مقالة منهجية

قياس ل في المختبر التكامل آخر من HIV-1 Preintegration مجمعات

DOI:

10.3791/54581

⸱

فبراير 22, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Center for AIDS Health Disparities Research, Meharry Medical College, 2Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3School of Graduate Studies and Research, Meharry Medical College, 4Department of Microbiology and Immunology, Meharry Medical College, 5Tennessee Center for AIDS Research (TN-CFAR), Meharry Medical College

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا التقرير مقايسة في المختبر لقياس نشاط التكامل المرتبط بمركب ما قبل الاندماج (PIC) المرتبط بمركب فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) في المستخلصات السيتوبلازمية للخلايا المصابة بشكل حاد. يتم قياس دمج الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية -1 المرتبط بالموافقة المسبقة عن علم في الحمض النووي المستهدف غير المتجانس باستخدام استراتيجية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتينات HIV-1 مغلف الانخراط مستقبلات المشابهة على سطح الخلية المستهدفة، الأمر الذي يؤدي إلى الخلية الفيروسية الانصهار غشاء يليها الافراج عن جوهر قفيصة الفيروسية (CA) في السيتوبلازم. وفي وقت لاحق، والناسخ العكسي الفيروسي (RT)، كجزء من تحمل الاسم نفسه البروتين النووي مجمع يسمى النسخ العكسي مجمع (RTC)، يحول الفيروسي RNA الجينوم واحد الذين تقطعت بهم السبل في نسخة الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (vDNA). وهذا يؤدي إلى نشوء حيوي من مجمع البروتين النووي أخرى، ووصف المجمع قبل التكامل (PIC)، ويتألف من vDNA والبروتينات فيروس المرتبطة بها والعوامل المضيفة. وإنزيم مدمج الفيروسي المرتبطة الموافقة المسبقة عن علم (IN) ينسق دمج vDNA في الحمض النووي الصبغي المضيفة في عملية من خطوتين ينظم زمنيا ومكانيا. أولا، في عمليات ينتهي 3 'من vDNA في السيتوبلازم، وثانيا، بعد بالاتجار الموافقة المسبقة عن علم إلى النواة، فإنه يتوسط دمج vDNA معالجتها في الحمض النووي الصبغي. بلدان جزر المحيط الهادئ معزولةمن الخلايا المستهدفة المصابة تماما مع HIV-1 وظيفية في المختبر، كما أنها مؤهلة لدمج vDNA يرتبط إلى الحمض النووي الهدف مغاير وأضاف خارجيا. وقد ساهمت في فحوصات المختبر التكامل هذه على أساس الموافقة المسبقة عن علم كبير لترسيم تفاصيل الآلية التكامل للفيروسات، وإلى اكتشاف في مثبطات. في هذا التقرير، إلا أننا الإفاضة محدث HIV-1 فحص الموافقة المسبقة عن علم أن يوظف استراتيجية تستند في عملها متداخلة في الوقت الحقيقي البلمرة الكمية سلسلة من ردود الفعل (QPCR) لقياس النشاط في المختبر التكامل