مقالة منهجية

ل

10.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54592

⸱

ديسمبر 8, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف نموذج الفئران في المختبر للحاجز الدموي الدماغي الذي يستخدم التحليل الطيفي لخلايا المعاوقة ، مع التركيز على العواقب على سلامة الخلايا البطانية ونفاذيتها عند التفاعل مع الخلايا التائية المنشطة.

الملخص

انهيار الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو خطوة حاسمة في تطور أمراض المناعة الذاتية مثل التصلب المتعدد (MS) ونموذجه الحيواني التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE). تتميز هذه العملية بانتقال الخلايا التائية المنشطة عبر الخلايا البطانية الدماغية (ECs) ، وهي المكونات الرئيسية ل BBB. ومع ذلك ، فإن العواقب على وظيفة EC في الدماغ عند التفاعل مع هذه الخلايا التائية غير معروفة إلى حد كبير. نصف هنا فحصا يسمح بتقييم وظيفة EC الأولي للأوعية الدموية الدقيقة في دماغ الفأر (MBMEC) وسلامة الحاجز أثناء التفاعل مع الخلايا التائية بمرور الوقت. يستخدم الاختبار التحليل الطيفي لخلية المعاوقة ، وهو أداة قوية لدراسة سلامة ونفاذية الطبقة الأحادية EC ، عن طريق قياس التغيرات في المقاومة الكهربائية عبر البطانة (TEER) وسعة طبقة الخلية (Ccl). في الاتصال المباشر مع ECs ، تكون الخلايا التائية المحفزة ولكن ليست الساذجة قادرة على إحداث خلل وظيفي أحادي الطبقة في EC ، كما يتضح من انخفاض TEER وزيادة في Ccl. يسجل الاختبار التغييرات في سلامة الطبقة الأحادية EC بطريقة مستمرة وآلية. إنه حساس بما يكفي للتمييز بين نقاط القوة المختلفة للمنبهات ومستويات تنشيط الخلايا التائية ويتيح التحقيق في عواقب التعديل المستهدف لتفاعل الخلايا التائية EC باستخدام مجموعة واسعة من المواد مثل الأجسام المضادة والكواشف الدوائية والسيتوكينات. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية كمراقبة جودة لسلامة EC في فحوصات نقل الخلايا التائية في المختبر. هذه التطبيقات تجعلها أداة متعددة الاستخدامات لدراسة خصائص BBB في ظل الظروف الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية.

المقدمة

حاجز الدم في الدماغ يفصل جهاز الدورة الدموية من الجهاز العصبي المركزي (CNS) 1-3. وهو يوفر حاجز مادي أن يمنع حرية حركة الخلايا وانتشار الجزيئات القابلة للذوبان في الماء ويحمي الدماغ من مسببات الأمراض والمواد الضارة المحتملة. بالإضافة إلى وظيفة الجدار العازل، وBBB تمكن من إيصال الأوكسجين والمواد المغذية لحمة الدماغ، والتي تضمن حسن سير العمل في الأنسجة العصبية. الخصائص الفنية للBBB درجة عالية من التنظيم من قبل المكونات الخلوية وديكي لها، مع درجة عالية من التخصص ECS كونها العنصر الهيكلي الرئيسي. تتميز ECS من BBB من وجود تقاطع ضيق (TJ) المجمعات، وعدم وجود fenestrations، النشاط pinocytic منخفضة للغاية، وآليات النقل نشطة بشكل دائم. مكونات أخرى من BBB الغشاء القاعدي EC، pericytes تضمين البطانة، قدم نهاية نجمي و= المرتبطة قدم المساواةenchymal الغشاء القاعدي أيضا أن تسهم في تطوير وصيانة وظيفة من BBB 2،4 - 6 و، جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة، تشكل وحدة وعائية عصبية (NVU)، والتي تمكن حسن سير العمل في الجهاز العصبي المركزي 7-9.

في مجموعة متنوعة من الأمراض العصبية، مثل الاعصاب، والأمراض الالتهابية أو المعدية، وظيفة BBB للخطر 2،5،10. ديسريغولاتيون من TJ المجمعات وآليات النقل الجزيئية يؤدي إلى زيادة نفاذية BBB، تسرب الكريات البيض، والتهاب وتلف الخلايا العصبية. من أجل دراسة خصائص BBB في ظل هذه الظروف المرضية، وقد وضعت مختلف في المختبر نماذج BBB 9،11،12. معا كانوا قد قدموا معلومات قيمة حول التغييرات النزاهة الحاجز، نفاذية وكذلك آليات النقل. هذه النماذج تستخدم الخلايا البطانية من البشر، الجرذان والفئران، الخنزير أو بالأغنام أصل 13-18. الخلايا البطانية الأولية أو خطوط الخلايا يتم استزراع إما الأحادية أو جنبا إلى جنب مع pericytes و / أو الخلايا النجمية لتحاكي بشكل وثيق BBB في الجسم الحي 19-25. في السنوات الأخيرة، أصبح قياس المقاومة الكهربائية transendothelial (طير) أداة مقبولة على نطاق واسع لتقييم خصائص حاجز غشائي 26،27.

