلال قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 260 نانومتر. جعل المخزون 10 ميكرومتر وتخزين العينة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. الإقتران من اليورياز على الحمض النووي

  1. إعداد Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) الهكسان الحلقي-1-الكربوكسيل (SMCC) سهم
    1. حل 1 SMCC ملغ في 676 ميكرولتر من DMSO. دوامة ومكان على الجليد حتى الاستخدام.
  2. إعداد اليورياز المالية
    1. حل 1 ملغ اليورياز في 1 مل من 1 × برنامج تلفزيوني (لا المغنيسيوم 2+ أو الكالسيوم 2+). ضع على الجليد حتى الاستخدام.
      ملاحظة: تبلور اليورياز بطيء إلى حل، وهناك حاجة خلط لطيف لتجنب تمسخ.
  3. توليف اليورياز الحمض النووي (UrDNA)
    1. إضافة 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر LD1 إلى أنبوب 2.5 مل microfuge. إضافة 140 ميكرولتر من ده 2 O، 40 ميكرولتر من 10X برنامج تلفزيوني، ودوامة.
    2. إضافة 80.5 ميكرولتر من SMCC الصورةتوك، 159.5 ميكرولتر من DMSO، الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة باستخدام جهاز للطرد المركزي الفوق.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. تجنب التكثيف تحت سقف microfuge.
    4. إضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X، 60 ميكرولتر من 3 M NaOAc (الرقم الهيدروجيني 5.2)، و 1.5 مل من البرد الإيثانول بنسبة 100٪. مزيج الحل من قبل vortexing واحتضان عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    5. أجهزة الطرد المركزي الحل في 20000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف وتجفيف بيليه في ظل فراغ. تجنب الإفراط في تجفيف.
    6. لبيليه المجففة إضافة 400 ميكرولتر من الأسهم اليورياز ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 ساعة.
    7. نقل 200 ميكرولتر من المكورات الخام إلى 100K MWCO عمود الطرد المركزي فلتر غسلها مسبقا. أجهزة الطرد المركزي لعمود في 14000 x ج لمدة 5 دقائق.
    8. نقل المتبقية 200 ميكرولتر من المكورات الخام إلى العمود والطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة العمود ووضعه رأسا على عقب في 2.0 مل أنبوب microfuge جديدة ( "أنبوب جمع").
    9. Centrifأويغه أنبوب جمع (مع العمود المقلوب) في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة أنبوب جمع وإضافة 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X إلى العمود الطرد المركزي لغسل غشاء للانتعاش إضافي من تقارن.
    10. مرة أخرى عكس العمود والمكان مرة أخرى في أنبوب جمع. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب جمع (مع العمود المقلوب) في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة والتخلص من العمود.
    11. تخزين UrDNA في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