بين بلدان جزر المحيط الهادئ الأم معزولة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HIV-1 تكرارها في الخلية المستهدفة ينطوي على خطوات متعددة، مجمعة على نطاق واسع إلى مرحلتين: الأحداث المبكرة والمتأخرة. تبدأ الأحداث في وقت مبكر عندما يتحد HIV-1 بالتتابع لمستقبلات سطح الخلية المستهدفة CD4 واحد من اثنين شارك في مستقبلات (CCR5 أو CXCR4) 1. وبالتالي، فإن الأغشية فتيل الفيروس الخلية، وقفيصة الفيروسية يتم تحريرها (CA) الأساسية في سيتوبلازم 2. يحتوي لب CA الحمض النووي الريبي الفيروسي الجيني واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssRNA) والعديد من البروتينات، سواء الفيروسية والخلوية في الأصل. وتشمل البروتينات الفيروسية المرتبطة CA الناسخ العكسي (RT) وإنزيم مدمج (IN)، اثنين من الانزيمات التي تتوسط خطوات حاسمة خلال الأحداث في وقت مبكر في تكاثر الفيروس. وRT وفي وظيفة في إطار مجمعات البروتين النووي، وهي عكس النسخ مجمع (RTC) ومجمع ما قبل الاندماج (PIC)، على التوالي 3، 4، 5 <سوب>، 6. نهايات الفيروسي ssRNA الجينوم محطة ميناء تكرار (R) عناصر المتاخمة للتسلسل U5 فريد (في 5 'النهاية) و U3 (في 3' نهاية). وRTC يحول الجينوم الفيروسي ssRNA إلى المزدوج تقطعت بهم السبل (س) والحمض النووي نسخة (vDNA). النتائج هذه العملية النسخ العكسي أيضا في ازدواجية U5 وU3 متواليات، وبالتالي توليد يكرر محطة الطويلة (LTR) في كلا طرفي vDNA 7 و 8. وفي وقت لاحق، وفي المصاحب الموافقة المسبقة عن علم يحفز اثنين من التفاعلات الكيميائية الحيوية متسلسلة التي تمكن من دمج vDNA في كروموسوم المضيف 9 و 10 و 11. أولا، في السيتوبلازم، في multimers إشراك كلا لتر 12 و يلتصق على ثنائي النوكليوتيد من كل من طرفي 3'-الطرفية. هذه المعالجة 3'نهاية يولد مجموعة الهيدروكسيل في كل نهاية 3'(CA OH) من vDNA.بعد ذلك، الموافقة المسبقة عن علم بالاتجار إلى النواة، حيث يستخدم في vDNA CA OH كما نيوكليوفيل لخفض كل من خيوط من الحمض النووي الصبغي بطريقة متداخلة. في وقت واحد، في التوصيلات coordinately طرفي vDNA لينتج عن ذلك من السندات phosphodiester على مسارات المقابل من الحمض النووي الصبغي. وبعد هذه الخطوة نقل حبلا، آلية الخلية المضيفة يزيل اثنين من النيوكليوتيدات المفردة في نهايات 5 'من vDNA وإصلاح الثغرات واحدة الذين تقطعت بهم السبل التي تلت ذلك عند تقاطع للموقع التكامل. وبالتالي بداية أحداث ذروتها مع إنشاء نسخة الحمض النووي المتكاملة (طليعة الفيروس) للجينوم HIV-1. تقدم طليعة الفيروس بيئة مناسبة للتعبير الجين الفيروسي كفاءة، الذي يبدأ أحداث لاحقة، بما في ذلك التعبير من البروتينات المشفرة فيروس. التجمع من الفيروس غير ناضجة. ومهدها، وإطلاق سراح، والنضج في virions المعدية (13).