يعكس طير مقاومة لتدفق الأيونات عبر أحادي الطبقة الخلية ويوفر انخفاضه مقياس حساسية للخطر سلامة حاجز غشائي، وبالتالي زيادة نفاذية. وقد وضعت العديد من أنظمة قياس طير، بما في ذلك طلائي Voltohmmeter (EVOM)، الكهربائية الخلوي الركيزة الممانعة الاستشعار (ECIS)، وتحليل الخلايا في الوقت الحقيقي 15،28 - 30. يعكس طير المقاومة لتدفق الأيونات بين ECS المجاورة (paracellular الطريق) وهو يتناسب طرديا معسلامة الحاجز. في مقاومة الطيفي 27،31، يتم قياس مقاومة الإجمالية المعقدة (Z)، الذي يوفر معلومات إضافية حول سلامة الحاجز عن طريق قياس جنة علم المناخ. لجنة علم المناخ يتعلق بالسعة الحالية من خلال غشاء الخلية (الطريق العابر لل): طبقة الخلايا تتصرف مثل مكثف في الدائرة الكهربائية ما يعادلها، فصل رسوم على جانبي الغشاء وهي عكسيا يتناسب مع سلامة الحاجز. عندما نمت على إدراج قابلة للاختراق، ECS الالتزام بها وتتكاثر وتنتشر على غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها. هذا يقاوم الخلفية بالسعة الحالية للإدراج (الذي في حد ذاته يتصرف مثل مكثف) ويؤدي إلى انخفاض في السعة حتى يصل إلى مستوى الحد الأدنى. ويعقب ذلك من خلال إنشاء مجمعات TJ أن ختم قبالة الفضاء بين ECS المجاورة. وهذا يحد من تدفق الأيونات عبر الطريق paracellular، وطير يزيد حتى يصل إلى هضبة لها. في ظل ظروف التهابات، ومع ذلك، فإن endotheliتم المساس آل الحاجز: طير يتناقص مجمعات TJ الحصول على تعطلت ولجنة علم المناخ يزيد باعتبارها العنصر بالسعة من إدراج يرتفع مرة أخرى.

يستخدم قياس طير لدينا نظام آلي مراقبة الخلية 32: يترتب على مبدأ التحليل الطيفي مقاومة وتمتد تطبيقاته السابقة. هنا، نحن تصف في المختبر نموذج BBB التي تمكن من دراسة خصائص الحاجز، بما فيها تفاعل بطانة الدماغ مع الخلايا المناعية. ولا سيما تنشيط خلايا تي. ولوحظت هذه الظروف المرضية في أمراض المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي، مثل التصلب المتعدد ونموذج حيواني التجريبية التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي في 33-37. هنا، خطوة حاسمة هي التهجير من دماغي المنشأ، وخلايا T-المايلين محددة عبر BBB. ويتبع ذلك تنشيط في الحيز المحيط بالأوعية ودخول حمة الدماغ، حيث تجنيد الخلايا المناعية الأخرى، وليالتهاب diate ولاحق إزالة الميالين 1،35،38. ومع ذلك، الآليات الجزيئية للتفاعل بين هذه الخلايا التائية والخلايا البطانية، والمكونات الرئيسية من بي بي بي، ليست مفهومة جيدا. ويهدف بروتوكول لدينا لملء هذه الفجوة وإعطاء رؤى جديدة في العواقب على الخلايا البطانية (أي سلامة الحاجز والنفاذية) عند الاتصال بهم مباشرة وتفاعل معقد مع تنشيط خلايا تي.

بروتوكول الموصوفة هنا يجعل من استخدام الماوس الأساسي خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البطانية، كما نمت أحادي الطبقة على إدراج نفاذية الأغشية مع الصغيرة التي يسهل اختراقها. وشارك في تربيتها الخلايا البطانية مع خلايا CD4 + T، التي يمكن أن تكون مرحلة ما قبل تفعيلها إما polyclonally أو بطريقة مستضد معين. شارك في ثقافة MBMECs مع خلايا T قبل تفعيلها، ولكن ليس ساذجا يؤدي الى انخفاض في طير وزيادة في لجنة علم المناخ، والذي يقدم مقياسا كميا لMBMEC الخلل وحاجز انقطاع. التقنيةهو غير الغازية: ويستخدم في البناء بدلا من الأقطاب الكهربائية عود، التي تحول دون اضطراب كبير من أحادي الطبقة EC. أنها يمكن أن تستخدم لمراقبة وظيفة الحاجز من دون استخدام علامات الخلية. يجعل القياسات المستمرة بطريقة آلية وتمكن تقييم مستقل من المعلمات حاجز اثنين (طير ولجنة علم المناخ) في وقت واحد مع مرور الوقت. هذه الطريقة أيضا حساسة بما يكفي للتمييز بين مستويات مختلفة من تنشيط الخلايا T وآثار هذه الخلايا التائية على ECS.

