يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

يبلوع الهجرة والسرعة تقاس في لايف الابتدائية الضامة الإنسان المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1

7.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54568

⸱

سبتمبر 5, 2016

 ,  ,  , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

في هذه المقالة

ملخص

نصف طريقة لقياس سرعة تحرك البلعمة نحو مركز الخلية في الخلايا الحية المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) من النوع 1 أو بدونه ، باستخدام الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر للقرص الدوار لتحديد الخلايا المصابة بالفلورسنت والفحص المجهري للمجال الساطع للكشف عن البلعمة.

الملخص

البلاعم هي خلايا بلعمة تلعب دورا رئيسيا عند مفترق الطرق بين المناعة الفطرية والحصانة المحددة. يمكن أن تصاب بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) -1 وبسبب مقاومتها لآثاره الاعتلال الخلوي ، يمكن اعتبارها خزانات فيروسية ثابتة. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر البلاعم المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وظائف معيبة تساهم في تطور الأمراض الانتهازية.

كانت الآلية الدقيقة التي يضعف بها فيروس نقص المناعة البشرية -1 الاستجابة البلعمية للضامة غير معروفة. لقد أظهرنا سابقا أن امتصاص البلاعم لمواد الجسيمات المختلفة تم تثبيطه عندما أصيبت بفيروس نقص المناعة البشرية -1. كان هذا التثبيط جزئيا فقط وتشكلت البلعمة داخل البلاعم المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. لذلك ، ركزنا على تحليل مصير هذه البلعمة. يصاحب نضوج البلعمة هجرة هذه المقصورات نحو مركز الخلية ، حيث تندمج مع الجسيمات الحالة ، مما يولد الجسيمات البلعمية ، المسؤولة عن تدهور المادة المبتلعة. استخدمنا خلايا الدم الحمراء للأغنام IgG-opsonized كهدف للبلعمة. لقياس سرعة حركة الجاذبية للبلعمة في البلاعم الفردية المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية ، استخدمنا مزيجا من المجهر متحد البؤر للمجال الساطع والفلورة. أنشأنا طريقة لحساب مسافة البلعمة باتجاه النواة ، ثم لحساب سرعة البلعمة. تم التعرف على الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية بفضل الفيروس المعبر عن GFP ، ولكن الطريقة قابلة للتطبيق على الخلايا غير المصابة أو أي نوع من العدوى أو العلاج.

المقدمة

تلعب البلاعم دورا رئيسيا في الجهاز المناعي الفطري وفي التوازن. إنها خلايا بلعمة محترفة تستوعب وتقضي على مسببات الأمراض والحطام من خلال عملية تسمى البلعمة 1،2. يخضع البلعمة ، الحجرة المغلقة التي تتشكل بعد ابتلاع مادة الجسيمات ، لسلسلة من أحداث الاندماج والانشطار مع مقصورات داخلية ، مما يؤدي إلى حجرة متدهورة تسمى البلعمة. تحتوي هذه الحجرة على درجة حموضة حمضية ، بسبب اكتساب v-ATPases التي تضخ البروتون ، وتحتوي على إنزيمات تحلل مائي وغنية ببروتينات الغشاء المرتبطة بالليزوزومات (LAMPs). يصاحب نضوج البلعمات هجرتها على الأنابيب الدقيقة 3،4 باتجاه مركز الخلية للوصول إلى موقع حول النواة حيث تتراكم الجسيمات الحالة.

تم الإبلاغ عن العديد من مسببات الأمراض لاختطاف نضوج البلعمة ، بما في ذلك البكتيريا ذات أنماط الحياة داخل الخلايا التي تعدل البيئة الفراغية حيث تقيم 5. يستهدف فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) -1 البلاعم بالإضافة إلى الخلايا التائية. نظرا لأن البلاعم تقاوم تأثيرات الاعتلال الخلوي للفيروس ، على عكس الخلايا التائية ، يمكن اعتبارها خزانا للفيروس. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر البلاعم المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 وظائف بلعمية معيبة وتساهم في ظهور أمراض انتهازية. وعلى وجه الخصوص، كان مرض السالمونيلا غير التيفوئيدي الشديد الناجم عن السالمونيلا التيفيموريوم ST313 سائدا على مدى العقود الثلاثة الماضية بين الأطفال أو البالغين المصابين بفيروس العوز المناعي البشري 6 في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى. تشير التقديرات إلى أن خطر الإصابة بالسل أكبر بأكثر من 20 مرة بين الأشخاص المصابين بفيروس العوز المناعي البشري مقارنة بالأشخاص غير المصابين بفيروس العوز المناعي البشري.