المنقى المؤتلف في فيروسات هو المختص لتنفيذ، في المختبر، كلا تجهيز ونقل حبلا الأنشطة 3'نهاية يوم خارجيا تزويد LTR مثل الركيزة الحمض النووي. وقد كشفت الدراسات البيوكيميائية باستخدام هذا في المؤتلف النقي الجوانب الهامة من vDNA التكامل 14، 15، 16، 17. ومع ذلك، خلافا لما حدث في العدوى الطبيعية، وهذا في المختبر رد فعل كيميائي حيوي لا يدعم التكامل متضافرة من طرفي DNA الركيزة في الحمض النووي الهدف. في المقابل، بلدان جزر المحيط الهادئ فيروسات المعزولة من الخلايا المصابة تماما تدمج بشكل منسق طرفي vDNA الذاتية إلى مغاير DNA الهدف. وأدى ذلك إلى اعتماد واسع النطاق والتحسينات اللاحقة من أنا ن المختبر التكامل (IVI) فحوصات باستخدام بلدان جزر المحيط الهادئ الأم معزولة.

في أول ذكرت فيروسات IVI فحص وعصائر هيولية من الخلايا المصابة مع الفئران المؤتلففيروس ابيضاض الدم (MLV) ايواء الجين كولاي supF في LTR لها بمثابة مصدر النشاط في، والحمض النووي لفج امدا متحولة تم تزويد خلل في النمو التحللي خارجيا كما الحمض النووي الهدف. التكامل الناجح لالمؤتلف MLV الحمض النووي نسخ في الحمض النووي فج وأدى التعبير التي تلت ذلك supF لاستعادة القدرة على تشكيل اللوحة التذكارية للفاجات المؤتلف. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية التجريبية هو التكامل شاقة والتدابير بطريقة غير مباشرة. لمعالجة مثل هذه المحاذير، وضعت على أساس صمة عار الجنوبي غير مباشر نهاية الوسم الفحص، التي تحدد حجم النشاط IVI المرتبطة الموافقة المسبقة عن علم كإجراء من vDNA الذاتية دمجها الخارجية الجراثيم خطي phiX174 الحمض النووي، 6، 7، 18. رغم أن هذا الأسلوب يوفر مقياسا مباشرا لأحداث التكامل، هناك حاجة إلى كميات عالية نسبيا من إعداد الموافقة المسبقة عن علم، التي ما زالت تشكل تحديا تقنياتسعى. للتحايل على هذا، وقد وضعت المتداخلة المقايسات PCR القائم تتطلب كميات محدودة فقط من بلدان جزر المحيط الهادئ 4 و 5 و 19.

في هذا التقرير، وصفنا نسخة محدثة من مقرها-PCR متداخلة في طريقة المختبر وضعت لتلخيص النشاط التكامل بوساطة PIC-HIV-1 التي تحدث أثناء العدوى الطبيعية. يستخدم هذا الأسلوب مقتطفات هيولية من الخلايا المستهدفة المصابة HIV-1 كمصدر من النشاط الذاتية الموافقة المسبقة عن علم، التي تقاس في الوقت الحقيقي البلمرة الكمية سلسلة من ردود الفعل (QPCR). يتم تكييفها إجراءات عزل بلدان جزر المحيط الهادئ وقياس الأنشطة إدماجهم، مع بعض التعديلات، من البروتوكولات نشرت من قبل المختبر Engelman 20. في هذه الطريقة، يتم بدء النشاط التكامل المرتبط الموافقة المسبقة عن علم من خلال توفير هدفا الحمض النووي الخطية دخيلة 21، والمنتجات الحمض النووي الناجم عنويتم تنقية هذا التفاعل التكامل وتستخدم كمادة أولية لالكمي PCR القائم لاحق. في الجولة الأولى PCR التقليدية، وتتضخم الوصلات الحمض النووي الفيروسي الهدف باستخدام بادئات المناسبة. في الدور الثاني QPCR، وتستخدم بادئات LTR محددة لإثراء تحديدا السكان vDNA من الجولة الاولى المنتجات PCR. الرجاء مراجعة القسم بروتوكول للحصول على وصف مفصل لهذا الأسلوب.

في الدراسات المختبرية مع بلدان جزر المحيط الهادئ فيروسات أدت إلى تقدم كبير في فهمنا لآلية التكامل الحمض النووي للفيروسات، وفي تطوير مثبطات IN. وبناء على زيادة التركيز مؤخرا على مواقع التكامل رسم الخرائط HIV-1، وتحديد دور العوامل الفيروسية والمضيف في HIV-1 التكامل، وتطوير الأدوية المضادة للفيروسات جديدة نحو مكافحة مقاومة الأدوية، نتصور اهتماما متزايدا في والاستخدام الواسع النطاق للIVI المقايسات ، مثل تلك المذكورة في هذا التقرير. وهذا، بدوره، يؤدي إلىالتحسينات المستقبلية في طريقة، وبالتالي تنويع نطاق تطبيقاتها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإنتاج 1. الفيروسات

ملاحظة: لتوليد التتر عالية من العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية 1، transfect خط الخلية الجنينية البشرية الكلى (كلوة) 293T مع المعدية HIV-1 استنساخ الجزيئي باستخدام تنشيط القائمة على dendrimer ترنسفكأيشن الكاشف. وقد لوحظ أن الأسلوب فوسفات الكالسيوم ترنسفكأيشن تؤدي إلى نتائج مماثلة.

