مقالة منهجية

Adenofection: منهج في دراسة دور الجزيئية الوصيفات في الخلوي Morphodynamics من التجارب استنفاد الانقاذ

DOI:

10.3791/54557

⸱

سبتمبر 16, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Département de biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie, Faculté de médecine, Centre de recherche sur le cancer de l'Université Laval, 2Oncology, Centre de recherche du CHU de Québec, Université Laval, 3Laboratoire d'études moléculaires des valvulopathies (LEMV), Groupe de recherche en valvulopathies (GRV), Quebec Heart and Lung Institute/Research Center, 4Department of Surgery, Université Laval

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف طريقة لتجارب النضوب والإنقاذ التي تحافظ على السلامة الخلوية وتوازن البروتين. يتيح Adenofection إجراء تحليلات وظيفية للبروتينات داخل العمليات البيولوجية التي تعتمد على الديناميكيات القائمة على الأكتين المضبوطة بدقة ، مثل انقسام الخلايا الانقسامية وتكوين العضلات ، على مستوى الخلية الواحدة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخضع العمليات الخلوية مثل الانقسام وتمايز الخلايا عن طريق التغييرات في شكل الخلية التي تعتمد إلى حد كبير على إعادة السليم للهياكل الخلية هيكل الخلية. وهذا ينطوي على التجميع تفكيك العليا الهياكل الجزيئات في وقت معين، والمكان، وهي عملية حساسة بشكل خاص للاضطرابات الناجمة عن overexpression من البروتينات. الأساليب التي يمكن الحفاظ على توازن بروتين والحفاظ على القصير وطبيعي التشكل الخلوي هي مرغوب فيه للغاية لتحديد مساهمة الوظيفية للبروتين من الفائدة في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية. عابرة التجارب استنزاف الانقاذ بناء على تدخل الحمض النووي الريبي هي نهج قوية لتحليل وظائف البروتين والمتطلبات الهيكلية. ومع ذلك، إعادة إدخال البروتين الهدف مع الحد الأدنى من الانحراف عن مستواه الفسيولوجية هو التحدي الحقيقي. نحن هنا وصف طريقة تسميته adenofection التي وضعت لدراسة دور الجزيئات المصاحبة لشركاء التطوير في التشغيل العادي للتقسيم الخلايا والعلاقة مع إعادة الأكتين. تم استنفاد خلايا هيلا من BAG3 مع الدوبلكس سيرنا تستهدف المنطقة 3'UTR. ويعيد البروتينات BAG3 الموسومة GFP في وقت واحد في> 75٪ من الخلايا باستخدام الفيروسات الغدية المؤتلف بالإضافة إلى الكواشف ترنسفكأيشن. Adenofection سكريبت لتتمكن من التعبير عن البروتينات BAG3-GFP في المستويات الفسيولوجية تقريبا في خلايا هيلا المنضب من BAG3، في ظل عدم وجود استجابة التوتر. لم يلاحظ أي تأثير على مستويات مرافقين بروتين الصدمة الحرارية الذاتية، المنظمين من الإجهاد محرض الرئيسية للتوازن البروتين. وعلاوة على ذلك، وذلك بإضافة baculoviruses القيادة التعبير عن علامات الفلورسنت في وقت خلية التنبيغ ترنسفكأيشن، يمكننا أن تشريح ديناميات الخلايا الإنقسامية التي كتبها المجهرية الوقت الفاصل بين يحلل مع الحد الأدنى من اضطراب التقدم الإنقسامية العادي. Adenofection ينطبق أيضا على خلايا فأر التي يصعب تصيب، ومناسبة للتحليلات وظيفية فرق بالخلايا العضلية الجذعيةerentiation إلى myotubes. وهكذا يوفر adenofection طريقة تنوعا لأداء هيكل الوظائف تحلل البروتينات المشاركة في العمليات البيولوجية الحساسة التي تعتمد على العليا ديناميات هيكل الخلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعطيل وظيفي في التعبير الجيني في خلايا الثدييات هو معيار الذهب لتشريح وظائف البروتين. وضعت حديثا تقنيات التحرير الجينوم على أساس استخدام nucleases مواقع محددة مثل nucleases الزنك الاصبع وتتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / CAS9 تسمح الآن جيل من خطوط الخلايا مع حذف الجينات المستهدفة وطفرة 1،2. وينبغي لهذه المناهج الجديدة ثورة في الطريقة التي ندرسها وظيفة البروتين وفهمنا لعلم الوراثة من الأمراض التي تصيب الإنسان. في بعض الحالات، ومع ذلك، على المدى الطويل أو بالضربة القاضية جين كامل غير مرغوب فيه وربما يثير آليات التعويض خلية الثانوية. جيل من خطوط الخلايا المعدلة وراثيا ويمكن أيضا أن يكون الحد عند ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد المتوسطة وحلول (كل العقيمة التي تمت تصفيتها)