لكل هذه الأسباب ، من المهم تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء عيوب البلعمة في الضامة المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية بشكل أفضل. لقد أظهرنا أن امتصاص المواد الجسيمية أو الجسيمات المضادة أو البكتيريا أو الفطريات قد تم تثبيطه في البلاعم المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية 7. بالنظر إلى أن هذا التثبيط جزئي ، شرعنا بعد ذلك في تحليل مصير البلعمة الداخلية في البلاعم البشرية المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية 8. نظرا لأن نضوج البلعمة يرتبط ارتباطا وثيقا بالهجرة إلى مركز الخلية والاندماج مع الجسيمات الحالة ، فقد يكون الخلل في النضج البلعمي ناتجا عن تعديلات في طرق الاتجار في الخلية المصابة. تستخدم الطريقة الموضحة هنا خلايا الدم الحمراء للأغنام IgG-opsonized (IgG-SRBCs) كنموذج لاستهداف البلعمة بوساطة المستقبلات وعلى وجه الخصوص المستقبلات لجزء Fc من الغلوبولين المناعي (FcR). هذه الجسيمات أسهل في التصوير في المجال الساطع (BF) من حبات اللاتكس لأن كرات الدم السرطانية خارج الخلية وداخل الخلايا تظهر خصائص انكسار مختلفة 9. لقياس سرعة تحرك البلعمة نحو النواة في البلاعم المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية ، استخدمنا فيروس الفلورسنت 10 وأنشأنا طريقة تتبع يدوية بسيطة موصوفة هنا. لا تتطلب الطريقة برمجة متقدمة وتستخدم ببساطة ImageJ. إنه قابل للخلايا الملتصقة وأي نوع من الجسيمات أو مسببات الأمراض التي يمكن تصورها باستخدام الفحص المجهري للمجال الساطع أو بالتصوير الفلوري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بروتوكول لابد من تنفيذها بما يتفق تماما مع التشريعات الوطنية والدولية واللوائح المحلية. وقد تم الحصول على الدم من المتبرعين الأصحاء التي أعطت موافقتها على التبرع بالدم لأغراض البحث من مراكز نقل الدم التي وقعت المؤسسات الاتفاق. يجب أن تؤخذ حماية خاصة عند استخدام الدم البشري. تجارب مع HIV-1 يجب ان تتم في مستوى السلامة الحيوية 3 أو 2 (BSL-3 أو 2) مختبر وفقا للتشريعات المحلية.

1. إعداد الضامة الوحيدات المستمدة-الإنسان (hMDMs) من خلال التدرج الكثافة الطرد المركزي واختيار من التصاق