  1. في مختبر السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2)، والبذور 3 × 10 6 293T الخلايا في صحن 10 سم في 8 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) والبنسلين، والستربتومايسين. ثقافة الخلايا في مجموعة حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 O / N.
  2. في اليوم التالي، لtransfecting الخلايا في كل طبق 10 سم، وتمييع 8 ميكروغرام من pNL4-3 DNA البلازميد (انظر المواد الجدول) إلى الحجم النهائي من 300 ميكرولتر من DMEM تفتقر الدم والمضادات الحيوية. إضافة 80 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن، وتخلط جيدا من قبل pipetting، واحتضانها في RT ل5-10 دقيقة لترنسفكأيشن تشكيل تعقيدا.
  3. إزالة المتوسطة من الأطباق التي كتبها طموح وإضافة 7 مل لكل طبق من DMEM الطازجة التي تحتوي على مصل الدم والمضادات الحيوية.
  4. إضافة 1 مل من DMEM تحتوي على مصل الدم والمضادات الحيوية لمجمع ترنسفكأيشن، مزيج من قبل pipetting، وإضافة هذا الخليط إلى الخلايا. دوامة بلطف الطبق لتسهيل حتى توزيع المجمعات ترنسفكأيشن.
  5. على الفور نقل الخلايا إلى المختبر BSL3، مكان في مجموعة حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، وثقافة الخلايا لمدة 48 ساعة.
  6. جمع زراعة الأنسجة طاف التي تحتوي على الفيروس باستخدام ماصة ومن ثم نقلها إلى أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه والحطام، ومن ثم تصفية طاف من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرون مسام الحجم.
  7. للقضاء على أي DNA البلازميد المرحل في هذا الإعداد الفيروس خالية من الخلايا، وعلاج مع الدناز 1 (20 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  8. لتحديدHIV-1 عيار، استخدم-P24 محددة انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA)، كما هو طريقة سريعة وقابلة للاستخدام الروتيني 22.
    ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن P24 ELISA يقيس عيار البدني (عدد جزيئات الفيروس). بدلا من ذلك، وقياس النشاط المرتبط بفيروس RT (خارجي RT فحص) أو العدوى بفيروس (المقايسات العدوى على أساس خط خلايا مؤشر تزم BL) ستقدم قراءات حصرية من جزيئات الفيروس المعدية.

2. عدوى فيروس من الخلايا سوب-T1 (BSL3 مختبر)

  1. في المختبر BSL2، والحفاظ على خلايا سوب-T1 بين 1.0 × 10 6 و 2.0 × 10 6 خلية / مل في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) متوسطة تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطل FBS والبنسلين، والستربتومايسين (نسبة الانقسام من 1 : 2 كل 2-3 د). تجميع الخلايا سوب-T1 من قوارير الثقافة، وتخلط جيدا من قبل pipetting، وتحديد عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات والأزرق الاستبعاد التريبان الواحدaining الأسلوب.
    1. إعداد العدد المطلوب من aliquots من 80 × 10 6 خلايا (لكل عدوى فيروس) في 50 مل أنابيب مخروطية أجهزة الطرد المركزي.
    2. الطرد المركزي الخلايا في الدوار يتأرجح دلو في 500 x ج و 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. دون إزالة مستنبت الخلية، ونقل الأنابيب التي تحتوي على الخلايا مكعبات إلى المختبر BSL3 لمزيد من المعالجة. بعناية نضح مستنبت خلية من الأنبوب من دون إزعاج بيليه الخلية.
  2. إضافة كمية مناسبة من اللقاح فيروس تعامل I-الدناز إلى الخلايا في الأنبوب وتخلط جيدا من قبل pipetting لطيف. 80 × 10 6 خلايا، استخدم 30 مل من فيروس تعامل I-الدناز (50 ميكروغرام من فيروس P24 ما يعادلها).
    ملاحظة: عزل بلدان جزر المحيط الهادئ وظيفية يتطلب يصيب الخلايا المستهدفة مع مولتيبليكيتييس عالية جدا من العدوى (وزارة الداخلية).
  3. توزيع الخليط بالتساوي بين اثنين من لوحات زراعة الأنسجة 6-جيدا (أي 12 قسامات × 2.5 مل، واستخدام لوحات 2 في تصيبأيون).
  4. لspinoculation، ووضع لوحات ثقافة في ناقلات لوحة وأجهزة الطرد المركزي باستخدام الدوار دلو يتأرجح في 480 x ج و 25 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  5. احتضان الخلايا spinoculated عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 5 ساعات.

