نقدم هنا بروتوكولا يسهل التوصيف الوظيفي المتوسط إلى العالي للجينات والتركيبات المحفزة في الأنسجة الجذعية الثانوية للشجرة ضمن أطر زمنية قصيرة نسبيا. إنه فعال وسهل الاستخدام وقابل للتطبيق على نطاق واسع على مجموعة من أنواع الأشجار.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام المستحثة الجسدية التحليل القطاعي (ISSA) لدراسة الجينات والمروجين المشاركة في تشكيل الخشب والتنمية الجذعية الثانوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نمو الجذعية الثانوي في الأشجار وتشكيل الخشب المرتبطة هم كبير سواء من وجهة نظر بيولوجية والتجارية. ومع ذلك، لا يعرف إلا القليل نسبيا عن السيطرة الجزيئية التي تتحكم تنميتها. هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى المادية، والموارد وضيق الوقت وغالبا ما ترتبط مع دراسة عمليات النمو الثانوية. وقد تم استخدام عدد من التقنيات في المختبر تنطوي إما مصنع جزء أو نظام مصنع كامل في كلا الخشبية والنباتات غير الخشبية. ومع ذلك، تساؤلات حول إمكانية تطبيقها لدراسة عمليات النمو الجذعية الثانوية، وعناد بعض الأنواع وكثافة اليد العاملة وغالبا ما تكون باهظة للأجل المتوسط إلى تطبيقات إنتاجية عالية. أيضا، عند النظر في تطوير الجذعية والخشب تشكيل الثانوي سمات محددة في إطار التحقيق قد تصبح فقط قابلة للقياس في وقت متأخر من دورة حياة الشجرة بعد عدة سنوات من النمو. في التصدي لهذه التحديات بديل في الجسم الحي صوقد وضعت rotocols، واسمه المستحثة الجسدية تحليل القطاع، والتي تنطوي على إنشاء قطاعات الأنسجة الجسمية المعدلة وراثيا مباشرة في الجذعية الثانوية للنبات. والهدف من هذا البروتوكول هو توفير وسيلة فعالة وسهلة وسريعة نسبيا لخلق الأنسجة النباتية الثانوية المعدلة وراثيا لالجيني وتوصيف وظيفي المروج التي يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من أنواع الأشجار. وتشير النتائج المعروضة هنا أن القطاعات الجذعية الثانوية المعدلة وراثيا يمكن أن تنشأ في جميع الأنسجة الحية وأنواع الخلايا في ثانويه ينبع من مجموعة متنوعة من أنواع الأشجار والخشب الصفات المورفولوجية وكذلك أنماط التعبير المروج في الثانوية ينبع يمكن تقييمها بسهولة تسهيل متوسطة إلى عالية توصيف وظيفي الخرج.
المقدمة
شجرة ينبع تضم كمية كبيرة من الكتلة الحيوية الكواكب وذات الأهمية البيولوجية والثقافية والتجارية الهائلة. ثانويه ينبع خلق الموائل من خلال توفير الموارد والمأوى للعديد من أشكال الحياة الأخرى. أنها تقدم العديد من الخدمات الأخرى إلى النظم البيئية التي تعيش وتعمل كمورد المتجددة لإنتاج الأخشاب والورق وغيرها من الخشب والمنتجات غير الخشبية. ويخضع تنمية الجذعية الثانوية وتشكيل الخشب بشكل أكثر تحديدا من قبل نظام الجزيئية المعقدة التي تنظم تطوير أنواع معينة من الخلايا، وتكوين كيميائي حيوي من جدران الخلايا وكيفية ترتيبها لتشكل الأنسجة والأعضاء. تشريح الأساس الجزيئي للتنمية الجذعية الثانوية وتشكيل الخشب ومرتبك من قبل العديد من العوامل بما في ذلك التغير في خصائص الخشب وساق داخل وبين ينبع وأوقات الجيل طويلة، ونظم التزاوج خارج المعبر، وارتفاع تغاير، وتحميل وراثية عالية، السكون الموسمية، طويل ناضجفترات إقامة السمات الشخصية والحجم المادي الهائل من الأشجار الناضجة. ونتيجة لذلك، فهم التنمية الجذعية الثانوية بالنسبة إلى معرفة تفصيلية لمعظم جوانب أخرى من السيطرة الجزيئية لتطوير المصنع، لا تزال في مهدها.