ويمكن استخدامه في مجموعة واسعة من المقايسات الفنية: السيتوكينات مختلفة و / أو كيموكينات المتورطين في عمليات التهابات يمكن أن تضاف إلى ثقافة مشتركة من MBMECs وخلايا تي. منع الأجسام المضادة ضد جزيئات التصاق الخلية على أي من المفوضية الأوروبية أو الجانب تي خلية يمكن استخدامها. ومثبطات تي علامات تنشيط الخلايا أو ممتلكاتهم لحل الخلايا يمكن أن تضاف خلال فتيلة تي خلية أو زملائهم في الثقافة مع ECS. الفحص مفيد أيضا للهجرة خلايا Tالمقايسات، لأنها يمكن أن تكون بمثابة مراقبة جودة MBMEC سلامة أحادي الطبقة السابقة لإضافة خلايا تي. كل هذا يجعل هذه الطريقة أداة مرنة وموثوق بها لدراسة BBB في المختبر، مع التركيز على تأثير تنشيط خلايا تي في المفوضية الأوروبية سلامة أحادي الطبقة. هذا الأمر أهمية خاصة لفهم آليات تعطل BBB في التسبب في أمراض المناعة الذاتية، مثل مرض التصلب العصبي المتعدد ونموذج حيواني لEAE، حيث تعبر، وخلايا T دماغي المنشأ ذاتية التفاعل بي بي بي وتسبب التهاب وتلف الخلايا العصبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

لجميع التجارب، كانت ولدت الفئران والمحافظة في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض في منشأة الحيوان المركزي في جامعة مونستر، وفقا للمبادئ التوجيهية الألمانية لرعاية الحيوانات. تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الحيوان الأخلاق التجريبية والموافقة عليها من قبل السلطات المحلية في شمال الراين وستفاليا، ألمانيا (LANUV، AZ 84-02.05.20.12.217).

1. MBMEC العزلة والثقافة

ملاحظة: عزل MBMECs كما هو موضح سابقا بالتفصيل 14 مع إجراء التعديلات التالية:

  1. تضحية 20 الكبار C57BL / 6 الفئران (6-8 أسابيع من العمر) من خلال CO 2 الاستنشاق وتأكيد وفاتهم قبل التأكد من توقف القلب والتنفس.
  2. شطف الفأر مع الايثانول 70٪ وقطع رأس باستخدام مقص. إزالة فروة الرأس باستخدام ملقط ومقص. جعل شقوق على الجانب الأيسر والأيمن من الجمجمة، بدءا من ماغنوم الثقبة. رفع الجمجمة من جانبها الذيلية وتاكالبريد خارج الدماغ مع ملقط.
  3. تحت غطاء تدفق الصفحي، استخدام ملقط معقم لوضع الدماغ في طبق بيتري وإزالة جذع الدماغ، المخيخ، والمهاد، وحفظ فقط القشرة.
    ملاحظة: استخدام المجهر ليس من الضروري لأي من هذه الخطوات.
  4. وضع قشرة على قطعة من ورق نشاف معقمة الغربية ولفة برفق مع ملقط حتى السحايا لم تعد مرئية.
  5. بعد الهضم الميكانيكي والأنزيمية (بعد بروتوكول 14)، وجمع الخلايا البطانية من التدرج الكثافة باستخدام طويلة، إبرة معقمة والغطاس 5 مل. تظهر الخلايا البطانية على شكل طبقة ضبابية فوق الحلبة الحمراء مع الكريات الحمراء. نقل 20-25 مل من هذه الطبقة في أنبوب 50 مل الطرد المركزي الجديدة. ملأ أنبوب مع DMEM.
  6. بعد جولتين من غسل 14، resuspend الخلايا في 6 مل من المتوسط MBMEC تحتوي على بوروميسين (4 ميكروغرام / مل)، والبذور منها على ست آبار المغلفة من 24 لوحة جيدا. تركها في نسيجحاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (المشار إليها باسم "حاضنة" من هنا) لمدة ثلاثة أيام.
    ملاحظة: للحصول على تفاصيل MBMEC حل طلاء، انظر المواد الجدول.
  7. تغيير المتوسطة وذلك بإضافة 1 مل إلى كل بئر المتوسطة MBMEC جديدة دون بوروميسين. وضع لوحة الظهر عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ لمدة يومين آخرين.

