يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

21.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54596

⸱

أكتوبر 30, 2016

 ,  , 
1School of Biological Sciences, College of Science, Nanyang Technological University

في هذه المقالة

ملخص

الخلايا الليمفاوية هي اللاعبين الرئيسيين في الاستجابات المناعية التكيفية. هنا ، نقدم بروتوكول تنقية الخلايا الليمفاوية لتحديد الوظائف الفسيولوجية للجزيئات المرغوبة في تنشيط الخلايا الليمفاوية في المختبر وفي الجسم الحي. الإجراءات التجريبية الموصوفة مناسبة لمقارنة القدرات الوظيفية بين الخلايا الليمفاوية الضابطة والخلايا الليمفاوية المعدلة وراثيا.

الملخص

تتمتع < p class = 'jove_content'>B و T ، بذخيرتها المتنوعة للغاية من مستقبلات المستضد ، بالقدرة على تكوين استجابات مناعية محددة ضد أي مسببات ممرض غازيةتقريبا 1،2. من المفهوم أن هذه القدرات المعقدة يتم التحكم فيها بواسطة عدد كبير من الجزيئات المشاركة في العمليات الخلوية المختلفة لضمان الاستجابات المناعية المنظمة في الوقت المناسبومكانيا 3. هنا ، نصف الإجراءات التجريبية التي تسمح بالعزل السريع للخلايا الليمفاوية الفئرانية عالية النقاء باستخدام تقنية فرز الخلايا المغناطيسية. يمكن بعد ذلك إخضاع الخلايا الليمفاوية المنقاة الناتجة لفحوصات وظيفية مختلفة في المختبر أو في الجسم الحي ، مثل تحديد قدرة إشارات الخلايا الليمفاوية عند التحفيز عن طريق النشاف المناعي4 والتحقيق في القدرات التكاثرية عن طريق دمج 3H-thymidine أو وسم كربوكسي فلوريسين ثنائي الأسيتات إستر السكسينيميديل (CFSE)5-7. بالإضافة إلى مقارنة القدرات الوظيفية للتحكم والخلايا الليمفاوية المعدلة وراثيا ، يمكننا أيضا تحديد القدرة التحفيزية للخلايا التائية للخلايا العارضة للمستضد (APCs) في الجسم الحي ، كما هو موضح في نتائجنا التمثيلية باستخدام خلايا OT-I T المزروعة المسماة CFSE.

المقدمة

توجد الخلايا الليمفاوية الناضجة بشكل عام في حالة الراحة إذا لم تكن هناك عدوى أو التهاب موجود مسبقا في الفرد. لذلك ، من المهم الاحتفاظ بالحالة الساذجة للخلايا الليمفاوية أثناء عملية العزل قبل إجراء المقايسات الوظيفية في المختبر أو في الجسم الحي. المفتاح لضمان نتائج متسقة وقابلة للتكرار هو الحد من أي تلاعب غير ضروري بالخلايا.

يستخدم فرز الخلايا المغناطيسية

الأجسام المضادة والحبيبات الدقيقة لتسمية الخلايا لإثراء الخلايا ذات الأهمية. مع هذا النهج ، هناك استراتيجيتان للتنقية: الإثراء الإيجابي والاستنفاد السلبي. يثري التخصيب الإيجابي مجموعة الخلايا ذات الأهمية باستخدام جسم مضاد يرتبط بالخلايا المستهدفة. من ناحية أخرى ، يؤدي النضوب السلبي إلى استنفاد الخلايا غير المستهدفة ، مما يترك مجموعة الخلايا ذات الأهمية. في مختبرنا ، نفضل الاستنفاد السلبي على التخصيب الإيجابي لأن ارتباط الأجسام المضادة بالخلايا المستهدفة يمكن أن يغير ميزات الخلية وسلوكها. في الواقع ، العديد من علامات سطح الخلية الراسخة المناسبة لعزل مجموعة معينة من الخلايا هي أيضا مستقبلات وظيفية.