3. حصاد وتحلل الخلايا المصابة (BSL3 مختبر)

  1. تجميع الخلايا المقابلة لكل العدوى من لوحات الثقافة في مل أنبوب مخروطي 50 أجهزة الطرد المركزي (~ 30 مل في المجموع).
  2. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. نضح بعناية طاف من الأنبوب (بدلا من ذلك، استخدم ماصة).
  3. لإزالة أي جزيئات فيروسية المتبقية، ويغسل كل بيليه الخلية بإضافة 2 مل من العازلة K - / - (150 ملي بوكل، 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.6 و 5 ملي MgCl 2) والطرد المركزي العينة في 300 x ج و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم، من دون إزعاج بيليه، وإزالة بعناية طاف بواسطة الشفط أو باستخدام ماصة.
  4. Repeaر خطوة 3.3.
  5. بعناية إزالة أي العازلة المتبقية التي كتبها باستخدام micropipette. resuspend كل بيليه خلية في 2 مل من الجليد الباردة العازلة تحلل K + / + (الاحتياطي K - / - تستكمل مع 0.025٪ ديجيتونين، 1 ملم DTT و 20 ميكروغرام / مل أبروتينين)، خلط محتويات طيف من قبل pipetting، ونقل إلى 2 مل أنبوب microcentrifuge.

4. إعداد بلدان جزر المحيط الهادئ حشوية (BSL3 مختبر)

  1. صخرة العينات على شاكر دوارة في RT لمدة 10 دقيقة.
  2. الطرد المركزي العينات، مع الدوار precooled إلى 4 درجات مئوية، في 1500 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 4 دقائق.
  3. من دون إزعاج بيليه، ونقل بعناية طاف لأنبوب microcentrifuge الطازجة وأجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 1 دقيقة.
  4. نقل بعناية طاف لأنبوب microcentrifuge الطازجة. إضافة ريبونوكلياز ألف (20 ملغ / مل) إلى تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل (2 ميكرولتر لمدة 2 مل من بلدان جزر المحيط الهادئ)، واحتضان محتويات في RT لمدة 30 دقيقة (أي هزاز).
  5. إضافة السكروز (60٪ ث / ت في المخزن K - / -) لتركيز النهائي من 7٪ وتخلط جيدا من قبل pipetting لطيف. إعداد قسامات (على سبيل المثال، 200 ميكرولتر) من بلدان جزر المحيط الهادئ في أنابيب microcentrifuge، ومضة التجميد في النيتروجين السائل، ومكان في الفريزر -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

5. في المختبر التكامل (IVI) فحوصات عن طريق HIV-1 بلدان جزر المحيط الهادئ

  1. تحضير الحمض النووي الهدف المستخدمة في فحص IVI عن طريق تضخيم منطقة 2.0 كيلو بايت من DNA البلازميد phiX174 مع PCR باستخدام بادئات حسب الطلب، phiX174-F وphiX174-R.
    1. تجميع خليط PCR كما هو موضح في الجدول رقم 1. أداء PCR في cycler الحرارية باستخدام الظروف الدراجات الحرارية الموصى بها في الجدول 2. هلام تنقية المنتج PCR باستخدام طقم تنقية هلام (بعد بروتوكول الموصى بها من الشركة المصنعة)، وتخزين الحمض النووي الهدف النقي كما aliquots في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. إضافة 600 نانوغرام من الحمض النووي المستهدف إلى 200 - & #181، L قسامة من بلدان جزر المحيط الهادئ، وتخلط جيدا، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
    ملاحظة: ينصح ردود الفعل IVI حذف الحمض النووي الهدف أو بما في ذلك مثبطات إنزيم مدمج (على سبيل المثال، Raltegravir) ردود الفعل السيطرة.
  3. وقف رد فعل IVI بإضافة SDS، EDTA، وبروتين كاف لتركيزات النهائي من 0.5٪ و 8 ملم، و 0.5 ملغ / مل على التوالي. خلط محتويات رد فعل جيدا واحتضان بين عشية وضحاها في 56 درجة مئوية.
  4. في اليوم التالي، وتنقية الحمض النووي الكلي من رد فعل IVI من الفينول استخراج / الكلوروفورم وهطول الأمطار الايثانول. تنفيذ جميع الخطوات الطرد المركزي في 16000 x ج وRT.
  5. إضافة حجم مساو من الفينول على عينة deproteinized، مزيج بقوة من قبل vortexing، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة. إزالة بعناية المرحلة المائية العليا وتحويلها إلى أنبوب جديد.
  6. كرر الخطوة 5.5. نقل المرحلة المائية العليا لأنبوب جديد.
  7. إضافة حجم مساو من 1: 1 الفينول: مزيج الكلوروفورم، ومزيج بقوة من قبل vortexing، وأجهزة الطرد المركزي FO ص 2 دقيقة. نقل المرحلة المائية العليا لأنبوب جديد.
  8. إضافة حجم مساو من كلوروفورم، مزيج بقوة من قبل vortexing، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة. نقل المرحلة المائية العليا لأنبوب جديد.
  9. لترسيب الحمض النووي، إضافة الجليكوجين إلى تركيز النهائي من 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر و 3 M من خلات الصوديوم إلى تركيز النهائي من 0.3 م و 2.5 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪ (كريم الباردة). دوامة لخلط، لفترة وجيزة أجهزة الطرد المركزي لجمع محتويات، ووضع أنبوب في -80 درجة CO / N.
  10. في اليوم التالي، الطرد المركزي العينة لمدة 30 دقيقة في 16000 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
  11. إضافة 500 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول (المثلج) لبيليه وأجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. الهواء الجاف بيليه الحمض النووي في RT و resuspend بدقة في 50 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه. تخزين عينات من الحمض النووي في -20 درجة مئوية.