وقد تم استخدام عدد من التقنيات في المختبر لدراسة وفهم تطور الجذعية الثانوية، في الخشب معين والثانوي تشكيل جدار الخلية. وتشمل هذه البروتوكولات استخدام نبات كامل أو أنظمة جزء النبات، حيث يتم إنشاء أي النباتات المعدلة وراثيا أو يتم تحويل خلايا الثانوية محددة أو أنسجة لدراسة جوانب معينة من الخشب و / أو تطوير الجذعية الثانوي 1. النباتات المعدلة وراثيا يمكن استرداد تحول آخر الوراثي من مجموعة واسعة من الأنسجة النباتية وأنواع الخلايا، ولكن التقدم بطيء، ولا سيما عند تحليل سمات ألياف الخشب بسبب تجديد الطويل ووقف الأوقات النضج (بالترتيب من سنة)، عالية التقنية و رواجا العملس، والإنتاجية المنخفضة من الجينات المرشحة وكذلك صعوبات في نشر بعض أنواع النباتات الخشبية. وقد تم تطوير تقنيات مماثلة في نظام نموذجي غير الخشبية مثل نبات الأرابيدوبسيس أن التغلب بنجاح بعض من هذه القيود، ولكن ليس كل أنواع الخلايا الجذعية الثانوية حاضر في هذه السيقان والصفات المتعلقة موسمية أو طول العمر لا يمكن أن تدرس في مثل هذه الأنواع 2. بدلا من ذلك، نظم جزء النبات، مثل Pinu الصورة رديتا الثقافات الكالس 3 تقلل من الأطر الزمنية المرتبطة بها. هذه الأساليب ولكن تقتصر على الدراسة وجود نوع من الخلايا الفردية ويعاني قيودا مماثلة كما لوحظ للتجارب في المختبر. وبالمثل، فقد أظهرت الثقافات الجذعية قمي 4 تنطوي إإكسبلنتس الجذعية كلها الوعد ولكن حتى الآن لم يتم تطبيق لدراسة الجينات أو المروجين لمصلحة محددة. وفي الآونة الأخيرة، تم وضع بروتوكول بديل تنطوي على الثقافات جذور شعر ليوكاليبتوس وكان بنجاحتطبيق 5، ولكن هذا الأسلوب لا يزال يتطلب في زراعة المختبر، ينطوي على الجذور الثانوية بدلا من السيقان وحتى الآن يقتصر على أنواع الأشجار واحدة.
الناجم عن تحليل قطاع الجسدية (ISSA)، كما هو موضح هنا، وقد وضعت للتغلب على بعض هذه المشاكل توفير متوسطة الى عالية الإنتاجية أداة فحص وظيفي للجينات والمروجين مع الأدوار يشتبه في تشكيل الخشب وتنمية أنسجة الساق الثانوية. ISSA هو التحول وفحص نظام في الجسم الحي والتي وضعت للحد من الوقت اللازم لإنتاج خلايا معدلة وراثيا والأنسجة في جذع الثانوي سليمة في حين التغلب العمل، والقيود الفنية والإنتاجية من روتيني المستخدمة في أساليب المختبر. البروتوكولات وصفها هنا تسمح لإنشاء وقت واحد من مئات من قطاعات الأنسجة تتحول بشكل مستقل والخلايا في ينبع الثانوية في غضون فترة قصيرة من الزمن، في أنواع الأشجار والأنسجة من الاهتمام دون زتباين enetic و / أو البيئة ضمن أطر زمنية قصيرة نسبيا وانخفاض تكلفة اليد العاملة. وصفت ISSA في الجسم الحي تقنيات أولا لالجذعية الثانوي 6 و برعم 7 الأنسجة ومنذ ذلك الحين تم صقلها في أنسجة الساق الثانوية من خلال دراسات الجينات و / أو المروجين تشارك في التمايز متعلق بالصرف المالي وتشمل: تويولين (الحوض) 8، مثل fasciclin arabinogalactan ( FLA) 9، السليلوز سينسيز (CESA) 10 والثانوي الخلية المرتبطة جدار المجال بريدا (SND2) 11، ARBORKNOX (ARK1) 12 ومثيرة للاهتمام حقا الجين الجديد (RING) H2 البروتين 13. هذه الدراسات أجريت في الثانوية ينبع من النباتات أشجار الحور والكافور، وقدمت نظرة ثاقبة مورفولوجيا الخلايا والكيمياء جدار الخلية والتعبير الجيني.
والغرض من هذه البروتوكولات المذكورة هنا من اجل تقريب وتجربةالثانية المعرفة المكتسبة من خلال تطوير وتطبيق ISSA من مجموعة من الدراسات المنشورة وغير المنشورة على مدى العقد الماضي. وهي تركز على التحول في الجسم الحي من أنسجة الساق الثانوية 6 والتركيز على الدراسات التي تنطوي على استنساخ حور أبيض "الهرمي"، الأوكالبتوس كرية وكذلك 11 الأوكالبتوس كرية س استنساخ البان. تأخذ هذه الوثيقة الباحثون من خلال البروتوكول من زراعة النباتات والبكتيريا، والتحول من أنسجة الساق والنمو والحصاد من الأنسجة، وتحديد الخلايا والأنسجة المعدلة وراثيا، والإعداد لعمليات التقييم وأساليب المظهرية لجمع وتحليل البيانات. في حين تم بنجاح تطبيق تقنيات لقياس جدار الخلية تكوين أحادي السكاريد أيضا 9،11، نظرا لضيق المكان، وتركز هذه الوثيقة على التقنيات المستخدمة لقياس الخلايا والتشكل الأنسجة وفهم أنماط التعبير الجيني في الحادي والثانوينظم الإدارة البيئية فقط. وفقا لذلك، وبروتوكول النحو المبين هو مناسبة لأولئك الذين يبحثون لكسب مزيدا من الإيضاحات عن دور و / أو التعبير عن جينات مرتبطة الثانوية ينبع باستخدام منخفضة التكلفة، وسهلة من الناحية الفنية، والمتوسطة إلى طريقة إنتاجية عالية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد المواد النباتية
- قبل التجريب، ورفع شتلة جديدة من أنواع الأشجار المفضلة من البذور أو القطع وتنمو شجرة / ثانية حتى قطر الجذعية في المنطقة المخصصة للالتجريب هو حوالي 1 سم في القطر.