لا ينتج عن فرز الخلايا المغناطيسية مجموعات عالية النقاء من الخلايا المستهدفة القابلة للحياة فحسب ، بل إنه أيضا أقل استهلاكا للوقت ويتجنب الإجهاد الخلوي الناجم عن تدفق الضغط العالي المستخدم في فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). من خلال تسمية مجموعات الخلايا غير المرغوب فيها واستنزافها باستخدام عمود الفصل المغناطيسي ، يمكننا إجراء عزل سريع للخلايا دون المساس بصلاحية مجموعة الخلايا المستهدفة. في هذا البروتوكول ، نوضح استخدام استراتيجيات النضوب السلبي لتنقية الخلايا البائية الساذجة أو الخلايا التائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

هي ولدت كل الفئران والمحافظة في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض وتجرى جميع البروتوكولات الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.

1. إعداد المخازن والكواشف

  1. إعداد المعهد التذكاري الكامل روزويل بارك (RPMI) متوسطة (10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، البنسلين (100 وحدة دولية / مل) / الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، 55 ميكرومتر 2-المركابتويثانول ).
  2. إعداد 20x والمتوازن محلول الملح (BSS) سهم 1 و 2 سهم، وبشكل منفصل.
    1. إعداد 20x والأسهم BSS 1 (111 ملي سكر العنب، 8.8 ملي فوسفات البوتاسيوم، 26.7 ملي فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة في 1 لتر ماء معقم) وإضافة 40 مل 0.5٪ الفينول الأحمر إلى 20x والأسهم BSS 1 قبل تعديل الحجم النهائي. تصفية العقيمة باستخدام 0.2 ميكرون التصفية قبل تخزينها في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد 20x وBSS الأوراق المالية 2 (25.8 ملم ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم، و 107 ملي كلوريد البوتاسيوم، الفصل 2.73 M الصوديومloride، 19.6 ملي هيدرات كلوريد المغنيسيوم، 16.6 ملي كبريتات المغنيسيوم في 1 لتر ماء معقم). تصفية العقيمة باستخدام 0.2 ميكرون التصفية قبل تخزينها في 4 درجات مئوية.
    3. لإعداد 1X BSS للاستخدام التجريبي، وتمييع 50 مل الأسهم BSS 1 و 50 مل الأسهم BSS 2، بشكل منفصل، في 400 مل من الماء المعقم لكل منهما. الجمع بين الحلول المخففة، والتكيف مع درجة الحموضة 7، وإضافة 20 مل FBS (2٪). أعلى ما يصل إلى 1 لتر باستخدام الماء المعقم وتصفية العقيمة باستخدام 0.2 ميكرون فلتر.
      ملاحظة: يجب أن تكون على استعداد الحلول الأسهم BSS بشكل منفصل بسبب اختلاط الأسهم BSS المركزة مباشرة يمكن أن يؤدي إلى هطول الأمطار.
  3. خلايا الدم الحمراء (RBC) الاحتياطي تحلل
    1. لإعداد العازلة تحلل كريات الدم الحمراء، مزيج 9 أجزاء كلوريد الأمونيوم الأوراق المالية (155 كلوريد الأمونيوم مم في الماء المعقم) إلى 1 الأسهم جزء تريس قاعدة (130 ملي تريس (hydroxymethyl) aminomethane في الماء المعقم، ودرجة الحموضة 7.65) قبل الاستخدام.
      ملاحظة: مخزن الحلول الأسهم معقمة من كلوريد الأمونيوم وتريس قاعدة في 4 درجات مئوية. إعداد تحلل بuffer جديدة لضمان تحلل كفاءة من كرات الدم الحمراء.

2. جيل من الخلايا الليمفاوية تعليق من الطحال أو الغدد الليمفاوية

ملاحظة: من المهم إعداد جميع الكواشف والمعدات المطلوبة للتجربة قبل القتل الرحيم الماوس وتوليد تعليق خلية واحدة من الخلايا الليمفاوية في أقرب وقت ممكن للحفاظ على viabilities خلية عالية.