6. PCR فحوصات لقياس الموافقة المسبقة عن علم آخر

= "jove_content"> ملاحظة: عدد نسخة من HIV-1 الحمض النووي دمجها في الحمض النووي الهدف وكميا من خلال استراتيجية PCR المتداخلة التي توظف 2 مجموعات من الاشعال و2 جولات متتابعة من PCR.

  1. إجراء الجولة الأولى PCR التقليدية باستخدام بادئات استهداف LTR الفيروسي وphiX174 الحمض النووي (LTR وphiX174 الاشعال، على التوالي) لتضخيم تقاطعات من HIV-1 الحمض النووي المتكاملة.
    1. تجميع الجولة الأولى-PCR خليط كما هو موضح في الجدول رقم 3. تجميع مزيج الرئيسي لجميع المكونات باستثناء قالب الحمض النووي، الاستغناء قسامات 45 ميكرولتر في أنابيب PCR منفصلة، ​​وإضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي القالب أو nuclease خالية من المياه (السيطرة).
    2. أداء PCR في cycler الحرارية باستخدام الظروف الدراجات الحرارية الموصى بها في الجدول 4.
  2. إجراء الجولة الثانية QPCR باستخدام بادئات التي تكتنف المنطقة قصيرة من LTR الفيروسي (LTR-R والاشعال LTR-U) لتضخيم انتقائي تسلسل vDNA متكاملة من رو الأولمنتجات اوند PCR. لتحديد vDNA متكاملة نسخ الأرقام، وتوليد منحنى قياسي باستخدام 10X التخفيفات المسلسل من الأرقام نسخة المعروف (على سبيل المثال، 10 0-10 8) من استنساخ الجزيئي HIV-1.
    1. تجميع الجولة الثانية QPCR خليط كما هو موضح في الجدول رقم 5. تجميع مزيج الرئيسي لجميع المكونات باستثناء قالب الحمض النووي، بعناية الاستغناء عن 25 مكل إلى العدد المناسب من الآبار في جيدا 96 PCR لوحة رد فعل، ثم قم بإضافة 5 ميكرولتر من الدور الاول غير المكرر، المنتجات PCR أو nuclease خالية من المياه (مراقبة). أداء جميع ردود الفعل QPCR في ثلاث نسخ.
    2. تحميل لوحة PCR في الوقت الحقيقي PCR الصك وأداء QPCR باستخدام الظروف الدراجات الموصى بها في الجدول 6.
    3. تحليل البيانات باستخدام البرمجيات المناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل HIV-1 بلدان جزر المحيط الهادئ

ويصور رسم تخطيطي للبروتوكول يستخدم لعزل HIV-1 بلدان جزر المحيط الهادئ من خلايا سوب-T1 المصابة تماما في الشكل 1. ويستمد هذا البروتوكول من الأساليب التي وصفها Engelman وآخرون. 19، 20. HIV-1 بلدان جزر المحيط الهادئ هي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وفرت التحليلات الكيميائية الحيوية من بلدان جزر المحيط الهادئ فيروسات الأفكار الهامة في آلية التكامل الحمض النووي للفيروسات. قياس النشاط التكامل بين بلدان جزر المحيط الهادئ فيروسات يمكن تحقيق ذلك عن طريق فحص اللوحة تشكيل، تحليل الجنوبي لطخة، ومتداخلة QPCR. الاستراتيجية التجريبية لفحص اللوحة هي شاقة وتستخدم وسيلة غير مباشرة لقياس التكامل 6 و 7 و 18. جنوب القائم على لطخة التكامل فحوصات ق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أي المصالح المالية وغير المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم هذا العمل جزئيا من خلال منح DA024558، DA30896، DA033892، وDA021471 من المعهد الوطني / المعاهد الوطنية للصحة لمؤتمر نزع السلاح. ونحن نعترف أيضا منحة G12MD007586 RCMI، فاندربيلت CTSA منح UL1RR024975، مركز بحوث بالحركة ميهاري (MeTRC) CTSA منحة U54 RR026140 من NCRR / المعاهد الوطنية للصحة، وMD007593 منحة U54 من NIMHD / المعاهد الوطنية للصحة، وتينيسي CFAR منحة P30 AI110527.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<ص>مصل الأبقار الجنينية (FBS) <ص>جيبكو/إنفيتروجين <ص>10437-028
<ص>مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة (Hi-FBS) <ص>جيبكو/إنفيتروجين <ص>10438-026
<ص>دولبيكو' s النسر المعدل ق متوسط (DMEM) < / ص > < ص >< ص > < ص > جيبكو / إنفيتروجين < / ص > < ص > 11995-065 < / ص >
< ص > معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 متوسط < / ص > < ص > جيبكو / إنفيتروجين < / ص > < ص > 11875-093 < / ص >
< ص > محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (1x) < / ص > < ص > جيبكو / إنفيتروجين < / ص > < ص>20012-027< / ص>
< ص > التربسين EDTA (0.25٪) < / ص > < ص >< / ص > < ص > جيبكو / إنفيتروجين < / ص > < ص > 25200-056 < / ص >
< ص > البنسلين - الستربتومايسين (100 ضعف) < / ص > < ص > سيلجرو / ميدياتك < / ص > < ص > 30-002-CI < / ص >
< ص >HEK293T (293T) < / ص> < ص>مجموعة الثقافة الأمريكية من النوع (ATCC) < / ص >< > CRL-3216 < / ص >
< ص > HIV-1 استنساخ جزيئي فيروسي pNL4-3 < / ص > < ص>برنامج أبحاث الكاشف المرجعي لمرض الإيدز < / ص > < ص >< ص > < ص > 114 < / ص
< ص > كاشف تعداء PolyFect < / ص > < ص > Qiagen < / ص > < ص>301107< / ص >
< ص > DNase 1 < / p > < p >< p > < p> Calbiochem / Merckmillipore < / p > < p >260913< / p >
< p>Sup-T1 < / p > < p> مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (ATCC) < / p> < p> CRL-1942 < p>

< / p>

HEPES الرقم الهيدروجيني 7.2 - 7.5 < / ص> < ص> (محلول جاهز للاستخدام)< / ع>

 < ص>جيبكو / إنفيتروجين < ص>15630-080 <
ص>محلول كلوريد البوتاسيوم (KCl) <ص>سيجما ألدريتش< 0 / ص > < ص > 60142 < / ص >
< ص > محلول كلوريد المغنيسيوم (MgCl < sub > 2 < / sub >) < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص > M1028 < / ص>
<ص>ديثيوثريتول (DTT) <ص>سيجما ألدريتش <ص>43815
<ص>أبروتينين <ص>سيجما ألدريت<ش 8 / ص > < ص > A6106 < / ص >
< ص > ديجيتونين < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص > D141 < / ص >
< ص > RNase < / ص>

Invitrogen< / p>

12091-021< / p>

Sucrose< / p>

Sigma-Aldrich< / p>

S0389< / p>

phiX174 شكل التكرار 1 DNA< / p>

Promega< / p>

D1531< / p>

PhiX174-F التمهيدي: < / u>< / p>

5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' < / p>

< / p>

PhiX174-R التمهيدي: < / u>< / p>

5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' < ص > < ص >< ص > < ص >< ص >