  1. C2C12 خلايا العضلات الماوس (دراسات التمايز)
    1. إعداد 500 مل من النمو المتوسطة لC2C12 صيانة زراعة الخلايا: DMEM الجلوكوز عالية تستكمل مع 10٪ FBS و2mm و L-الجلوتامين.
    2. إعداد 100 مل متوسطة التمايز (DM) للتمايز C2C12: DMEM الجلوكوز عالية تستكمل مع 2٪ الحصان المصل.
  2. خلايا هيل....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وارتبط ترنسفكأيشن البلازميد الحمض النووي BAG3-GFP باستخدام الدهون الموجبة مع التعبير غير متجانسة في خلايا هيلا، بعض الخلايا التي تبين مستويات يصعب رصدها بسهولة من البروتين وغيرها تحمل مستويات عالية جدا من BAG3 (الشكل 2A). في هذه الخلايا، ودل على فقدان التوازن البروتين عن طريق تراكم BAG3-GFP في المجاميع محيط بالنواة (الشكل 2A، السهام). في المقابل، تنبيغ الخلايا الغدية مع تحمل BAG3-GFP أظهرت انخفاض التعبير أكثر تجانس.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، وصفنا طريقة تمكين التجارب استنزاف الانقاذ التي يتعين القيام بها، والتي تنطبق على تحليلات وظيفية عمليات الخلية البيولوجية التي هي حساسة بشكل خاص للoverexpression من البروتينات التي تؤثر على العناصر المتفاعلة وديناميات البروتين المجمعات والمنشآت الجزيئات. انقسام الخلية الإنقسامية هو مثالا صارخا على morphodynamics خلية دقيقا ينطوي على تغييرات دراماتيكية ومثيرة في الهيكل العام للخلية. باستخدام adenofection جنبا إلى جنب مع الكواشف BacMam المتاحة تجاريا لإدخال كميات قليلة ولكن يمكن.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'>تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (المنحة رقم 7077) ، ومؤسسة بيليني وروبي فوندازيوني.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
C2C12 الماوس الأرومات العضلية ATCCCRL-1772
الغدي تصميم مخصصWelgenتصميم
كلوريد الكالسيومفيشر ScientificC79-500
CellLight & reg ؛ الأكتين GFP ، BacMam 2.0ثيرمو فيشرC10582
CellLight & reg ؛ Tubulin-RFP ، BacMam 2.0Thermo FisherC10614
Dulbecco ' s النسر المعدل s متوسطة (DMEM) ، ارتفاع الجلوكوزالحرارية فيشر11965-092
EDTASigmaE5134
مصل الأبقار الجنينية (FBS) ThermoFisher12483-020
FibronectinSigmaF1141
أطباق القاع الزجاجي ، 35 ممMatTek CorperationP35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2Bهدية لطيفة من الدكتورة سابين إيلوي ، Qu & eacute; bec ، كنداKlebig C et al.< / em> 2009
HEPESFisher ScientificBP310-1
مصل الحصان ، نيوزيلنداثيرمو فيشر16050-122
KClفيشر العلميBP366-500
L-GlutamineThermo Fisher25030081
Lipofectamine & reg ؛ كاشف النفدة RNAiMAXثيرمو فيشر13778-150
الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) ألفاويسنت310-101-CL
الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) ألفا بدون ديسوكسي ريبونوليوسيدات / ريبونوكليوسيداتثيرمو فيشر12000-022
الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) ألفا بدون فينول أحمرثيرمو فيشر41061-029
Na2< / sub>HPO4< / sub>BiobasicS0404
كلوريد الصوديومفيشر العلميBP358-10
OptiMEMثيرمو فيشر11058-021
rAVCMV< / sup>-LifeAct-TagGFP2IBIDI60121
siRNA على الوجهيندارماكونتصميم
الثيميدينسيجماT9250
التربسين 2.5٪ثيرمو فيشر15090-046
الفيروس مخصصمخصص

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
  2. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

AdenofectionDepletion RescueMolecular ChaperonesCellular MorphodynamicsBAG3 ProteinsiRNA TransductionAdenovirus ExpressionGFP TaggingMitotic AnalysisLive Cell Imaging

مقالات ذات صلة