2. حصاد MBMECs

  1. في اليوم الخامس بعد MBMEC العزلة، قبل معطف إدراج قابلة للاختراق مع MBMEC حل طلاء: إضافة 80 ميكرولتر من الحل في إدراج وترك لهم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 3 ساعة.
  2. ماصة بعناية الحل طلاء، والسماح للإدراج الهواء الجاف لمدة 30 دقيقة. إضافة 2 مل من درجة حرارة الغرفة (RT) برنامج تلفزيوني على كل بئر من لوحة، وذلك باستخدام MBMECs لغسل المتوسطة. كرر هذه الخطوة. إضافة 0.05٪ التربسين-EDTA (300 ميكرولتر لكل بئر) وترك لوحة في الحاضنة لمدة 5-10 دقيقة.
  3. إضافة 2 مل من MBMEC المتوسطة إلى كل بئر لوقفtrypsinization. نقل الخلايا التي تم جمعها لأنبوب 15 مل الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لهم في 700 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 1 مل من MBMEC وسيط وبدون بوروميسين.
  4. عد الخلايا. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق خلية مع 90 ميكرولتر من 0.04٪ التريبان الأزرق (10X التخفيف من الخلايا). ماصة 10 ميكرولتر من هذا المزيج بين الغطاء الزجاجي وغرفة عد الخلايا (عدادة الكريات). عد التريبان خلايا الأزرق خالية في جميع الأرباع الأربعة للغرفة (N) وتحديد متوسط ​​عدد الخلايا عدها (N ') على النحو التالي: N' = N / 4.
  5. حساب تركيز الخلية (في 10 6 خلية / مل) باستخدام الصيغة التالية: C = N '× 10 4 × 10، حيث يتم إعطاء 10 4 من أبعاد عدادة الكريات و 10 هو عامل التخفيف من الخطوة 2.4.
  6. البذور 2 × 10 4 خلايا في حجم 260 ميكرولتر في إدراج. إضافة 810 ميكرولتر من MBMEC المتوسطة إلى المقصورة أقل من كل جانب. وضع لوحة مع تدرج في الحاضنة حتى على استعداد للشروع في القسم 4.
    ملاحظة: وحدات التخزين لمقصورة العلوية والسفلية هي إدراج محددة ولا تعمل لجميع أشكال و24-جيدا.