  1. الموت ببطء الماوس التجريبية خلع عنق الرحم أو CO 2 الخنق.
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية جو معقم و مطهر.
  2. تراجع الماوس بأكمله إلى 70٪ من الإيثانول قبل اتخاذ أي شقوق. إزالة الطحال والغدد الليمفاوية جو معقم و مطهر 8، ووضعها في منفصلة 15 مل أنابيب تحتوي على 5 مل الجليد الباردة RPMI / FBS (RPMI مع FBS 2٪) أو BSS / FBS (من الخطوة 1.2.3).
    ملاحظة: منذ BSS يمنع كفاءة تحلل كريات الدم الحمراء، واستخدام RPMI لإعداد تعليق خلية الطحال والتحول إلى BSS بعد عملية الشراءص RBC تحلل.
  3. لتوليد تعليق خلية واحدة من الطحال أو الغدد الليمفاوية، ضع الجهاز (ق) في بين قطعتين من معقمة 100 ميكرون خلية شبكة مصفاة في طبق بتري تحتوي على 2 مل الجليد الباردة RPMI / FBS أو BSS / FBS. باستخدام المكبس من حقنة 1 مل، الهريس الجهاز (ق) حتى تمزقت إلى أجزاء دقيقة جدا.
  4. نقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل وغسل مصفاة الخلية شبكة مع الثلج الباردة RPMI / FBS أو BSS / FBS. جمع تعليق خلية المتبقية، إضافة إلى نفس أنبوب 15 مل، وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف.
    ملاحظة: إعادة تعليق الخلايا مكعبات عبها الأنبوب مع الأصابع قبل أن يضيف RBC العازلة تحلل أو المتوسطة في الخطوات اللاحقة.
  5. إعداد درجة حرارة الغرفة العازلة تحلل (RT) RBC أثناء الطرد المركزي لتعليق الخلية (راجع الخطوة 1.3). بعد التكوير الخلايا وإزالة طاف، وإعادة تعليق-الخلايا مع 1 مل RBC تحلل العازلة لكل 10 8 خلايا. Incuباتي رد فعل تحلل في RT لمدة 3-4 دقيقة.
  6. وقف RBC تحلل مع 14 مل من الجليد الباردة BSS / FBS وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.

3. تنقية B وخلايا T

  1. تنقية خلايا B
    1. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. اعادة تعليق ما يصل إلى 10 8 خلايا الطحال في 300 ميكرولتر BSS / FBS وإضافة 50 ميكرولتر مكافحة CD43 ميكروبيدات المغناطيسية 9،10. لإزالة الخلايا الميتة، إضافة 30 ميكرولتر Annexin V حبات مغناطيسية. احتضان تعليق الخلية في 4 درجة مئوية الثلاجة لمدة 30 دقيقة.
  2. تنقية خلايا T
    1. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. اعادة تعليق ما يصل إلى 10 8 خلايا في غير-T نضوب خلايا الجسم المضاد كوكتيل (الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز ضد CD19، B220، GR-1، TCR-γδ، CD49b، CD11c و، CD11b، Ter119 وCD4 أو CD8 تبعا لعدد السكان الخلية المستهدفة ل يمكن تنقيته)، المخفف 1: 200 في 200 BSS ميكرولتر / FBS 4،5. احتضان تعليق خلية في4 ° C الثلاجة لمدة 15 دقيقة.
    2. بعد الحضانة، إضافة 10 مل BSS / FBS لغسل الخلايا وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في 165 ميكرولتر BSS / FBS مع 30 ميكروبيدات streptavidin ميكرولتر و 15 ميكرولتر Annexin V حبات مغناطيسية. احتضان تعليق الخلية في 4 درجة مئوية الثلاجة لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: لضمان حتى وصفها مع ميكروبيدات المغناطيسية، واحتضان الخلايا مع ميكروبيدات لمدة 15 دقيقة، ثم خلط تعليق خلية بلطف من خلال الاستفادة من أنبوب 15 مل واحتضان لمدة 15 دقيقة أخرى خلال خطوة 3.1.1. أو 3.2.2.
  3. إعداد العمود فصل لتنقية خلية
    1. إعداد عمود الفصل غير المستخدمة خلال وضع العلامات ميكروبيدات من الخلايا (الخطوة 3.1.1. أو 3.2.2.). قبل الدافئة BSS (بدون FBS) إلى RT واستخدام 2 مل لغسل وتتوازن العمود جو معقم و مطهر. بعد موازنة مع BSS، لا ينبغي أن يسمح للعمود غسلها لتجف.
      ملاحظة: نحن نستخدم LS جolumn بدلا من العمود LD الموصى بها نظرا لإعادة الاستخدام (انظر الخطوة 3.4).
    2. بعد وضع العلامات مع حبات مغناطيسية، إضافة 14 مل BSS / FBS لغسل الخلايا وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في 1-3 مل RT BSS.
    3. إرفاق العقيمة 21 G الإبرة إلى غيض من عمود للحد من معدل تدفق أثناء عملية التنقية. تحميل تعليق الخلية على العمود معايرتها وجمع التدفق من خلال تحتوي على الخلايا المستهدفة النقاء.
      ملاحظة: تجنب إدخال فقاعات في العمود أثناء التحميل.
    4. غسل العمود مرة واحدة مع 1 مل BSS / FBS وجمع التدفق من خلال تحتوي على الخلايا المستهدفة النقاء. تحديث العمود مع تدفق من خلال مرة أخرى. جمع التدفق من خلال بعد التحميل الثاني في نفس أنبوب 15 مل.
    5. غسل العمود 3 مرات مع 1 مل BSS / FBS وجمع التدفق من خلال تحتوي على الخلايا المستهدفة النقاء. بعد ذلك، إضافة 5 مل BSS / FBS إلى thالعمود الإلكترونية، ومع الغطاس، بمسح الخلايا المسمى مغناطيسيا للخروج من عمود في أنبوب 15 مل الجديد.
    6. تحقق نقاء من الخلايا التي تم جمعها عن طريق التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة التي تربط على سطح المستضدات من تنقية باء أو خلايا تي 4،5.
  4. إعادة استخدام عمود الفصل
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدامها العمود LS تصل إلى 4 مرات دون أن يؤثر كفاءة تنقية.
    1. غسل العمود 3 مرات مع 5 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) و 3 مرات مع 5 مل من الماء المقطر من أعلى باستخدام المكبس.
    2. غسل العمود مع 5 مل 70٪ من الإيثانول وتجفيف عمود على نطاق واسع باستخدام صنبور الهواء لمنع تراكم الصدأ في العمود.
    3. لإعداد عمود LS المستخدمة لإجراء تجربة تنقية منفصلة، ​​وغسل عمود من أسفل إلى أعلى مع 5 مل 70٪ من الإيثانول باستخدام محول حقنة. التالي، وغسل عمود من الأسفل إلى الأعلى مرتين مع 5 مل العقيمة برنامج تلفزيوني، تليها 5 مل PBS مرة واحدة من أعلى العمود. إضافة 2مل RT BSS للتوازن العمود ومن ثم المضي قدما لتحميل العمود مع الخلايا المسمى.

4. CFSE وصفها وتحفيز

ملاحظة: تنقية الخلايا يمكن أن تخضع لمجموعة متنوعة من في المختبر والمقايسات الفنية الجسم الحي. هنا، ونحن نستخدم خلايا T النقاء لتحديد T القدرة على تحفيز الخلايا من ناقلات الجنود المدرعة 5.