  1. تبدأ مع دماء جديدة من المتبرعين الأصحاء (9 مل). تمييع كامل حجم دماء جديدة مع 1X العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ للحصول على الحجم النهائي من 70 مل وإضافة بلطف الدم المخفف إلى قسمين أنابيب مخروطية 50 مل (35 مل لكل أنبوب) ، وعلى رأس 15 مل منeutral، تشعبت للغاية، عالية الشامل، السكاريد ماء في حل بالفعل في كل أنبوب.
  2. أجهزة الطرد المركزي كل من أنابيب الدم في 537 x ج لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية دون فرامل. ثم جمع الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs) الواردة في عصابة خلية غائم في واجهة ونقلها إلى أنبوب 50 مل جديدة تحتوي على 15 مل من برنامج تلفزيوني 1X دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+.
  3. الطرد المركزي الخلايا في 218 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية و resuspend بيليه في 45 مل من برنامج تلفزيوني 1X دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+.
  4. الطرد المركزي الخلايا في 218 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية، Resuspend وبيليه في 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+، والاعتماد على الخلايا عن طريق تمييع لتخفيف النهائي من 1/200 في التريبان الأزرق.
  5. الطرد المركزي الخلايا في 218 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية و resuspend بيليه في RPMI (روزويل معهد الحديقة التذكارية) 1640 المتوسطة تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين و 100 ميكروغرام / مل penicillin-الستربتومايسين لديك 7 × 10 6 PBMCs لكل بئر في 2 مل من المتوسط ​​في كل بئر من بئر لوحة 6.
  6. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 2 ساعة. بعد 2 ساعة وانضمت حيدات إلى البلاستيك.
  7. للسماح حيدات المعزولة حديثا لتفرق في hMDMs، نضح المتوسطة واستبدالها مع 2 مل hMDM المتوسطة (RPMI 1640، 10٪ decomplemented الجنين العجل المصل (FCS)، 2 مم L-الجلوتامين و 1٪ البنسلين ستربتومايسين) تستكمل مع المؤتلف الإنسان بلعم مستعمرة عامل تحفيز (RHM-CSF) بتركيز نهائي من 10 نانوغرام / مل.
  8. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 11 يوما (الشكل 1).
  9. في يوم 11 إزالة المتوسطة وغسل 2 مرات مع 2 مل من المتوسط ​​hMDM البارد لكل بئر. التالي غسل كل بئر 2 مرات مع 1 مل من البرد برنامج تلفزيوني 1X.
  10. لفصل hMDMs متباينة تماما، وغسل كل مرة بشكل جيد 1 مع 1 مل من البرد برنامج تلفزيوني 1X مع 2 مم حمض ethylenediaminetetraacetatic (EDTA) واحتضان الخلايا في 2 مل من البرد برنامج تلفزيوني 1X مع 2 مم EDTA لكل بئر ل15-60 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: طرق بديلة لفصل الخلايا موجودة (على سبيل المثال، التربسين أو الأنشطة مثل التربسين) التي قد تعطي نتائج جيدة 11.
  11. بعد انفصال (أنجزت من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا في البئر)، وجمع الخلايا ووضعها في أنبوب 50 مل على الجليد التي تحتوي على 10 مل من المتوسط ​​hMDM البارد.
  12. الطرد المركزي الخلايا في 218 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية، Resuspend وبيليه في 10 مل من المتوسط ​​hMDM البارد، والاعتماد على الخلايا عن طريق تمييع 1/20 في التريبان الأزرق.
  13. البذور الخلايا في 1 × 10 6 hMDMs في 35 مم المجهر الصف الزجاج طبق أسفل واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 1 يوم.

2. الإنتاج النوعي والكمي لفيروس نقص المناعة البشرية-1 أسهم الفيروسية

ملاحظة: NLR4.3 HIV-1 الكمامة-iGFP (الأخضر بروتين فلوري) يحمل مظروفا R5-الاستوائية، هدية من السيد Schindlيستخدم إيه 10 إلى إصابة الضامة ورؤية الخلايا المصابة في الوقت الحقيقي.

  1. إنتاج مخزونات الفيروسية التي ترنسفكأيشن من الخلايا الجنينية البشرية 293T الكلى (2 × 10 6 في 100 طبق مم) مع 6 ميكروغرام من الحمض النووي proviral المقابلة باستخدام كاشف ترنسفكأيشن التجاري.
  2. قياس العدوى من مخزونات فيروس باستخدام خلايا مؤشر هيلا تزم-BL (تحمل الجين ß غالاكتوزيداز تحت سيطرة HIV-1 LTR) باستخدام التخفيفات المسلسل من الأسهم الفيروسية تليها تلوين ß غالاكتوزيداز من الخلايا والعد خلايا الزرقاء 12.

3. العدوى من hMDMs مع HIV-1

  1. إضافة الفيروس في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) 0،02-0،03 في 1 مل من hMDM المتوسطة إلى hMDMs (خلايا مطلي في 1.13). للسيطرة على آبار إضافة 1 فقط مل من hMDM المتوسطة واحتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 ل 2 أيام (الشكل 1).
  2. في يوم 2 غسل الخلايا مع hMDM ميدالبوتاسيوم 3 مرات وإضافة 1 مل من المتوسط ​​hMDM جديدة لكل طبق. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 6 أيام (الشكل 1).

4. طهاية الأغنام خلايا الدم الحمراء

  1. لإعداد 7 × 10 6 SRBCs في طبق، وغسل SRBCs مرتين في 100 ميكرولتر من محلول يحتوي على 0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) في برنامج تلفزيوني 1X مع الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 4 دقائق.
  2. Resuspend وSRBCs غسلها في 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X / BSA 0.1٪ مع أرنب مفتش مكافحة SRBCs بتركيز-التصاق الفرعية في 5 ميكرولتر من SRBCs واحتضان مع التناوب في RT لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: لتحديد تركيز-التصاق الفرعية معاداة SRBCs مفتش، وإعداد التخفيفات المسلسل من مفتش (تركيز الأسهم بنسبة 13.1 ملغ / مل) من 1/50 إلى 1/25600 في 20 ميكرولتر في لوحة 96-جيدا. إضافة 2 × 10 6 SRBCs في 20 ميكرولتر في كل بئر ووضع لوحة في غرفة مظلمة خلال عدة ساعة. تركيز دون التصاق هوالتخفيف من البئر قبل البئر مع تراص (مفتش + SRBCs تشكيل شبكة).
  3. بعد دوران، الطرد المركزي، SRBCs opsonized مفتش-في 600 x ج لمدة 4 دقائق ويغسل مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X / BSA 0.1٪ مع الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 4 دقائق.
  4. Resuspend و-SRBCs opsonized مفتش في متوسطة الفينول الحمراء الخالية RPMI استعد قبل أن تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين و 1٪ البنسلين ستربتومايسين (1 مل / طبق).

5. الخلية الحية فيديو المجهر البلعمة الفحص

  1. استخدام نظام التصوير متحد البؤر مثل نظام القرص الغزل مجهزة غرفة التدفئة عند 37 درجة مئوية مع CO 2 يمر زجاجة مع الماء لترطيب.
  2. بدوره على غرفة التدفئة قبل التجربة لمرحلة المجهر عند 37 درجة مئوية قبل بداية الفحص البلعمة. بدوره على المجهر والكمبيوتر، وتحميل برامج التصوير.
  3. تحسين إعدادات التصوير مثل سرعة المسح الضوئي، وتعظمأيون، والقرار، وما إلى ذلك ليكون خلية واحدة على الأقل لكل حقل وصورة إطار واحد كل دقيقة ما بين 60 إلى 120 دقيقة.
    ملاحظة: هنا، هو تصوير العينة إطار واحد كل دقيقة خلال 60 دقيقة مع 63X عدسة.
  4. ضع صحن التصوير على المسرح المجهر. ضبط التركيز والموقع إلى العثور على واحد فقط كله HIV-1 بلعم المصابين في هذا المجال. استخدام إعدادات الإثارة / الانبعاثات المناسبة بناء على نظام التصوير المستخدمة والتحقيق. تشمل قناة مشرق الميدان (BF) لمراقبة جسم بلعمي (الشكل 1ii). تحسين مظهر الصور قناة مختلفة عن طريق ضبط نسبة تنتقل وقت الضوء والتعرض.
    ملاحظة: وهنا، كان NLR4.3 HIV-1 الكمامة-iGFP متحمس باستخدام الليزر 491 نانومتر مع 50 ميللي ثانية من التعرض لفترة مع 20٪ من الليزر (الشكل 1I).
  5. إزالة الطبق التصوير وإضافة 1 مل من تعليق SRBC في 7 × 10 6 SRBCs / مل إلى الطبق (الشكل 1).
  6. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج ل2 دقيقة في RT لمزامنة البلعمة، وتسجيل الوقت في نهاية هذا الطرد المركزي وعودة الطبق إلى المرحلة.
  7. تحسين التركيز والتقاط GFP والصور BF في Z-مداخن (طوال سمك الخلية مع خطوة مسافة 0.3 ميكرون - عادة 20 طائرة) كل دقيقة على الأقل 1 ساعة. حفظ الفيديو في الوقت الفاصل بين الأصلي الملفات شكل نظام التصوير المستخدمة.
    ملاحظة: هنا، وحفظ الوقت الفاصل بين الأفلام في تنسيق أصلي، * ملفات .stk.

6. تحليل أفلام الوقت الفاصل

  1. لتحرير الفيديو، انقر على القائمة المنسدلة "تطبيقات" وعلى علامة التبويب "مراجعة متعدد الأبعاد بيانات" في برامج تحرير الفيديو.
    1. لفتح الملف، اضغط على "ملف قاعدة الاختيار" ثم على "تحديد دليل". في "مجموعات البيانات"، حدد الحصول على تحليل (في شكل .nd) وانقر على "إرسال". يتم تمثيل البيانات في الجدول مع الوقت في عمودد Z-الخطة في الخط.
    2. لتمثيل العدوى في Z-الإسقاط (الشكل 2، لوحات اليسار)، وحدد 491 نانومتر الطول الموجي في خانة "موجات" وانقر على "Z إسقاط" علامة التبويب مع "كل الطائرات".
    3. لتحليل التسلسل الزمني، حدد BF الطول الموجي في خانة "موجات" واختيار الطائرة المثلى على المحور Z لتمييز SRBCs الخارجية (الشكل 2، رأس السهم الأحمر)، SRBCs الداخلية (الشكل 2، دائرة حمراء) والنواة ( الرقم 2، الدائرة الزرقاء).
    4. لحفظ مونتاج الفيديو، اضغط على "اختيار [إكس]" علامة التبويب، ثم على "تحميل صورة (الصورة)". وأخيرا، حفظ الصور المحملة في. TIF شكل وفتحها المقبل على برنامج ImageJ.
  2. استخدام البرنامج المساعد "تتبع يدوي" على برنامج ImageJ لقياس موقف نواة وجسم بلعمي المختلفة التي لوحظت في قناة BF (الشكل 3).
    1. داوnload "دليل تتبع" المساعد على موقع يماغيج. على يماغيج، فتح البرنامج المساعد وتسلسل الصور ليتم تحليلها (الشكل 3، الخطوة 1 و 2).
    2. إدخال الضبط مثل "الفاصل الزمني" الذي يمثل مقدار الوقت بين الإطارات المجاورة، و "س / ص المعايرة" التي تمثل المسافة لكل بكسل (الشكل 3، الخطوة 3).
      ملاحظة: هنا، حفظ تسلسل الصور مع فاصل زمني من 1 دقيقة بين كل إطار وس / ص معايرة 0.205 ميكرون لأنه يتم استخدام التكبير 63X وكاميرا مع حجم بكسل 6.45 س 6.45 ميكرون 2.
    3. لبدء تتبع، انقر على "أضف المسار" (الشكل 3، الخطوة 4) وانقر على مركز SRBC في المرة الأولى عندما المنضوية ذلك. يظهر الإطار التالي تلقائيا.
    4. مواصلة الضغط على مركز SRBC في جميع الأطر لديهما مواقف مختلفة خلال الفترة (الشكل 3، الخطوة 6 في مربع أحمر).
      1. البدء في تتبع نواة لمكانتها في جميع الأطر من خلال النقر على وسطها. التالي تتبع جسم بلعمي (بالنقر على مركزها) واحدا تلو الآخر في ذلك الوقت (الإطار) من استيعاب، ومختلف في وظيفة SRBCs. لراحة لرؤية SRBC على قناة BF، استخدام إطار "السطوع والتباين" خلال تتبع (الشكل 3، الخطوة 5).