3. CD4 + T عزل الخلايا وتحفيز

  1. CD4 + T عزل الخلايا
    1. التضحية الماوس شخص بالغ واحد (6-8 أسابيع من العمر) من خلال CO 2 الاستنشاق وتأكيد وفاته لالتأكد من توقف القلب والتنفس.
    2. ضع الماوس على ظهرها على لوحة تشريح نظيفة وشطفه مع 70٪ من الإيثانول. استخدام مقص العقيمة وملقط لفتح الغشاء البريتوني وإزالة الطحال والغدد الليمفاوية (الاربية، الإبطين، العضدية وسرطان عنق الرحم)؛ أخيرا، نقل الأنسجة في أنبوب 15 مل الطرد المركزي التي تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني على الجليد.
    3. تحت غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي، ونقل الأنسجة عن طريق الصب في برنامج تلفزيوني مع الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مع 70 ميكرومتر مصفاة الخلية على القمة. جانس يجعله متجانساالأنسجة عن طريق الضغط عليه مع المكبس 1 مل من خلال مصفاة.
    4. إضافة 30 مل من FACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي أنه في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 10 مل من FACS العازلة. تصفية تعليق من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر، إضافة 20 مل أخرى من العازلة FACS إلى أنبوب.
    5. أجهزة الطرد المركزي لذلك في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من FACS العازلة.
    6. إضافة 20 ميكرولتر من الماوس CD4 ميكروبيدات المغناطيسية، وتخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. إضافة 25 مل من FACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي أنه في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    7. في غضون ذلك، وضع عمود الفصل LS إلى المغناطيس وشطفه مع 3 مل من FACS العازلة. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 3 مل من FACS العازلة.
    8. إضافة الخلايا إلى العمود. غسل العمود مع 3 مل من FACS العازلة ثلاث مرات. إزالة عمود من المغناطيس وضعه على جديدة 15 مل centriأنبوب fugation. إضافة 5 مل من FACS العازلة، طرد الخلايا المسمى مع المكبس عمود وأجهزة الطرد المركزي أنه في 500 x ج لمدة 5 دقائق 4 درجات مئوية.
    9. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 3 مل من T المتوسطة الخلية. عد الخلايا كما هو موضح في 2.4 والبذور 1 × 10 5 خلايا في 100 ميكرولتر من المتوسطة لكل بئر.
  2. CD4 + T تحفيز الخلية
    1. تحفيز الخلايا بولكلونل CD4 + T
      1. قبل معطف جولة القاع لوحة 96-جيدا مع تنقيته لمكافحة فأر CD3 الأجسام المضادة (استنساخ 145-2C11) في برنامج تلفزيوني، بتركيز النهائي المطلوب. على سبيل المثال، إلى ما قبل معطف لوحة كاملة مع α-CD3 في 1 ميكروغرام / مل، مزيج 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة (تركيز الأسهم = 0.5 ملغ / مل) مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، دوامة وإضافة 50 ميكرولتر من مزيج ل كل بئر مع ماصة الأقنية.
      2. ترك لوحة في الحاضنة لمدة 3 ساعات. بعد عزل الخلايا T، وغسل لوحة ما قبل المغلفة مرتين مع برنامج تلفزيوني. إضافة تنقية الأجسام المضادة لمكافحة CD28 (استنساخ37.51) إلى خلايا تي المعزولة في التركيز النهائي المطلوب (على سبيل المثال، في 1 ميكروغرام / مل). اخلط جيدا. البذور الخلايا T وتركهم في الحاضنة لمدة 2-3 أيام.
    2. التحفيز محددة مستضد خلايا CD4 + T مع الخلايا الجذعية (DCS)
      ملاحظة: إذا تم استخدام البلدان النامية كما الخلايا المقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة)، اتبع بروتوكول تي العزلة الخلية، مع هذه الاستثناءات:
      1. قبل المجانسة الطحال، وضخ مع 1 مل من كولاجيناز نوع IA في برنامج تلفزيوني على 0.5 ملغ / مل وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
      2. احتضان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد الغسيل مع برنامج تلفزيوني، resuspend الكرية في المخزن FACS وإضافة 20 ميكرولتر من الماوس CD11c وميكروبيدات المغناطيسية، بدلا من ميكروبيدات CD4.
      3. استخدام عمود الفصل MS وأحجام مناسبة: شطف العمود مع 1 مل من FACS العازلة. خلايا resuspend في 1 مل من العازلة FACS وغسل العمود مع 1 مل من العازلة FACS ثلاث مرات.
      4. ميلاديد مستضد من خيار بالنسبة للبلدان النامية (على سبيل المثال، المايلين دبقية قليلة التغصن بروتين سكري (MOG) أأ 35-55 في 20 ميكروغرام / مل)، تخلط جيدا والبذور 5 × 10 4 خلايا في 100 ميكرولتر من تي خلية ثقافة المتوسط في 96 جولة من الأسفل حسنا.
      5. إضافة 1 × 10 5 خلايا تي في 100 ميكرولتر من تي خلية ثقافة المتوسط في 96 جولة القاع جيدا في النهاية، كما هو موضح في بروتوكول تي زنزانة انفرادية.
    3. تحفيز خلايا CD4 + T محددة المستضد مع الخلايا البائية
      ملاحظة: إذا تم استخدام الخلايا البائية كما ناقلات الجنود المدرعة، اتبع بروتوكول تي العزلة الخلية، مع هذه الاستثناءات:
      1. استخدام الطحال من الفئران المعدلة وراثيا التي هي مستضد محددة (على سبيل المثال، IGH MOG (ث) الفئران، التي الخلايا ب التعرف على وجه التحديد MOG 35-55) الخلايا البائية.
      2. استخدام خلايا T مستضد معين (على سبيل المثال، من TCR MOG (2D2) الفئران). إضافة 20 ميكرولتر من الماوس CD19 ميكروبيدات المغناطيسي بدلا من ميكروبيدات CD4.
      3. إضافة مستضد الاختيار إلى سل بليرة سورية (على سبيل المثال، MOG 35-55 في 20 ميكروغرام / مل)، تخلط جيدا والبذور 5 × 10 4 خلايا في 100 ميكرولتر من B مستنبت الخلية في 96 جولة من أسفل جيدا.
      4. إضافة 1 × 10 5 خلايا تي في 100 ميكرولتر من تي خلية ثقافة المتوسط في 96 جولة من أسفل جيدا، كما هو موضح في بروتوكول تي العزلة الخلية.