ملاحظة: الوقت اللازم قد تختلف بسبب معدلات نمو النبات وبالتالي تسمح بين 3-9 أشهر لهذه الخطوة.
2. ثنائي ناقل الخلق
- إجراء عمل من هذا الباب إلى الباب 7 في المختبر أو المسببة للاحتباس الحراري حيث يمكن التعامل مع الأجرعية المورمة ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة المنصوص عليها في المختبر يستخدم.
- إعداد ناقل ثنائي تحتوي إما على الجينات من ضربة قاضية الفائدة أو كاسيت overexpression وبيتا غلوكورونيداز (المكتب المركزي للاحصاءات) مراسل كاسيت الجين أو مروج للمصلحة تنصهر في جين والمكتب المركزي للاحصاءات اعتمادا على نوع الدراسة.
ملاحظة: هناك عدد من البكالوريا ناقل ثنائيkbones التي يمكن أن يكون مصدرها تجاريا أو من خلال شبكات البحث وكذلك التقنيات العديدة المتاحة إدراج الجينات والمروجين للاهتمام في ناقلات الثنائية. في سياق هذا البروتوكول هو ما يصل الى المجرب لاتخاذ القرار حول كيفية إنشاء ناقل ثنائي. - تحويل ناقلات ثنائي الى سلالة تم نزع أسلحتهم من أ. المورمة باستخدام Electroporation للأو حرارة صدمة 14 وتخزينها بشكل مناسب لحين الحاجة إليها للتجريب.
- كرر الخطوة 2.2 لأي إيجابية و / أو ضوابط السلبية.
ملاحظة: يجب أن تتضمن الضوابط السلبية ناقل ثنائي لا تحتوي على الجين لجينات دراسة الفائدة والمكتب المركزي للاحصاءات promoterless لمروج للدراسة الفائدة. وينبغي أن تشمل مراقبة إيجابية لمروج للدراسة الفائدة القرنبيط الفسيفساء 35S الفيروسات المروج (CaMV35s) تنصهر لمراسل المكتب المركزي للاحصاءات.
3. إعداد أ. المورمة للتلقيح
- في الأسبوع على الأقل قبل EXPERimentation، تأخذ كمية صغيرة (حوالي 1 ميكرولتر) من أ. المورمة أعدت خلال خطوة 2.2 و 2.3 و تنتشر رقيقة على المتوسطة LB منفصل مع أجار 14 لوحات تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة لاختيار البكتيرية. ينمو بمعدل 28 درجة مئوية في حاضنة لتشكيل مستعمرات صغيرة ومن ثم تخزينها في 4 ° C لحين الحاجة إليها.
- قبل 48 ساعة من التجريب، ونقل مستعمرة واحدة من أ. المورمة من كل لوحة في منفصلة 50 مل رأس المسمار أنابيب تحتوي على 5 مل من قبل تحسنت (28 ° C) وسائل الاعلام LB 14 التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة لاختيار البكتيرية وتستنهض الهمم في 200 دورة في الدقيقة في حاضنة شاكر لمدة ما يقرب من 48 ساعة على 28 درجة مئوية حتى خليط غائما جدا.
- بين 4-6 ساعة قبل التلقيح من محطة ينبع (القسم 4) إضافة 1 مل من LB / أ. المورمة الخليط في 50 مل جديدة المسمار أعلى أنبوب يحتوي على 19 مل (01:20 تمييع) من جديد دافئ (28 درجة مئوية) وسائل الاعلام LB مع المضادات الحيوية المناسبة لاختيار البكتيرية. إذا الكثافة الضوئية (OD) في 600 نانومتر (OD 600، مقاسا الطيفي) فوق 0.1، وتمييع مع مزيد من LB دافئ حتى يتحقق ذلك.
- وضع المخفف LB / أ. المورمة الخليط مرة أخرى على حاضنة شاكر ويهز في ظل نفس الظروف (200 دورة في الدقيقة، 28 درجة مئوية) حتى OD 600 ما بين 0،4-0،6 وإزالتها.
- الطرد المركزي LB / أ. المورمة الخليط لمدة 15 دقيقة في 1000 x ج و 4 درجات مئوية.
- صب السائل و resuspend A. فورا المورمة بيليه في 1 مل من تبريد وسائل الإعلام MS 15، ونقل إلى 2 مل microtube وتخزينها على الجليد حتى المطلوبة للتلقيح (القسم 4). ويشار إلى هذا الحل لمثل التلقيح وسائل الإعلام.