    5. بين كل تتبع SRBC، انقر على "أضف المسار" (الشكل 3، الخطوة 4) أن يكون مسار جديد. سيتم تغيير عدد تتبع في العمود الثاني، "المسار رقم" من جدول النتائج (الشكل 3، الخطوة 6).
    6. حفظ البيانات في جداول للمتابعة إلى الخطوة التالية من التحليل.
  3. استخدام برنامج جداول البيانات لحساب المسافة المقطوعة من جسم بلعمي تحتوي على SRBCs نحو النواة وسرعة للجسم بلعمي خلال دقائق 5 الأولى بعد استيعاب SRBCs (فايجوري 4).
    1. فتح جدول البيانات وملف جدول جديد. نقل إلى هذا الملف الجديد المعلمات التالية فقط، والوقت، وX- وY- تنسيق النواة وجميع SRBCs الشكل (4A).
    2. لحساب المسافة بين SRBCs والنواة مع الإحداثيات الخاصة بها فقط، والنظر في نواة وSRBC في-XY تنسيق الطائرة (الشكل 4B).
      ملاحظة: المسافة بين نقطتين هو طول المسار الذي يربط بينها. في الطائرة، ونظرا للمسافة بين SRBC والنواة التي كتبها نظرية فيثاغورس.
      1. إذا ج (المسافة بين النواة وSRBC) يدل على طول الوتر وأ و ب للدلالة على أطوال الجانبين الآخرين، والتعبير عن نظرية فيثاغورس 'كما معادلة فيثاغورس:
        figure-protocol-1
        ملاحظة: في الوقت نفسه، على المتعامدة المعيرة، والمسافة الأفقيةوهو (خ نواة -x SRBC) والمسافة ب الرأسية (ذ نواة -y SRBC).
      2. وهكذا، وحساب المسافة بين النواة وSRBC (الشكل 4A، مربع الأرجواني) من خلال:
        figure-protocol-2
        ملاحظة: مضاعفة قيمة المسافة التي تم الحصول عليها (بالبكسل) من س / ص المعايرة لديك المسافة في ميكرون. هنا، معايرة س / ص هو 0.205 ميكرون.
      3. في كل مرة، طرح المسافة بين النواة وSRBC لبعد المسافة الأولى (الشكل 4C).
      4. رسم قياس ضد الساعة لمدة 5 دقائق الأولى. تطبيق خط الاتجاه الخطي (الشكل 5A) في المؤامرة وتحديد المنحدر من خط الاتجاه الخطي الذي يمثل سرعة يبلوع نحو النواة خلال دقائق 5 الأولى بعد استيعاب SRBC.
      5. جمع البيانات لحساب الخطأ العادي والإحصائي للقيم السرعة ومؤامرة لهم في شكل ملائم باستخدام البرنامج المناسب (الشكل 5B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