4. إعداد وإجراء قياس طير

  1. وضع وحدة 24-جيدا الصك طير تحت غطاء تدفق الصفحي. إزالة الأغطية وإدراج مكان مع MBMECs في الصك باستخدام ملقط.
  2. ماصة 810 ميكرولتر من متوسطة جديدة إلى مقصورة أقل من الآبار وحدة: إضافته بعناية بين إدراج وجدار وحدة جيدا.
  3. إغلاق الأغطية ووضع أداة في الحاضنة. قم بتوصيل أداة لجهاز الكمبيوتر فيه؛ تشغيل وحدة تحكم وأداة لفتح البرنامج.
  4. اختر "قياس جديد 'في نافذة منبثقة. تشيالمسيخ 'تظهر طير "وصناديق' تظهر لجنة علم المناخ؛ ثم اضغط على 'بداية'. بعد الانتهاء من القياس الأول، اختر 'تحقق من كل الآبار في علامة التبويب "النتائج" لتشاهد كل القيم طير ولجنة علم المناخ.
  5. حفظ الملف: ملف> حفظ باسم> 'اسم الملف'.
    ملاحظة: كما يتم قياس طير ولجنة علم المناخ باستمرار بطريقة آلية، مراقبة القيم على مدى فترة من 3-5 أيام. تغيير المتوسطة ليس من الضروري، ما لم بقاء الخلية هي دون المستوى الأمثل، كما تصور بسبب عدم وجود زيادة في طير.
  6. اختيار نقطة زمنية للمشاركة في ثقافة MBMECs مع خلايا T عندما علم المناخ غير مستقر وأقل من 1 μF / سم 2 وطير قد وصل إلى أقصى مستوى لها.
  7. تفتيش دقيق القيم طير ولجنة علم المناخ المطلقة واستبعاد الآبار التي MBMECs لم تتطور متموجة ما يكفي من الطبقات الوحيدة عن طريق إلغاء هذه الآبار.
  8. المجموعة بقية الآبار: انقر بزر الماوس الأيمن على بئر واختر "إضافة جيدة إلى متوسط ​​البئر الجديد". نامالبريد في نافذة منبثقة. تفعل الشيء نفسه بالنسبة لجميع الآبار الفردية ليتم تجميعها.
  9. تحقق من كل متوسط ​​الآبار للتأكد من أن كل منهم لديهم نفس الشروط الأولية قبل الثقافة المشتركة. إذا بعضها اختلافا كبيرا القيم طير المطلقة أو طير المنحدرات، أو الأخطاء القياسية هي كبيرة جدا، وإعادة التجميع.
    ملاحظة: التجمع الأمثل للآبار يوفر الحد الأدنى من الاختلاف في القيم طير، داخل وبين المجموعات التجريبية على حد سواء.
  10. في علامة التبويب "التجربة" و، اضغط على "وقفة"، قطع الصك واخراجه من الحاضنة. إزالة الأغطية تحت غطاء تدفق الصفحي.
  11. إعداد ما قبل تفعيلها و / أو خلايا تي ساذجة، مع أو بدون السيتوكينات محددة، والأجسام المضادة أو غيرها من المواد، كما هو مطلوب: على سبيل المثال: مزيج تنقية NA / LE الفئران لمكافحة فأر الإنترفيرون جاما الأجسام المضادة (استنساخ XGM1.2) مع استعداد T الخلايا، في 20 ميكروغرام / مل لكل بئر من الصك طير.
    ملاحظة: إذا تم استخدام مواد مثل المانع باء granzyme، فهيdded لزراعة الخلايا T في بداية الخلايا التائية التحفيز: على سبيل المثال، جرانزيم B المانع الثاني (Calbiochem) يتم خلط مع خلايا تي المعزولة بتركيز نهائي من 10 ميكرومتر في DMSO. انظر المواد والمعدات اللازمة لمزيد من التفاصيل.
  12. إزالة بعض المتوسطة من إدراج (حجرة جيدا العليا): على سبيل المثال، ماصة بعناية 150 ميكرولتر (إزالة ينبغي تجنب كل المتوسطة لأنها يمكن أن تعكر صفو أحادي الطبقة MBMEC).
  13. إضافة خلايا T لMBMECs قبل pipetting بعناية 150 ميكرولتر من المتوسط تحتوي على 2 × 10 5 خلية / إدراج.
    ملاحظة: عند حصاد تنشيط خلايا تي مسبقا، الاعتماد فقط التفجير، وخلايا التريبان الأزرق خالية.
  14. إغلاق الأغطية ووضع صك العودة إلى الحاضنة. إعادة الصك واضغط على "قياس استئناف '. بعد 24 ساعة، اضغط على "وقف" في علامة التبويب "التجربة" ووحفظ الملف (ملف> حفظ).