4. تلقيح النبات الجذعية مع أ. المورمة
- بدء التجريب في أواخر الربيع أو أوائل الصيف باستخدام النباتات التي تم إنشاؤها في القسم 1 أن يكون لها طبقة الكامبيوم نشطة وسريعة النمو. والتشخيص جيدة لنشط وسريع طبقة الكامبيوم المتزايد هو أن اللحاء يمكن مقشر بسهولة من الخشب.
- البحث قسم التوالي واضحا على الساق بالقرب من قاعدة النبات وإزالة أي أوراق الشجر والأغصان.
- باستخدام مشرط حاد (ويفضل رقم 11) أو شفرة حلاقة، وخلق 1 سم "نافذة متعلق بالصرف المالي" 2 في القسم واضح للالجذعية عن طريق إدخال اثنين من شق مواز الرأسي من خلال اللحاء من 20 ملم في الطول واحد 5 مم وبصرف النظر بعد ذلك قطع الأفقي الذي يربط بين اثنين من التخفيضات الرأسي في نهايتها القاعدية.
- قشر قطاع اللحاء التي أنشأتها شق تعريض صعودا أنسجة الخشب تطوير وإضافة ما يكفي من التلقيح وسائل الإعلام من الخطوة 3.6 لترطيب سطح الخشب تطوير يتعرض باستخدام ماصة (عادة 5-10 ميكرولتر). على الفور أعد قطاع اللحاء.
- ربط قطاع اللحاء إلى الجذعية بشكل وثيق مع بارافيلم.
- كرر الخطوات من 4،2-4،5 عن أي ويندوز متعلق بالصرف المالي إضافية لهذا الجين (ق) أو المروج (ق) من خلق الفائدةنيويورك النوافذ متعلق بالصرف المالي الجديد لا يقل عن 1 سم فوق أو تحت النوافذ متعلق بالصرف المالي الأخرى وفي 90 ° الإزاحة.
- أكمل الخطوات 4،2-4،5 لناقلات السيطرة الإيجابية والسلبية (خطوة 2.4) ضمان أن تتم إضافة كل متجه إلى نفس الجذعية من كل النباتية المستخدمة في التجربة.
- مراقبة نمو الجذعية قطر بشكل دوري وحصاد المكتب المركزي للاحصاءات فحص (القسم 5) عندما لوحظ نمو شعاعي من 5 مم على الأقل في ينبع.
ملاحظة: مقدار النمو شعاعي اللازمة تعتمد على كمية من الأنسجة اللازمة لتحليل المصب.
5. حصاد لالمكتب المركزي للاحصاءات النسيجي الفحص
- المكوس على "نافذة متعلق بالصرف المالي" من جذع إزالة أي نوع من الأنسجة ليست جزءا من نمو جديد ضمن إطار متعلق بالصرف المالي.
- للدراسات المتعلقة تنضج الخشب واللحاء مورفولوجيا الخلايا / الأنسجة، قشر اللحاء من الخشب.
- للدراسات التي تتطلب منطقة متعلق بالصرف المالي للبقاء أنماط التعبير سليمة أو المروج هي أن تقييمالطبعه، شريحة نافذة متعلق بالصرف المالي بشكل مستعرض باستخدام شفرة حلاقة أو غيرها من شفرة حادة إلى أقراص من بين 0.5 و 1 مم في السمك.
- وضع معالجة الأنسجة نافذة متعلق بالصرف المالي في 14 مل جولة أنابيب أسفل وشطف مرتين في 0.1 م العازلة الفوسفات في درجة الحموضة 7 14. تأكد من أن الأنسجة مغمورة تماما، لا يزال في حل لمدة خمس دقائق على الأقل وتتم إزالة كل حل الزائد في نهاية شطف الثاني.
- إضافة 5 مل من المكتب المركزي للاحصاءات كاشف (0.5 ملم X-gluc (حمض 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-β-D-الغلوكورونيك)، 10 ملي EDTA، 0.5٪ تريتون X-100 ت / ت، و 0.5 ملي البوتاسيوم فيري سيانيد (III)، 0.05 فيروسيانيد ملي البوتاسيوم (II)، تتكون من الحجم النهائي مع 0.1 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7؛ انظر هوكينز وآخرون 16) إلى كل أنبوب. إذا لم يتم المغمورة الأنسجة تماما، إضافة كاشف المكتب المركزي للاحصاءات إضافية.
- احتضان الأنابيب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 55 مئوية في الظلام.
- احتضان أنابيب ل12-16 ساعة إضافية عن حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية في الظلامباستخدام الإثارة لطيف (بين 30 و 60 دورة في الدقيقة) للسماح للخلط.
- عند إزالة من الحاضنة شاكر تحقق عشوائيا درجة الحموضة من المكتب المركزي للاحصاءات كاشف في مجموعة فرعية صغيرة من الأنابيب باستخدام ورقة عباد الشمس مع مجموعة الحموضة 0-7.