4. جمعية EC1 وUrDNA على الخرز المغناطيسي

  1. خلط الأوراق المالية حبة المغناطيسي (MB) بشكل جيد ونقل 100 ميكرولتر من MB تعليق لأنبوب 1.5 مل microfuge. وضع microfuge أنبوب على حامل حامل المغناطيسي لعزل جماعة الإخوان المسلمين.
  2. إزالة طاف قبل pipetting وإضافة 150 ميكرولتر من العازلة ملزمة (BB) إلى أنبوب. إزالة أنبوب من صاحب والاستفادة بعناية أنبوب ل resuspend جماعة الإخوان المسلمين إلى حل متجانس. تجنب الرش تعليق لرالمرجع من الأنبوب أو غطاء. إذا حدث هذا، استخدم جهاز للطرد المركزي الفوق تدور لفترة وجيزة على بقايا إلى تعليق.
  3. كرر الخطوة 4.2 مرتين أخريين.
  4. لهذا تعليق إضافة 10 ميكرولتر من EC1 10 ميكرومتر. مزيج بعناية من قبل التنصت على أنبوب.
  5. احتضان الحل مع خفيفة تهتز لمدة 30 دقيقة. الاستفادة من أنبوب كل 2-3 دقيقة لتجنب الأمطار من جماعة الإخوان المسلمين.
  6. وضع microfuge أنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسي لعزل جماعة الإخوان المسلمين وإزالة طاف قبل pipetting. غسل MB ثلاث مرات مع 150 ميكرولتر من BB (كما هو موضح في الخطوة 4.2).
  7. وبمجرد أن غسل كاملة، تعليق MB في ما مجموعه 150 ميكرولتر من BB. إلى هذا الحل، إضافة 15 ميكرولتر من UrDNA والحرارة الحل إلى 45 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. تبريد حل لدرجة حرارة الغرفة، واحتضان لمدة 2 ساعة.
  8. وضع microfuge أنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسي لعزل جماعة الإخوان المسلمين وإزالة طاف قبل pipetting.
  9. إضافة 100 ميكرولتر من رد فعل العازلة (RB). إزالة رانه microfuge أنبوب من رف المغناطيسي و resuspend بعناية جماعة الإخوان المسلمين.
  10. غسل MB ثلاث مرات بتكرار الخطوة 4.9.
    ملاحظة: طاف غسلها ويمكن اختبار بسرعة لتحديد ما إذا كان الغير مهجنة UrDNA لا يزال قائما، مما قد يتسبب في إشارة إيجابية كاذبة. ويمكن أن يتم الاختبار عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 50 ملي اليوريا و 10 ميكرولتر من 0.04٪ الفينول الأحمر إلى محلول الغسيل. الاستمرار في غسل MB حتى لا تتسبب في محلول الغسيل تغيير اللون. يتم تخزين تعليق 100 ميكرولتر في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

5. إعداد الخلايا البكتيرية 20

  1. زراعة E. القولونية من الأسهم
    1. لوحة E. القولونية K12 (MG1655) على لوحات أجار LB من المخزون الجلسرين تحت لهب أو في خزانة السلامة البيولوجية.
    2. باستخدام طرف ماصة معقمة، المس بلطف الأسهم الجلسرين وخفيفة متتالية على سطح لوحة أجار لتجنب ثقب آغار LB.
    3. عكس مجزعلوحة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 14 ساعة.
    4. ختم لوحة مع بارافيلم وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة أقصاها 3 أسابيع.
  2. زراعة E. القولونية عن عد الخلايا
    1. في أنبوب ثقافة 14 مل العقيمة، الاستغناء 2 مل من مرق LB.
    2. باستخدام طرف ماصة معقمة، واختيار مستعمرة واحدة من لوحة أجار يشوبه أعدت في الخطوة 5.1 وتحويلها إلى أنبوب الثقافة.
    3. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية ويهز في 230 دورة في الدقيقة لمدة 14 ساعة.
    4. متسلسل تمييع ثقافة البكتيرية في فترات 10 أضعاف.
    5. لكل عينة الواحد، بالتساوي لوحة خمسة 100 مكل على لوحات أجار LB منفصلة. عكس لوحات واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 14 ساعة.
    6. عد الخلايا من كل عينة للحصول على متوسط ​​تركيز خلية من كل تخفيف.
      ملاحظة: 10 7 خلايا غالبا ما تستخدم لإعداد اختبار إشارة الحقيقي لE. القولونية حيث أن هذا المستوى من E. القولونية يمكن أن تؤدي إلى اللون سريع تشانجنرال الكتريك. ومع ذلك، يمكن اختبارا تنفيذها بشكل صحيح كشف ما يصل الى 500 خلية، كما نوقش في قسم النتائج.
  3. إعداد E. خلايا القولونية للاختبار
    1. للتعليق الخلية المطلوبة، نقل 1 مل من الأسهم مثقف لأنبوب 1.5 مل microfuge.
    2. الطرد المركزي الخلايا في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه الخلية.
    3. إضافة 10 ميكرولتر من العازلة رد فعل على بيليه الخلية وresuspend الخلايا. يصوتن تعليق خلية لمدة 5 دقائق. نقل تعليق الخلية إلى مربع الجليد لمدة 5 دقائق.
    4. يصوتن تعليق خلية لمدة 5 دقائق أخرى.
    5. الطرد المركزي تعليق خلية في 13000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. استخدام طاف للاختبار (10 ميكرولتر).