FCR بوساطة البلعمة من قبل hMDMs المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (1) وغير المصابين يوصف هنا باستخدام SRBCs opsonized مفتش-كأهداف نموذج (الشكل 1). الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول هي إعداد hMDMs والإصابة بفيروس HIV-1. والواقع أن المحصول وجودة الضامة متباينة تتراوح بين الجهات المانحة، وكذلك معدل الإصابة مع الكفاءة في حدود 10-40٪. وبالإضافة إلى ذلك، وإعداد مفتش-opsonized-SRBCs مهم أيضا لتجنب إتلاف خلايا الدم الحمراء، لأن هذا يمكن أن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هذه التقنية لديها العديد من الخطوات الحاسمة. أولا، إعداد hMDMs والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 هو في غاية الأهمية لأن نسبة الإصابة هي من المانحين التابع. وتجدر الإشارة، قررنا استخدام الضامة التي لم يتم الاستقطاب في المختبر قبل الإصابة، لأن الوضع الضامة يحتمل أن تكون من الفيروس في الجسم الحي واجه لم يتم توصيفه جيدا حتى الآن. نحن فحصنا التعبير العديد من علامات السطحية، مشيرا إلى أن الضامة ليست M1 M2 ولا، والتحقق من التعبير عن CD4 وCCR5. معدلات الإصابة متفاوتة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور جميل جبرال على قراءة المخطوطة. تم دعم هذا العمل من خلال منح من CNRS و Inserm و Université Paris Descartes و Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02) و Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 بما في ذلك زمالة الدكتوراه ل GLB) والوكالة الوطنية للبحوث من أجل الاستخبارات والدراسات العليا (ANRS، بما في ذلك زمالة ما بعد الدكتوراه للقرص المضغوط) إلى FN.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Falcon 100 mm TC-معالجة TC صحنثقافة الخلية Corning353003للإنتاج الفيروسي
أطباق القاع الزجاجي 35 مم غير مصقول 1.5شركة MatTekCorporation P35G-1.5-14-C حالةللاقتناء
Falcon Tissue Culture Plates 6-wellThermo Fischer ScientificCorning. Inc. 353934للبلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية
Ficoll-Plaque PLUSDominique Dutscher17-1440-03عديد السكاريد المحايد ، شديد التفرع ، عالي الكتلة ، محب للماء في محلول للطرد المركزي الكثافة
DPBS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيومThermo Fischer Scientific14190-094RT
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x ، سائل (جلوكوز عالي)GIBCO ، مجسات جزيئية31966-021محفوظة عند 4 درجات ؛ C ; لثقافة خلايا HEK
RPMI 1640 المتوسطة GLUTAMAX   ؛ تقنيات الحياة التكميلية61870-010محفوظة عند 4 درجات ؛ C; لثقافة hMDMs
F&oelig ؛ مصل تال للعجل (FCS) EurobioCVFSVF0001محفوظة عند -20 درجة ؛ C ; البنسلين
الستربتومايسين غير المكتمل (10,000 وحدة / مل)ثيرمو فيشر العلمي15140-122محفوظ عند -20 درجة ؛ C ; لثقافة hMDMs
RPMI 1640 متوسطة ، بدون أحمر فينول (10x 500 مل) تقنياتالحياة11835-105دافئة في 37 درجة ؛ حمام مائي C قبل الاستخدام ؛ لمقايسة البلعمة
FuGENE6 كاشف التعداءPromegaE2692المحفوظ عند 4 درجة ؛ C ; للإنتاج الفيروسي
خلايا الدم الحمراء للأغنام (SRBCs) EurobioDSGMTN00-0Qمحفوظة في Alsever buffer عند 4 & درجات; C قبل الاستخدام
خلايا الدم الحمراء المضادة للأغنام IgGMP Biomedicals55806محفوظة عند 4 درجة ؛ C
مصل البقر الألبومين كسر الصدمة الحرارية ، درجة الحموضة 7 ، & ge ؛ 98٪ سيجماA7906محفوظة عند -20 درجة ؛ C
المجهر المقلوب DMI600البؤر Leica
  CSU-X1M1يوكوجاوا
491 نانومتر 50 ميغاواط ليزرCOBOLT CALYPSO
HCX PL APO CS ObjectifLeicaعدسة موضوعية ; التكبير 100X ; الفتحة العددية 1.40 ; زيت الغمر
CoolSnap HQ2 (FireWire) كاميراالقياساتحجم البكسل 6.45 & م × 6.45 وميكرو ؛ m ; التعريف 1,392 × 1,040 ; ترميز الصورة في برنامج 14 بت
Metamorph 7.7.5الجزيئيةللتحكم في المجهر
GraphPad Prismلتحليل الإحصاء
وحدة قرص الغزل متحد الضوئية الأجهزة برنامج

المراجع

  1. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
  2. Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
  3. Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. A role for microtubule dynamics in phagosome movement. J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).
  4. Blocker, A., et al. Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules. J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).
  5. Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
  6. Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa. Lancet. 379, 2489-2499 (2012).
  7. Mazzolini, J., et al. Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments. Blood. 115, 4226-4236 (2010).
  8. Dumas, A., et al. The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking. J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).
  9. Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages. J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).
  10. Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies. J Virol. 86, 2826-2836 (2012).
  11. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).
  12. Wei, X., et al. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
  13. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).
  14. Toyohara, A., Inaba, K. Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

HIV 1 GFP Z
يبلوع الهجرة والسرعة تقاس في لايف الابتدائية الضامة الإنسان المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.