- إذا كان أي من الأنابيب لديها درجة الحموضة أقل من 6 ثم تسمية لهم. الاستمرار في مراجعة ما تبقى من الأنابيب لتأكيد الرقم الهيدروجيني وتسمية إذا الرقم الهيدروجيني 6 أو أقل.
ملاحظة: نماذج مع الرقم الهيدروجيني أقل من 6 قد لا تكون مناسبة للتحليل. هذه العينات يجب أن تكون مستبعدة من مزيد من التحليل.
- إذا كان أي من الأنابيب لديها درجة الحموضة أقل من 6 ثم تسمية لهم. الاستمرار في مراجعة ما تبقى من الأنابيب لتأكيد الرقم الهيدروجيني وتسمية إذا الرقم الهيدروجيني 6 أو أقل.
- صب المكتب المركزي للاحصاءات كاشف واستبدالها بعدد كاف من الايثانول 70٪ لتغطية الأنسجة.
- تخزينها في 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
6. تحديد المعدلة وراثيا الأنسجة
- باستخدام ملقط، واخراج كل الأنسجة نافذة متعلق بالصرف المالي من أنبوب ووضعه في علبة صغيرة أو طبق بتري للسماح التصور المجهري.
- باستخدام مجهر تشريح بين 1X و 4X التكبير، وتحديد وحصر عدد الخلايا أو الأنسجةالتي لديها تلطيخ زرقاء لامعة. ويشار إلى الأزرق الخلايا الملون أو الأنسجة لكقطاع من هذه النقطة فصاعدا. حصر لهم في الطرق التالية.
- للعينات التي تم فيها إزالة اللحاء (الخطوة 5.1.1)، والاعتماد على عدد من القطاعات في الأنسجة متعلق بالصرف المالي وجدت على سطح من الخشب تطوير (قطاع متعلق بالصرف المالي، الشكل 1A).
- للعينات التي تم مقطعة إلى أقراص (الخطوة 5.1.2)، والاعتماد على قطاعات عدد جدت في الخلايا او الانسجة أنواع مختلفة (الشكل 1B، 1C، 1D). القطاعات يمكن العثور عليها في أنواع الأنسجة التالية: محيط بالأدمة (قطاع محيط بالأدمة، الشكل 1E)، اللحاء (قطاع اللحاء، الشكل 1F)، الأنسجة متعلق بالصرف المالي القطاع حمة (قطاع متعلق بالصرف المالي، الشكل 1G، 1H، 1I)، الجرح حمة (بالجروح، الشكل 1J) وفي tyloses (قطاع Tylose، الشكل 1K).
- خلال المجهريssessment ضمان أن كلا الجانبين من قرص تم النظر إلى وأن القطاعات التي تحدث عبر اثنين من الأقراص تتم مطابقة بحيث لا يتم المبالغة في تقدير أرقام.
- وضع قطاعات فقط الأنسجة التي تحتوي على العودة إلى أنبوب يحتوي على 70٪ من الإيثانول وتخزينها لحين الحاجة إليها.
- كرر الخطوة 6،1-6،3 لأي النوافذ متعلق بالصرف المالي إضافية بما في ذلك مراقبة إيجابية و / أو سلبية.
- حساب متوسط كفاءة التحويل لكل نوع القطاع لكل الجينات أو مروج للاهتمام والضوابط بشكل منفصل عن طريق قسمة إجمالي عدد القطاعات على العدد الكلي من 1 سم 2 ويندوز متعلق بالصرف المالي لاحتساب متوسط عدد تحول الأحداث في سم 2 من غشاء أحادي الخلية تلقيح (ATScm -2).
- انتقل إلى الخطوة 7.2 و 8 لتحليل أنماط التعبير المروج وخطوة 7.1، 7.2 أو 7.3 لتقنيات لتقييم الخلايا والأنسجة التشكل في أنسجة متعلق بالصرف المالي.
7. تحليلالخلايا والأنسجة الصرف في الأنسجة متعلق بالصرف المالي
ملاحظة: فيما يلي مجموعة من التقنيات التي استخدمت بنجاح لتحليل ISSA المستمدة العينات.
- تحليل منطقة الخشب خلية، منطقة التجويف، وسمك جدار الخلية ومنطقة جدار الخلية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).
ملاحظة: هذا البروتوكول يتطلب إعداد عينة الحد الأدنى ويسمح للإنتاجية عالية نسبيا من تحليل القطاع فيما يتعلق الصفات المورفولوجية المبين.- من هذه الخطوة فصاعدا يرجى التأكد معطف المختبر، وحماية العين وتستخدم قفازات كلما يتم التعامل مع الأنسجة الخشبية وعلاجها.
- تحديد القطاع متعلق بالصرف المالي للتحليل وإجراء شق ما يقرب من 0.5 ملم إلى جانبي باستخدام واحدة حافة شفرة حلاقة لإنشاء قرص (الشكل 2A).
- تقليم قبالة النسيج الخشب الزائدة وترك حوالي 1 ملم من أنسجة الخشب إلى الجانب عرضية من القطاع (الشكل 2B).