5. تصدير البيانات والتحليل الإحصائي

  1. تصدير النتائج عن طريق اختيار ملف> تصدير.
  2. في "إعدادات" علامة التبويب من النافذة المنبثقة، حدد ".DOT" في الخيار "فاصل عشري" و "الجدوال" في خيار "محدد الحقل".
  3. في علامة التبويب "تصدير النتائج"، اسم الملف، والتحقق من جميع الآبار التي يتم تصديرها، والتحقق من "طير" ومربعات "لجنة علم المناخ" في الخيار "اختيار البيانات".
  4. اضغط على "تصدير البيانات" فتح الملف الذي تم تصديره، ونسخ البيانات إلى جدول بيانات.
  5. تطبيع البيانات التي تم تصديرها (مرتبة حسب كل تكرار، مع طير ولجنة علم المناخ القيم المعطاة لكل شوط (قياس)): القيم مجموعة طير ولجنة علم المناخ من نقطة زمنية الأخيرة قبل الثقافة المشتركة إلى 100٪ وتتغير وفقا لقيم سائر أشواط، نسبة إلى تشغيل '100٪'.
  6. نسخ البيانات تطبيع إلى البرنامج المفضل لتوليد الرسم البياني، وذلك باستخدام الآبار الفردية وعرض الخطأ المعياري للمتوسط ​​لكل مجموعة العلاج.
  7. Perform اتجاهين أنوفا الاختبار الإحصائي مع تصحيح بونفيروني للمقارنات المتعددة، وذلك باستخدام البرنامج الإحصائي للاختيار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويقدم الشكل 1 لمحة عامة عن نموذج BBB في المختبر تستخدم لدراسة التفاعل بين الخلايا T والخلايا البطانية. وتتكون هذه التجربة من ثلاث خطوات رئيسية. الخطوة الأولى هي عزل MBMECs الابتدائي من القشور الدماغ، وثقافتهم لمدة خمسة أيام. عندما تصل إلى نقطة التقاء في لوحة زراعة الخلايا، وtrypsinized MBMECs وreseeded على إدراج قابلة للاختراق، والتي وضعت بعد ذلك في صك طير. يتم قياس طير ولجنة علم المناخ من MBMECs باستمرار وترصد على مدى فتر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

عدة خطوات من بروتوكول صفها ضرورية لإجراء تجربة ناجحة. خلال العزلة MBMEC الأولية والثقافة، فمن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ العمل تحت ظروف معقمة قدر الإمكان، لمنع التلوث من ثقافة الخلية مع الجراثيم الفطرية أو البكتيريا. من أجل الحصول على ثقافة نقية من ECS، فمن المستحسن استخدام المتوسط تحتوي على بوروميسين في الأيام الثلاثة الأولى، والتي تمكن من البقاء على قيد الحياة ECS، ولكن ليس غيرها من أنواع الخلايا (وخاصة pericytes) 41،42. خطوة أخرى الحرجة التي تستحق اهتماما خاصا هي تحد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

كوزمانوف ، إيه إم هيرمان ، إس جي موث ، إتش ويندل وإل كلوتز ليس لديهم ما يكشفون عنه. H.-J. Galla هو مستشار علمي لشركة nanoAnalytics GmbH ، الشركة المصنعة لجهاز مراقبة الخلايا الآلية.