6. محك الاختبار

  1. في أنبوب 1.5 مل microfuge، prewash أنبوب عن طريق إضافة وvortexing ل100 ميكرولتر من رد فعل العازلة (RB) في microfuge أنبوب والتخلص من العازلة.
  2. نقل 15 ميكرولتر من EC1 تجميعها (بروتوكول 4) إلى microfuge أنبوب غسلها.
  3. تغسل حبات المغناطيسي عن طريق وضع microfuge أنبوب على الرف المغناطيسي. إزالة طاف قبل pipetting. إزالة microfuge أنبوب من الرف، إضافة 100 ميكرولتر من RB، و resuspend بعناية حبات مغناطيسية.
  4. غسل MB اثنين من أكثر الأوقات بتكرار الخطوة 6.3.
  5. وضع microfuge أنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسي، وإزالة طاف وإضافة 10 ميكرولتر E. أعدت القولونية عينة من الخطوة 5.3.
  6. خلط العينة والمغناطيسية الخرز بعناية من خلال استغلال بلطف على microfuge أنبوب.
  7. احتضان رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  8. إلى رد فعل، إضافة 90 ميكرولتر من ده 2 O ووضع microfuge أنبوب على الرف المغناطيسي.
  9. بعد ما يقرب من 3 دقائق من الفصل المغناطيسي، نقل بعناية 85 ميكرولتر من طاف لأنبوب 0.5 مل microfuge. سحب طاف ببطء لتجنب جمع أي حبات مغناطيسية.
  10. إلى microfuge أنبوب أعلاه إضافة 15 ميكرولتر من 0.04٪ الفينول الأحمر، و 100 ميكرولتر من حل الركيزة.
  11. التقاط صورة على فترات زمنية محددة لتسجيل تغيير اللون.
    ملاحظة: تغيير في درجة الحموضة يمكن أيضا رصد باستخدام مقياس درجة الحموضة مع مسرى مكروي. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني بدءا حوالي 5،2-5،5 (الحل هو الأصفر). إن لم يكن، والحل يمكن تعديلها بإضافة 1 ملي خلات العازلة درجة الحموضة 5.0).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويفسر مبدأ اختبارا الجرثومي في الشكل 1 يستخدم الاختبار ثلاث مواد رئيسية هي: وDNAzyme الشق الحمض النووي الريبي التي يتم تفعيلها من بكتيريا معينة، اليورياز وحبات مغناطيسية. يتم استخدام DNAzyme باعتبارها العنصر الاعتراف الجزيئي لتحقيق الكشف محددة للغاية للبكتيريا من الفائدة. تستخدم اليورياز وحبات مغناطيسية لتحقيق نقل الإشارة من النشاط الحمض النووي الريبي انشقاق من DNAzyme. وهذا ينطوي على إنشاء حبات مغناطيسية التي تحتوي على تقارن اليور...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتم ترجمة العمل من النشاط النووي الريبي انشقاق من DNAzyme-البكتيريا تستجيب للاختبارا ممكن من خلال استخدام اليورياز والفصل المغناطيسي، كما يتضح من الشكل 1. على الرغم من أن مظاهرة من اختبارا تعديل للكشف عن البكتيريا هي القيام به مع E. القولونية معتمد على DNAzyme الشق RNA، 5،19،20 تصميم ويمكن تمديد عموما لأي DNAzyme الشق الحمض النووي الريبي. ونظرا لتوافر كبير من DNAzymes الشق RNA للالتحاليل المختلفة ومنهجيات مختلفة لعزل DNAzymes جديدة الشق الحمض ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم توفير تمويل هذا المشروع البحثي من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) عبر منحة الاكتشاف إلى YL.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) VWRAMRESCO0105
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)BIO BASIC CANADA INC.SB6789
Tris-baseVWR AMRESCO0497
حمض البوريكAMRESCO0588
UreaVWR AMRESCOM123
40٪ محلول أكريلاميد / بيساكريلاميد (29: 1)BIO BASIC CANADA INC.A0007
السكروزبيوشۆب: كندا ، وشركةSUC507
بروموفينول الأزرقBioshop Canada Inc.BRO777
Xylenecyanol FFSIGMA-ALDRICHX-4126
10٪ كبريتات دوديسيل الصوديومBioshop Canada Inc.SDS001
حمض الهيدروكلوريك (HCl)مختبرات كاليدون المحدودة6026
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)Bioshop Canada Inc.SOD001
4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES)Bioshop Canada Inc.HEP001
كلوريد المغنيسيوم (II) سداسي الهيدراتVWR AMRESCO0288
Tween 20Bioshop Canada Inc.TW508
أدينوزين ثلاثي فوسبات (ATP)AMRESCO0220
ثلاثي هيدرات أسيتات الصوديوم (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
كحول الإيثانول التجاريP016EAAN
رباعي ميثيلين إيثيلين ثنائي الأمين (TEMED)AMRESCO0761
10٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS) BIOBASIC CANADA INC.AB0072
Succinimidyl 4- (N< / em>-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) ThermoFisherSCIENTIFIC22360
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)مختبرات كاليدون803540
UreaseSIGMA-ALDRICHU0251
1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0.04٪ الفينول الأحمرSIGMA-ALDRICHP3532