- حذرقطع لاي بالعرض من خلال وسط القطاع باستخدام حافة مزدوجة شفرة حلاقة جديدة (الشكل 2C).
- جعل اثنين من الشقوق شعاعي الضحلة إضافية على متن الطائرة عرضية جانبي القطاع لترسيم الأنسجة المعدلة وراثيا (الشكل 2D). كما والمكتب المركزي للاحصاءات تلطيخ لا تخترق عمق الأنسجة متابعة على طول الملفات شعاعي من الخلايا لجانبي النسيج الملون وجدت على سطح متعلق بالصرف المالي.
- نعلق على استعداد وجه قطاع متعلق بالصرف المالي يصل إلى مرحلة من مراحل دبوس كعب SEM جبل باستخدام SEM شريط موصل (2E الشكل) ونضع في المجفف لحين الحاجة إليها لوزارة شؤون المرأة التصور.
- كرر الخطوات من 7.1.2 إلى 7.1.6 عن أي قطاعات إضافية بما في ذلك من سيطرة سلبية.
- باستخدام ووزارة شؤون المرأة في وضع فراغ منخفض (الطاقة 5 كيلو فولت، بقعة 3.0 نانومتر)، تصور والتقاط الصور من الخلايا / الأنسجة داخل القطاع وكذلك الخلايا / الأنسجة المجاورة مباشرة للقطاع (الشكل 2F). كمية من التكبيرتعتمد على الميزات المثيرة للاهتمام. للألياف الخشب، 2،000X مناسبة (الشكل 2G).
- مرة واحدة وقد تم تصور قطاع متعلق بالصرف المالي والصور التي التقطت في أحد التكبير المناسب، وقياس الخشب خلية / الأنسجة الصفات المورفولوجية الاهتمام باستخدام صورة البرنامج قياس.
- للتحليل الإحصائي، وإجراء زوجيا عدة تحليلات باستخدام يقترن تي اختبارات لمقارنة الفرق بين الصرفية قياس في قطاع المعدلة وراثيا والمجاورة غير المعدلة وراثيا الخلايا السيطرة / الأنسجة (قياس تقع ضمن نطاق 0.5 ملم من حافة القطاع) لكل قطاع لتحديد ص -القيمة.
- كرر الخطوة 7.1.10 لمراقبة سلبية.
- في الحالات التي تظهر مراقبة إيجابية على القيمة الاحتمالية المنخفضة (α <0.05)، وحساب الفرق بين راثيا والمجاورة الخلايا غير المعدلة وراثيا / الأنسجة لسمة شكلية. استخدام هذا "الفرق قيمة 'في أونبايريد اختبار t لمقارنة تأثير الجينات في المصالح مع negatإيف التحكم لتحديد القيمة ص.
- تحليل النسيجية من الخلايا متعلق بالصرف المالي / التشكل الأنسجة أو التعبير المروج الأنماط في الخلايا الجذعية / الأنسجة باستخدام المجهر الضوئي.
ملاحظة: في حين أن أكثر من مضيعة للوقت، هذا الأسلوب يسمح لمزيد من الخيارات بما في ذلك الجوانب تحليل ديناميات متعلق بالصرف المالي، على سبيل المثال، عرض متعلق بالصرف المالي فضلا عن أنماط التعبير المروج. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان غير قادر على الوصول إلى SEM، هذا البروتوكول يمكن استخدامها كبديل للخطوة 7.1.- قطاع الإنتاج ذات الاهتمام باستخدام شفرة حلاقة وبعض الأنسجة المحيطة بها كتل صغيرة (لا يزيد عن 1 مم 3) ومكان مباشرة في 1-3 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ في قارورة العينة مع غطاء المسمار لا يقل عن 2 أيام في 4 درجات مئوية على شاكر. إعداد كتلة صغيرة في وسيلة من شأنها أن تسمح للسطح من الفائدة يمكن الوصول إليها من قبل مشراح.
- كرر لأي قطاعات إضافية بما في ذلك من سيطرة سلبية.
- إزالة السائل واستبدالها مع 25٪ من الإيثانول: 75٪ LR خليط البيض لمدة 2 أيام الحفاظ على ظروف.
- كرر الخطوة 7.2.3 مع 50٪ من الإيثانول: 50٪ LR أبيض، 25٪ من الإيثانول: 75٪ LR الأبيض ثم أخيرا مرتين مع 100٪ LR الأبيض.
- وضع كتلة صغيرة في تضمين القالب مع سطح الفائدة الانحياز إلى نهاية قصيرة، وتغطي بعناية مع LR الأبيض النقي وبلمرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- قطع 5 ميكرون المقاطع من سطح الفائدة على مشراح الدوارة وجبل على شريحة زجاجية. استخدام سفرانين O (0.01٪) تلطيخ لتصور جدار الخلية و / أو غيرها من الميزات.
- إضافة وسائط تصاعد، ضع زلة غطاء والسماح لضبط بين عشية وضحاها.
- عرض تحت المجهر الخفيفة بين 100X و600X التكبير والتقاط الصور.
- القبض على الصفات المورفولوجية من الصور باستخدام برنامج صورة القياس.
- للتحليل الإحصائي من الصفات المورفولوجية الكمية، اتبع على من الخطوة 7.1.10.
- للتحليل النوعي من الصفات المورفولوجية،مقارنة ووصف أنماط لوحظت في الجينات أو مروج للاهتمام والسلبية و / أو مراقبة إيجابية.
- تحليل لييف مكروي زاوية (MFA) في ألياف المنقوع باستخدام المجهر الضوئي.
- المكوس المعدلة وراثيا الخشب الأنسجة مباشرة من القطاع وكذلك من الأنسجة غير المعدلة وراثيا المتاخمة لها (تقع ضمن نطاق 0.5 مم، الشكل 2H) ومكان في منفصلة 1.5 مل أنابيب. كرر لأي قطاعات إضافية بما في ذلك من سيطرة سلبية.
- أكمل الخطوات 7.3.3 إلى 7.3.5 في غطاء الدخان.
- إضافة 250 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين و 250 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي إلى كل أنبوب.
- وضع أنبوب في كتلة الحرارة عند 90 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في غطاء الدخان.
- إزالة الأنسجة من أنابيب وشطف بعناية بالماء المقطر مرتين على الأقل.
- استخدام المياه وسائل الإعلام تصاعد القابلة للذوبان، جبل الأنسجة على شريحة زجاجية وندف بعيدا مع ملقط حادة قبل الالصاق زلة غطاء.
- رأيتحت ضوء المجهر والتقاط الصور من الألياف الفردية في تضخم أكبر من 400X.
- لتحديد زاوية لييف مكروي من الألياف، وقياس الزاوية بين فتحات حفرة و / أو التصدعات جدار الخلية ومحور طويل من الألياف (الشكل 2I) باستخدام صورة البرنامج قياس.
- للتحليل الإحصائي، اتبع على من الخطوة 7.1.10.
8. تحليل المروج أنماط التعبير
- تحليل أنماط التعبير المروج في الأنسجة الجذعية الثانوية.
- نحسب ما تردد من كل نوع القطاع لمروج للاهتمام، فضلا عن الضوابط الإيجابية والسلبية كما لوحظ في الخطوة 6.2.2.
- مقارنة تردد من أنواع مختلفة لقطاع المروج في المصالح مع مراقبة إيجابية باستخدام اختبارات تشي مربع لإقامة ف القيم. مزيد من التحليل للخصوصية خلية / الأنسجة يمكن القيام باستخدام الخطوة 7.2 كما هو مطلوب.
- إذا المروج أكثر من واحدمن مصلحة يجري التحقيق ثم كرر هذه المقارنة صنع التحليل بين جميع المروجين للاهتمام ومراقبة إيجابية.
- إذا لوحظ القطاعات أو تلطيخ الأزرق في السيطرة السلبية ثم يضاف هذا إلى تحليل أو التخلي عن هذا يتوقف على مدى أو إذا اشتبه تلطيخ الذاتية (انظر مناقشة).
- تحليل أنماط التعبير المروج خلال متعلق بالصرف المالي التنمية المشتقة والتمايز.
- باستخدام مجهر تشريح، تصور كل القطاعات متعلق بالصرف المالي (الشكل 1G، 1H، 1I) التي تم تحديدها في الخطوة 6.2 وتحديد وجود / غياب تلطيخ الأزرق في ثلاثة أنواع الأنسجة المستمدة من طبقة الكامبيوم. اللحاء (P)، ووضع الخشب (X1) أو وضعت أنسجة الخشب (X2) (انظر الشكل 3A).
- كما في الخطوة 8.1.2، مقارنة تردد من وجود / غياب المكتب المركزي للاحصاءات تلطيخ في مناطق P، X1 و X2 من المروج من كثافة العملياتerest مع مراقبة إيجابية باستخدام اختبارات تشي مربع لإقامة ف القيم. مزيد من التحليل للخصوصية خلية / الأنسجة يمكن القيام باستخدام الخطوة 7.2 كما هو مطلوب.
- نرى خطوات 8.1.2.1 و8.1.2.2 لاعتبارات إضافية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام هذا البروتوكول وقد ثبت عن الخلايا الجذعية والأنسجة أنواع الثانوية الحية لتكون عرضة للA. المورمة التحولات وتم تعريفها في أنواع القطاع استنادا إلى نوع من الخلايا تحولت في البداية، وأنه لاحق نمط النمو التنموي. وتشمل أنواع قطاع محيط بالأدمة، اللحاء، متعلق بالصرف المالي، حمة الجروح وtylose (الشكل 1B، 1C، 1D) ويمكن العثور عليها في مواقع متسقة تصف في ما تبقى من هذه الفقرة. ويتكون قطاع مح...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بروتوكول ISSA هي طريقة بسيطة وفعالة نسبيا لخلق أنسجة الجذعية المعدلة وراثيا في أنواع الأشجار في غضون بضعة أشهر لتحليل الجينات والمروجين للاهتمام المشاركين في الخشب وتنبع تشكيل. القليل من الجهد، وراء حفظ النباتات على قيد الحياة، وذلك لزراعة الأنسجة الجذعية المعدلة وراثيا بعد التلقيح التي تقف على النقيض من الأساليب في المختبر حيث يتطلب زراعة واسعة للحفاظ على الأنسجة أو النباتات، حيث يمكن إنتاج الأخشاب يستغرق فترة تصل الى سنوات لبدء أو حيث حقيقي لم يتم إنشاء الجذعية الثانوي ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
يود المؤلفون الإعراب عن تقديرهم لدعم التمويل لجانب من جوانب العمل من خلال منح الربط LP0776563 (GB و AS) و LP0211919 (GB) وشركاء الصناعة Sappi و Mondi بالإضافة إلى جائزة الدراسات العليا الأسترالية (EM) من مجلس البحوث الأسترالي وجائزة المبتكرين والعلماء الشباب من خلال وزارة الزراعة الأسترالية (LT). نود أيضا أن نشكر Zander Myburg و Qing Wang و Colleen MacMillan و Simon Southerton على المناقشات والأفكار العديدة التي طرحوها أثناء تطوير هذا البروتوكول وإلى Martin Ranik و Minique De Castro و Julio Najera و Valerie Frassiant و Angelique Manuel و Noemie Defaix للمساعدة في العمل المتعلق بالمختبر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| النباتات | NA | NA | يرجى استشارة موردي المشاتل المحليين للنباتات حسب الحاجة |
| سلالة Agrobacterium | NA | NA | هناك العديد من الطرق الممكنة للحصول على سلالات Agrobactrium. نقترح عليك المتابعة داخل مجتمع البحث المحلي الخاص بك حيث قد تكون هناك قيود في الحصول على البكتيريا في بلدك ومنطقتك. |
| المتجه الثنائي (الجين والمحفز) | NA | NA | لقد طورنا مجموعة من النواقل لتناسب بروتوكول ISSA باستخدام نظام Gateway Recombinase. وهذا يشمل الإفراط في التعبير ، والضربة القاضية RNAi وناقلات اندماج المروج بناء على نواقل pCAMBIA المعدلة ويسعدنا توفيرها حسب الحاجة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من النواقل المتاحة لمجتمع البحث. |
| LB media | Sigma | L3022 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| LB media مع أجار | Sigma | L2897 | يمكن الحصول على منتج مشابه من شركة أخرى |
| المضادات الحيوية | Sigma | NA | سيعتمد رقم الكتالوج على المضاد الحيوي الذي تحتاجه حيث يتم استخدام مجموعة من المضادات الحيوية للاختيار البكتيري في النواقل الثنائية. يمكن الحصول على هذا المنتج من a مجموعة الشركات |
| 50 مل أنابيب علوية لولبية | فيشر ساينتفيك | 14-432-22 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| 2 مل Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| MS Media | Sigma | M9274 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| شفرة مشرط رقم 11 | Sigma | S2771 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | هذا هو أفضل منتج لاستخدامه لربط نافذة كامبيال بعد إنشاء |
| 14 مل أنابيب قاع مستديرة | Thermo Scientific | 150268 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| EDTA | Sigma | E6758 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| Triton | Sigma | X100 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| X-Gluc | X-GLUC مباشرة | ستحتاج إلى الانتقال إلى الموقع الإلكتروني للطلب - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| فيريسيانيد البوتاسيوم (III) | سيجما | 244023 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| فيروسيانيد البوتاسيوم (II) | سيجما | P9387 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| ورق عباد | سيجما | WHA10360300 | الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| شفرة حلاقة أحادية الحافة | ProSciTech | L055 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| شفرة حلاقة مزدوجة | الحواف ProSciTech | L056 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| عينة من قارورة مع غطاء لولبي | ProSciTech | L6204 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| Ethanol | sigma | E7023 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| LR white | ProSciTech | C025 | يمكن الحصول على نفس المنتج من شركة أخرى |
| تضمين قالب | ProSciTech | RL090 | نوصي بهذا التنوع ، ولكن هناك الكثير من الخيارات المتاحة |
| وسائط تركيب المياه Soulable | ProSciTech | IA019 | أحد الأمثلة على وسائط التركيب التي يمكن استخدامها ولكن توجد خيارات أخرى ويمكن استكشافها. |
| بيروكسيد الهيدروجين | سيجما | 216763 | يمكن الحصول على منتج مشابه من شركة أخرى |
| مشابه من شركة | |||
| أخرى Safranin O | ProSciTech | C138 | الحصول على منتج مشابه من شركة أخرى |
| Quanta Environmental Scanning Electron | Microscope FEI | هذه هي الأداة المستخدمة في جزء من هذه الدراسة ، ولكن يمكن استخدام أي SEM آخر يحتوي على وضع فراغ منخفض ، | |
| برنامج | من عنوان URL التالي http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
المراجع
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