شكر وتقدير

ونحن ممتنون لأنيكا Engbers وفرانك كورث حصول على الدعم الفني الممتاز والدكتور ماركوس شافر (nanoAnalytics GmbH ل) لإجراء مناقشات مفيدة بشأن القياسات طير. وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، SFB1009 مشروع A03 إلى الأب وLK، CRC TR128، مشاريع A08. Z1 وB01 لوقا والأب، ومركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (كلية الطب في مونستر) عدد المنح Kl2 / 2015/14 لوقا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
cellZscopenanoAnalytics GmbHwww.nanoanalytics.comبما في ذلك: وحدة خلية 24 بئر ، وحدة تحكم ، كمبيوتر شخصي مع برنامج cellZscope v2.2.2   ؛
الطرد المركزيالفائقwww.thermoscientific.comSORVALL RC 6+ ؛ الدوار F21S-8x50y ؛ لمقياس التدفق الخلوي لعزل MBMEC
Beckman Coulterwww.beckmancoulter.comلتحليل انتقال الخلايا التائية
برنامج FlowJo7.6.5Tree Starwww.flowjo.com لتحليل أنابيب الطرد المركزي لنقل الخلايا التائية
Oak Ridge ، PCThermo Fisher Scientific3118-005050 مل ؛ لعزل MBMEC
إدراج غشاء Transwell - حجم المسام 0.4 ومايكرو ؛ مCorning3470لقياس TEER كقراءة
رئيسية لإدراج غشاء Transwell - حجم المسام 3 & مCorning3472لقياس TEER كمراقبة الجودة قبل مقايسة انتقال الخلايا التائية
لوحة زراعة الخلايا 24 بئراGreiner650 180مسطحة القاع ؛ لثقافة MBMEC
96 بئر لوحة زراعة الخلاياCostar3526القاع المستدير ؛ لزراعة الخلايا المناعية
فاصل QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976لعزل الخلايا التائية والخلايا البائية ؛ يدعم أعمدة MACS LS فاصل
OctoMACSMiltenyi Biotec130-042-109لعزل الخلايا المتغصنة ؛ يدعم أعمدة MACS MS غرفة
عد NeubauerMarienfeldMF-0640010لعد الخلايا
مصفاة الخلايا ، 70 & micro ؛ مCorning352350لعزل الخلايا المناعية
مصفاة الخلايا ، 40 & micro ؛ مCorning352340لعزل الخلايا المناعية
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303لعزل الخلايا المناعية
أعمدة فصل MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401لعزل الخلايا التائية والخلايا البائية
أعمدة فصل MACS MSMiltenyi Biotec130-042-201لعزل الخلايا المتغصنة
Mouse CD4 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-049-201ل CD4 + < / sup> عزل الخلايا التائية
الماوس CD19 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-201لعزل الخلايا البائية
الماوس CD11c MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-001لعزل الخلايا المتغصنة
الكولاجين من النوع الرابع من المشيمة البشريةSigmaC5533لمحلول طلاء MBMEC
Fibronectin من بلازما البقرSigmaF1141-5MGلمحلول طلاء MBMEC
Collagenase 2 (CSL2)WorthingtonLS004176لعزل MBMEC
Collagenase / Dispase (C / D) Roche11097113001لعزل MBMEC
DNase ISigmaDN25لعزل MBMEC
مصل الأبقار الجنيني (FBS)SigmaF7524لعزل MBMEC
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Amresco0332-100Gلعزل MBMEC
PercollSigmaP1644-1Lلعزل MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)Gibco31966-021لعزل MBMEC ووسط ثقافة MBMEC
البنسلين / الستربتومايسينSigmaP4333لعزل MBMEC ووسط ثقافة MBMEC
مخزن الفوسفات محلول ملحي (PBS)SigmaD8537ل MBMEC وعزل الخلايا المناعية
HeparinSigmaH3393لوسط ثقافة MBMEC
عامل نمو الخلايا الليفية البشرية الأساسية (bFGF)PeproTech100-18Bلوسط ثقافة MBMEC
PuromycinSigmaP8833لوسط ثقافة MBMEC ؛ فقط للأيام الثلاثة الأولى
0.05٪ Trypsin-EDTAGibco25300-054لحصاد MBMECs
كولاجيناز نوع IASigmaC9891لعزل الخلايا المتغصنة
محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪Thermo Fisher Scientific15250061لعد الخلايا
EDTASigmaE5134لعزل الخلايا المناعية
IMDM + 1٪ L-GlutaminGibco21980-032لوسط زراعة الخلايا التائية
X-VIVO 15LonzaBE04-418Qيحمي من الضوء ؛ لوسط زراعة الخلايا
البائية & بيتا ؛ -mercaptoethanolGibco31350-010لوسط زراعة الخلايا البائية
L-Glutamine (100x Glutamax)Gibco35050-061لزراعة الخلايا البائية
متوسط ماوس MOG 35 & [مدش] ؛ 55 < / sub>peptideBiotrendBP0328لتنشيط الخلايا التائية الخاصة بالمستضد
المنقى المضاد للفأر CD3 AbBioLegend100302استنساخ 145-2C11 ؛ لتنشيط الخلايا التائية متعددة النسيلة
منقى NA / LE المضادة للفأر CD28 AbBD Pharmingen553294استنساخ 37.51 ؛ لتنشيط الخلايا التائية متعددة النسيلة
المؤتلف الفئران IFN- & جاما ؛PeproTech315-05لمقايسات انتقال الخلايا التائية
مؤتلف الفئران TNF- & ألفا ؛PeproTech315-01Aلمقايسات انتقال الخلايا التائية
NA / LE منقى IFN-& جاما ؛ الجسم المضادBD Biosciences554408استنساخ XMG1.2 ؛ التركيز النهائي الموصى به: 20 & micro; جم / مل
Granzyme B Inhibitor IICalbiochem368055التركيز النهائي الموصى به: 10 & M
PE المضاد للفأر CD4 الأجسام المضادةBiolegend116005استنساخ RM4-4 ؛ لتحليل انتقال الخلايا التائية
جهاز

المراجع

  1. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
  2. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23(2012).
  5. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
  8. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  9. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  10. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  11. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
  14. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  15. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
  16. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
  18. Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022(2012).
  19. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  20. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  21. Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
  22. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  23. Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  24. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  26. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5(2013).
  28. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
  29. Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766(2014).
  30. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  31. Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
  32. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  33. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  34. Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
  35. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
  36. Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
  37. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
  38. von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
  39. nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
  40. Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  41. Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
  43. Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  44. Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889(2015).
  45. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  46. Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
  47. Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
  48. Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
  49. Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  50. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784(2012).
  51. Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة