مقالة منهجية

تبوغ الفعال لل خميرة الخباز في تنسيق Multiwell 96

DOI:

10.3791/54584

⸱

سبتمبر 17, 2016

 , 
1Department of Biology, University of Massachusetts Boston

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم إجراء إبواغ خميرة الخميرة بتنسيق 96 متعدد الآبار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال أوقات الإجهاد الغذائي ، تخضع خميرة الخميرة للكونين الأمشاجي ، والمعروف باسم الأبواغ. ستبدأ خلايا الخميرة ثنائية الصبغيات التي يتم تجويعاها للنيتروجين والكربون عملية التبواغ. تتضمن عملية التبوغ الانقسام الاختزالي متبوعا بتكوين الأبواغ ، حيث يتم تعبئة النوى أحادية الصيغة الصبغية في جراثيم مقاومة للبيئة. لقد طورنا طرقا للتبواغ الفعالة للخميرة الناشئة في 96 لوحة متعددة الآبار ، لزيادة إنتاجية خلايا الخميرة الغربلة للأنماط الظاهرية للأبواغ. تتوافق هذه الطرق مع الفحص باستخدام الخميرة المحتوية على البلازميدات التي تتطلب الاختيار الغذائي ، عند استخدام الحد الأدنى من الوسائط المناسبة ، أو مع فحص الخميرة مع التعديلات الجينومية ، عند استخدام نظام غني بالإسبوغ. وجدنا أنه بالنسبة لهذه الطريقة ، يعد التهوية أثناء التبوغ أمرا بالغ الأهمية لتكوين الأبواغ ، وقد ابتكرنا تقنيات لضمان تهوية كافية متوافقة مع تنسيق الألواح متعددة الآبار 96. على الرغم من أن هذه الطرق لا تحقق المستوى النموذجي ~ 80٪ من التبواغ الذي يمكن تحقيقه في التجارب القائمة على القارورة ذات الحجم الكبير ، إلا أن هذه الطرق ستحقق بشكل موثوق حوالي 50-60٪ من التبوغ في الألواح متعددة الآبار صغيرة الحجم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد درس تبوغ في الخميرة في مهدها لتقديم رؤى في جوانب كثيرة من الأحياء، بما في ذلك السيطرة على الفصل كروموسوم أثناء الانقسام الاختزالي 1، آليات إعادة التركيب الجيني 2، والسيطرة على التنمية من خلال خلية يشير 3، ومراقبة التغذية التنمية 4، والنسخي تنظيم التنمية 5، والنظر في تشكيل بوغ 6. يتضمن تشكيل بوغ حدث انقسام الخلايا رواية تنطوي على تشكيل المقصورات غشاء جديدة داخل الخلية الأم تليها ترسب جدار بوغ واقية 6. هذه الدراسات أن دراسة الخلايا sporulating في كثير من الأحيان الاستفادة من sporulating بسرعة الخميرة سلالة SK1، والتي يمكن أن تخضع لعملية تكاثر في حوالي 24 ساعة بطريقة فعالة نسبيا 7،8. وعلى الرغم من وصفت تحسين ظروف تبوغ لفي مهدها الخميرة 13/9، هذه التجربةالصورة فحص تبوغ على وسائل الاعلام الصلبة أو في جو من الثقافات السائل على نطاق وحين ينفذ تبوغ من استخدام أنابيب ثقافة أو قوارير.

نحن هنا تصف طريقة لsporulating الخميرة في شكل لوحة multiwell 96. نجد أن لهذا الأسلوب، تهوية أمر بالغ الأهمية للتبوغ متزامن وكفاءة، وقد ابتكرت تقنيات لضمان تبوغ كافية لصغيرة الحجم شكل multiwell. Sporulating في شكل 96 لوحة multiwell يسمح للخلايا ليتم عرضه باستخدام تقنيات عالية الإنتاجية والكواشف الأمثل لشكل لوحة multiwell، مثل هذا الفحص لالمكثفات نسخة عالية باستخدام مكتبة مزينة بالبلاط 14-16.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الاستعداد للتبوغ

ملاحظة: وسائل الإعلام وصفها في هذا البروتوكول تتم باستخدام وصفات وطرق معيارية 13،17 يعطي الجدول 1 صياغة ل1 لتر من وسائل الإعلام المختلفة المستخدمة في هذا البروتوكول.

Bacto ببتون خلاصة الخميرة Bacto آجار سكر العنب البوتاسيوم خلات الغليسيرول ده 2 O
لوحات YPG 20 ز 10 ز 20 ز - - 30 مل 970 مل
لوحات YPD 20 ز 10 ز 20 ز 20 ز - - 1000 مل
YPD السائل 20 ز 10 ز - 20 ز - - 1000 مل
YPA السائل 20 ز 10 ز - - 20 ز - 1000 مل
وسائل الإعلام تبوغ - - - - 10 ز - 1000 مل

يتم إعطاء صيغ وسائل الإعلام مبالغ ل1 لتر من وسائل الإعلام: الجدول 1. تفاصيل حول وسائل الإعلامالمكونات يمكن العثور عليها في جدول المواد.

  1. إذا جميع خلايا Sporulating سوف يكون التركيب الوراثي نفسه، اتبع هذا الإجراء:
    1. ذوبان الخميرة سلالة لاستخدامها في الصعود إلى (YPGlycerol) لوحة YPG. تنمو الخميرة ل12-16 ساعة عند 30 درجة مئوية. الأهم من ذلك، تستعد خلايا SK1 أيضا إلى sporulate، لذلك سلالات SK1 لا ينبغي أن تترك وقتا طويلا على لوحات YPG، أو أنها قد sporulate على لوحة.
      ملاحظة: يفضل سلالة إذابة حديثا نمت على YPG، والاستفادة من الجلسرين كمصدر الكربون يتطلب الفسفرة التأكسدية، وبالتالي يختار لالخلايا التي تحتوي الحمض النووي وظيفية. خلايا SK1 لديهم ميل لفقدان الحمض النووي وظيفية وتصبح خادمات. وهناك حاجة الحمض النووي وظيفية للتبوغ.
    2. الخميرة متتالية من لوحة YPG الصعود إلى (YPDextrose) لوحة YPD لالمستعمرات واحد. تنمو الخميرة على لوحة YPD 24-28 ساعة عند 30 درجة مئوية.
    3. بعد حوالي 36-48 ساعة من النمو على YPD وسائل الاعلام الصلبة، وبدء 25 مل ثقافة YPD باستخدام مستعمرة واحدةمن لوحة YPD. تنمو هذه الثقافة حتى الخلايا حول OD 600 = 4،0-7،0. تنفيذ هذه الخطوة عند 30 درجة مئوية خلال الليل في حاضنة تهتز، تهتز في 220 دورة في الدقيقة.
    4. من ثقافة YPD، استخدم مبلغ مناسب من الخلايا لبدء 1000 مل من YPA (YPAcetate) الثقافة التي هي OD 600 = 0.1 لكل حاجة 96 لوحة جيدا في القسم 2. تنمو الخميرة في 30 ° C هز حاضنة (اهتزاز في 220 دورة في الدقيقة) حتى ثقافة OD 600 ما بين 1،3-1،5.
      ملاحظة: تطعيم 100 مل من ثقافة YPA لكل لوحة multiwell 96 ليتم عرضه في القسم 2. على سبيل المثال، إذا فحص أربعة 96 لوحات multiwell، ستكون هناك حاجة إلى 400 مل من ثقافة YPA. بدءا من حجم إضافي 10٪ في الثقافة YPA غير الضرورية لحماية ضد فقدان حجم التبخر. عادة، سوف يستغرق ما بين 12-16 ساعة للخلايا للوصول الى OD المناسب 600. مقدار الوقت قد تختلف اعتمادا على التركيب الوراثي لسلالة الخميرة. YPA هو وسائل الإعلام presporulation. Pregrowthفي خلات يساعد لحث على التعبير عن الجينات (مثل IME1) اللازمة لكفاءة ومتزامن تبوغ 6.
    5. تدور في 1800 x ج في أعلى الجدول أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق لتكوير الخلايا المزروعة في YPA. غسل الخلايا 1X مع 0.5 حجم الماء منزوع الأيونات تعقيمها العقيمة. تدور مرة أخرى، وتجاهل يغسل. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام حجم تبوغ 1X. الاستمرار في القسم 2.
  2. في حالة استخدام الخلايا للتبوغ التي هي من المورثات المختلفة، (أي، تحولت مع البلازميدات مختلفة أو تحتوي على الطفرات المختلفة، التي تم الحصول عليها عادة وتخزينها على شكل أسهم المجمدة)، وخلايا مجموعة من التراكيب المختلفة في شكل multiwell 96. ثم اتبع هذا الإجراء:
    1. استخدام معقم عبة Frogger 96 الشق لنقل الخلايا من الأسهم المجمدة المذابة في 96 لوحة multiwell (ق) على YPG وسائل الاعلام الصلبة. تنمو الخميرة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
    2. استخدام معقم عبة Frogger 96 الشق، ونقل الخلايا من YPG وسائل الاعلام الصلبة على YPD وسائل الاعلام الصلبة أو انتقائيةوسائل الاعلام الصلبة (أي الحد الأدنى من وسائل الإعلام الاصطناعية تفتقر الأحماض الأمينية، وإذا احتوت الخلايا البلازميدات التي تتطلب الاختيار). تنمو الخميرة عند 30 درجة مئوية حتى يتم تشكيل مستعمرات لكل سلالة، عادة 1 يوم YPD و2 أيام إذا وسائل الإعلام الانتقائي أمر ضروري.
    3. قسامة 1.2 مل من YPD السائل وسائل الإعلام أو وسائل الإعلام السائلة انتقائية في كل بئر من 96 العميقة 2 مل لوحة multiwell. نقل الخلايا من وسائل الاعلام الصلبة إلى السائلة وسائل الإعلام باستخدام عبة Frogger، وتغطي بغطاء بلاستيكي في مكانها بواسطة الشريط، وتنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية شاكر، والهز في 220 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: للحد من التلوث، وتغطية لوحات باستخدام الأغطية البلاستيكية من لوحة بتري مستطيلة. عقد الأغطية في مكان باستخدام قطعة من الشريط، لذلك يقتصر ذلك دوران الهواء الحد الأدنى.
    4. لوحات أجهزة الطرد المركزي في 1800 x ج لمدة 5 دقائق، وذلك باستخدام دلو الطرد المركزي يتأرجح مع محولات لاستيعاب 96 لوحات جيدة. تخلصي من وسائل الإعلام من الخلايا. إضافة 500 ميكرولتر YPA إلى كل بئر و resuspend الخلايا مكعبات في YPA. غطاء، يغطيمع غطاء من البلاستيك الذي عقد في مكان من الشريط.
    5. تنمو الخلايا لمدة 15 ساعة على 30 درجة مئوية في حاضنة تهتز، تهتز في 220 دورة في الدقيقة. الاستمرار في القسم 2.

2. خلايا Sporulating في تنسيق Multiwell 96

  1. إضافة أي واحد 3 مم معقمة حبة الزجاج الصلبة أو معقمة 5 مم × 2 مم شريط مغناطيسي في كل بئر من 96 لوحة جيدا مع 1.3 مل الآبار. (انظر ممثل النتائج أدناه للحصول على مناقشة حول ما إذا كان استخدام حبة أو بقضيب).
  2. وإذا كان كل الخلايا ليتم عرضه من نفس النمط الجيني، انتقل إلى 2.2.1. إذا كانت الخلايا ليتم عرضه هي من المورثات مختلفة، انتقل إلى 2.2.2.
    1. أخذ خلايا من الخطوة 1.1.5 وقسامة 500 ميكرولتر من الخلايا بالإضافة إلى وسائل الإعلام في كل بئر من لوحة multiwell 96. تغطية مع غطاء من البلاستيك الذي عقد في مكان من الشريط. المضي قدما إلى 2.3.
    2. خلايا تدور التي هي في YPA من 1.2.4 في 1800 x ج لمدة 5 دقائق، وذلك باستخدام دلو الطرد المركزي يتأرجح مع محولات لاستيعاب 96 لوحات جيدة. صب لوسائل الإعلام و من الخلايا. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام تبوغ إلى كل بئر و resuspend الخلايا مكعبات في وسائل الإعلام تبوغ. تغطية مع غطاء من البلاستيك الذي عقد في مكان من الشريط. المضي قدما إلى 2.3.
  3. في حالة استخدام حبة الزجاج، وعينات من مكان في حاضنة تهتز عند 30 درجة مئوية ويهز في 220 دورة في الدقيقة لتبوغ. في حالة استخدام شريط مغناطيسي، وعينات من مكان على طبق من ضجة داخل 30 درجة مئوية الحاضنة للتبوغ.
    ملاحظة: سرعة ضجة الدقيق للقضبان تحريك مغناطيسي ليست مهمة جدا، ما دامت جميع الحانات تتحرك بنشاط وتهوية الثقافة.
  4. لمراقبة التقدم من خلال تبوغ، سحب عينات من ثقافة sporulating عن التصور، إضافة 6 ميكرولتر من الخلايا من الثقافات sporulating إلى 24 ميكرولتر من وسائل الإعلام تبوغ في لوحة 96 ساترة جيدا (1: 5 تمييع). ترك الخلايا لتسوية لمدة 5 دقائق قبل فحص الخلايا باستخدام مجهر مقلوب.
    ملاحظة: في خلايا SK1 نوع البرية، والجراثيم الناضجة المدمجة شكل من 36 ساعات بعد نقلها إلى وسائل الإعلام تبوغ. تقدم من خلال تبوغ يمكن رصدها بواسطة المجهر باستخدام علامات الفلورسنت، مثل علامة النووية (أي Htb2-mCherry 18) لفحص الميتوزي أو علامة غشاء prospore (أي G20 19) لدراسة بوغ التشكل. بدلا من ذلك، وتشكيل جراثيم سهل الانكسار ويمكن رؤيته باستخدام المجهر Nomarski مدينة دبي للإنترنت بدءا حوالي 12 ساعة بعد نقل إلى وسائل الإعلام تبوغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتقييم هذا البروتوكول، وتمت مقارنة الكفاءة تبوغ تم الحصول عليها من sporulating الخلايا في لوحات multiwell (كما هو موضح أعلاه) إلى خلايا sporulated استخدام كميات أكبر في قوارير (الجدول 2). وقال إن استخدام لوحات multiwell لا يحقق كفاءة عالية ينظر عندما sporulating في قوارير، حيث كفاءة ~ 80٪ يمكن أن ينظر إليه بشكل روتيني. يمكن Sporulating في لوحات multiwell مع التهوية المناسبة (التي تقدمها الخرز الزجاجي أو أشرطة ضجة) تحقيق الكفاءة تبو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكول للsporulating SK1 الخميرة في شكل multiwell 96. التهوية هي المفتاح للتبوغ كفاءة، الأمر الذي يتطلب استخدام إما بقضيب أو حبة الزجاج في كل بئر. عندما يتم sporulated الخلايا في لوحة multiwell 96 في حاضنة تهتز دون أي حبة أو بقضيب، الخلايا لا sporulate بكفاءة. وينظر فقط زيادة صغيرة في كفاءة تبوغ عندما يتم sporulated الخلايا دون أي حبة أو بقضيب في حاضنة تهتز، مقارنة يجري في 30 درجة مئوية دون التحريض (الجدول 1؛ 17٪ في شاكر مقابل 10٪ المفروضة على ضجة طبق)....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من خلال منحة جوزيف هيلي من جامعة ماساتشوستس في بوسطن (LSH) وR15 GM86805 من المعاهد الوطنية للصحة (LSH). ويدعم SMP جزئيا على زمالة سانوفي-جنزايم في جامعة ماساتشوستس في بوسطن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Nunc 1.3 مل DeepWell PlatesThermoScientific260251المستخدمة في التبوغ
Nunc 2.0 مل DeepWell PlatesThermoScientific278743تستخدم لنمو ما قبل التبويض ، الخطوة 1.2.3
حبة زجاجية 3 ممفيشر11-312Aتستخدم في التبوغ
5 مم × 2 مم شريط التحريك ، عبوة من 12فيشر14-511-82تستخدم للتبواغ
96 حسنا froggerV & P ScientificVP407مطلوب للخطوة 1.2
ناسخة المكتبةV& P ScientificVP381مطلوب للخطوة 1.2 ؛ لاستخدامه مع
طبق بتري المستطيلfrogger ThermoScientific264728اللازم للخطوة 1.2
Bacto PeptoneBD211677مطلوب لوسائل الإعلام
مستخلص الخميرةديناربحريني 212750اللازم للوسائط
Bacto AgarBD212750اللازمة للوسائط
DextroseفيشرD16-3مطلوب للوسائط
أسيتات البوتاسيومفيشرP171-500اللازمة للوسائط
الجلسرينفيشرG33-500اللازمة للوسائط
أسود 96 بئر لوحة سفلية زجاجيةMatTekPBK96G-1.5.5-Fاللازمة للخطوة 2.4

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  2. Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
  3. Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
  4. Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).
  5. Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
  6. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  7. Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
  8. Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
  9. McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
  10. Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
  11. Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
  12. Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
  13. Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
  14. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  15. Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836(2011).
  16. Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. , (2016).
  17. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
  18. Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
  19. Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  20. Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Saccharomyces cerevisiae 96

مقالات ذات صلة