10x T4 عازلة تفاعل كيناز عديد النوكليوتيداتLucigen30061-1
10x T4 DNA ligase تفاعل عازلBio Basics CanadaB1122-B
T4 DNA ligase (5 U/μ ل)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) مرقAMRESCOJ106
AgarAMRESCOJ637
T4 بولي نوكليوتيد كيناز (10 U/&# 956; ل)Lucigen30061-1
E. coli< / em> K12 (MG1655)ATCCATCC700926
أجهزة الطرد المركزيBeckman Coulter، Inc.392187
ألواح زجاجية CBSالعلميةngp-250nr
فواصل بسمك 0.75 ممCBS ScientificVGS-0725r
مشط 12 جيداCBS ScientificVGC-7512
مصباح الأشعة فوق البنفسجيةUVP95-0017-09
مقياس الطيف الضوئي (NanoVue)GE HealthcareN / A
لوحة معدنيةCBS علميCPA165-250
VortexVWR International58816-123
جهاز الرحلان الكهربائي للهلامCBS العلميASG-250
أطباق بتريVWR الدولية25384-342
100 كيلو دالتون مرشحات الطرد المركزيEMD MilliporeUFC510024
حبة مغناطيسية (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
رف الفصل المغناطيسينيو إنجلاند BioLabsS1506S
أنابيب MicrofugeSarstedt72.69
مرشح حقنة (0.22 &# 956 ؛ م)VWR International28145-501
أنبوب ثقافة 14 ملVWR International60818-725
حاضنة زراعة الخلاياEppendorf ScientificM13520000
Branson منظف بالموجات فوق الصوتيةBransonN / A
Camera (Canon Powershot G11)CanonN / A
أنبوب مخروطي 50 ملVWR International89004-364
كريات

المراجع

  1. Daar, A. S., et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).
  2. Newman, J. D., Turner, A. P. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).
  3. Turner, A. P. Biosensors: sense and sensibility. Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).
  4. Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).
  5. Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
  6. Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
  7. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  8. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  9. Breaker, R. R. Making catalytic DNAs. Science. 290, 2095-2096 (2000).
  10. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).
  11. Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
  12. Li, J., Lu, Y. A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions. J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).
  13. Liu, J., Lu, Y. A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).
  14. Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
  15. Liu, J., et al. A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).
  16. Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides. Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).
  17. Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design. PLoS One. 2, e1224(2007).
  18. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).
  19. Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection. Biomolecules. 3, 563-577 (2013).
  20. Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).
  22. He, S., et al. Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe. Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).
  23. Sumner, J. B., Hand, D. B. Isoelectric point of crystalline urease. J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).
  24. Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. 70 Years of crystalline urease: What have we learned. Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).
  25. Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk. Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).
  26. Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef. J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).
  27. Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).
  28. Strachan, N. J., Ogden, I. D. A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom. FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).
  29. de Boer, E., Beumer, R. R. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).
  30. Gracias, K. S., McKillip, J. L. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food. Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNAzyme RNA E coli pH

مقالات ذات صلة