< ص > فيتروجين و / أو IDT-DNA < / ص > < ص >< / ص >
< ص > dNTP مزيج < / ص > < ص > بروميجا < / ص >< ص > U1515 < / ص >
< ص > جو طاق DNA بوليميراز < / ص > < ص > بروميجا < / ص > < ص > M3005 < / ع>
< ص>Qiaquick هلام استخلاص الطقم < / ع>

Qiagen< / p>

28706< / p>

الماء المقطر فائق النقاء< / p>

Invitrogen< / p>

10977-015< / p>

Tris-EDTA (TE) العازلة (100x)< / p>

Sigma-Aldrich< / p>

T9285< / p>

< ص>كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص > L3771 < / ص >
< ص > حمض رباعي أسيتيك إيثيلين ديامين ، محلول ملح ثنائي الصوديوم (EDTA) ، 0.5 م ، درجة الحموضة 8.0 < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص > E7889 < / ص
> بروتيناز ك (20 مجم / مل محلول جاهز للاستخدام) < / ص > < ص > كياجين < / ص >

19131< / p>

Phenol (متوازن مع 10 & nbsp ؛ mM تريس حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني   ؛ 8.0 و 1  ملي مولار EDTA) < / ص >

< ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص > P4557 < / ص >
< ص > الكلوروفورم < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص >288306< / ص >
< ص > الجليكوجين (محلول 5 مجم / مل) < / ص > < ص > أمبيون / إنفيتروجين < / ص > < ص > AM9510 < / ص >
< ص >أسيتات الصوديوم (3 م ، الرقم الهيدروجيني 5.2) < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص >< ص > S7899 < / ص >
< ص > الإيثانول < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص > E7023 < / ص >
< ص >< > الجولة الأولى LTR التمهيدي < / u >: < / ص > < ص > 5'-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3' < / p>

الجولة الأولى phiX174 التمهيدي< / u>: < / p>

5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' < / ص >

 < ص > Invitrogen و / أو IDT-DNA < / p > < p >---< / p >
< p> الجولة الثانية LTR-R التمهيدي < / u >: < / p > < p > 5 '-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' < / ص > < ص >< > الجولة الثانية LTR-U التمهيدي < / u >: < / p > < p > 5 '-CTGACTAAAAAGGTCTGAGG-3' < / p>

< / p>

الجولة الثانية مسبار Taqman< / u>:< / p>

  5'-6- FAM / TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC< / p>

CTTGAGTGC / 6-TAMRA / -3 ' < / ص >

 < ص > فيتروجين و / أو IDT-DNA < / ص > < ص >---< / ص >
< ص >iQ Supermix < / ص > < ص > راد حيوي < / ص > < > 170-8862 < / ص>
> <>

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor. Cell. 52 (5), 631-633 (1988).
  2. Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. Molecular mechanisms of HIV entry. Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).
  3. Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).
  4. Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).
  5. Hansen, M. S., Smith, G. J. 3rd, Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro. Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).
  6. Farnet, C. M., Haseltine, W. A. Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro. Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).
  7. Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54 (4), 497-504 (1988).
  8. Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Correct integration of retroviral DNA in vitro. Cell. 49 (3), 347-356 (1987).
  9. Lewinski, M. K., Bushman, F. D. Retroviral DNA integration--mechanism and consequences. Adv Genet. 55, 147-181 (2005).
  10. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
  11. Goff, S. P. Genetics of retroviral integration. Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).
  12. Panganiban, A. T., Temin, H. M. The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production. Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).
  13. Bieniasz, P. D. The cell biology of HIV-1 virion genesis. Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).
  14. Sherman, P. A., Fyfe, J. A. Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity. Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).
  15. Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration. J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).
  16. Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. A rapid in vitro assay for HIV DNA integration. Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).
  17. Bushman, F. D., Craigie, R. Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA. Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).
  18. Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179 (2), 886-889 (1990).
  19. Engelman, A. Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes. Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).
  20. Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes. Methods. 47 (4), 283-290 (2009).
  21. Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients. J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).
  22. Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12 (4), 288-293 (1997).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

1 SupT1

مقالات ذات صلة