  1. حل قبل الدافئ وضع العلامات (0.1٪ FBS في برنامج تلفزيوني) إلى 37 درجة مئوية قبل CFSE التحميل.
    ملاحظة: استخدام نسبة منخفضة من FBS في برنامج تلفزيوني يقلل موت الخلايا خلال CFSE التحميل ويقلل من فقدان الخلايا خلال الطرد المركزي. ومع ذلك، يمكن FBS الكثير تتداخل مع CFSE التحميل.
  2. غسل الخلايا تنقيته مرتين مع وضع العلامات الحل، ثم إعادة علقت في 2 × 10 7 خلية / مل في حل وضع العلامات قبل تحسنت في أنبوب 15 مل.
  3. إعداد 10 ميكرومتر حل CFSE (1: 500 التخفيف من 5 ملي CFSE حل الأوراق المالية) في قبل تحسنت حل وضع العلامات. ينبغي CFSE الحلأن طازجة في كل مرة لتحقيق وضع العلامات الأمثل.
  4. لتحميل الخلايا مع CFSE، إضافة تعليق خلية جزء 1 إلى 1 جزء 10 حل ميكرومتر CFSE في أنبوب 15 مل واحتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ويستخدم تركيز النهائي من 5 ميكرومتر CFSE لتسمية 1 × 10 7 خلية / مل.
  5. عكس الأنبوب كل دقيقة 2 لضمان خليط متجانس من الخلايا خلال CFSE التحميل.
  6. لوقف رد الفعل، إضافة عدة مجلدات من اكتمال المتوسطة RPMI الجليد الباردة وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. على النجاح CFSE تحميل، ستظهر بيليه خلية مصفر.
  7. غسل CFSE تحميل خلية واحدة لمزيد من الوقت مع كامل المتوسطة RPMI الجليد الباردة وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية قبل استخدام لفي المختبر زراعة أو في تنشيط الجسم الحي.

5. في المختبر تحفيز

  1. يعد حل 2X الأسهم من المحفزات (2X المحفزات حل الأسهم) مباشرة قبل الاستعمال بحيث 100 ميكرولتر من 2X حل الأسهم المحفزات يمكن أن تضاف إلى 100 ميكرولتر من الخلايا إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر لكل بئر في لوحة 96-جيدا.
  2. إذا كنت بحاجة لوحة المغلفة مع المثيرات (الغلوبولين المناعي أو CD40 للخلايا B أو CD3 وCD28 للخلايا T)، يخفف من المحفزات في برنامج تلفزيوني وقبل معطف لوحة الثقافة في 4 درجات مئوية خلال الليل. بدلا من ذلك، لوحة الثقافة يمكن أن تطلى عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في اليوم من هذه التجربة. غسل لوحة المغلفة مرتين مع برنامج تلفزيوني (لا تسمح لوحة لتجف في أي وقت).
لخلايا B
المحفزات التركيز النهائي
F (أ ب ') 2 الماعز المضادة للماوس الغلوبولين المناعي 0،6-2،4 ميكروغرام / مل
مكافحة فأر CD40 ماب 0.5-2 ميكروغرام / مل
المؤتلفالماوس IL-4 25 U / مل
lipopolysaccharide في ،1-10 ميكروغرام / مل
(LPS) من E. القولونية المصلي 055: B5
للخلايا T
المحفزات التركيز النهائي
مكافحة CD3 (المغلفة لوحة) 2-10 ميكروغرام / مل
(50 ميكرولتر / جيد لطلاء)
مكافحة CD28 (المغلفة لوحة) 2 ميكروغرام / مل
المؤتلف IL-2 40 U / مل
PDBu (Phorbol استر) 5-50 نانوغرام / مل
A23187 (الكالسيوم حامل الأيون) 250 نانوغرام / مل

الجدول 1: التركيزات من المحفزات المستخدمة لتحفيز الخلايا الليمفاوية في ثقافة في المختبر.

  1. لخلايا B وصفت CFSE، إعادة تعليق ل3 × 10 6 خلية / مل في كامل المتوسطة والثقافة RPMI في ثلاث نسخ مع 3 × 10 5 خلايا جيدا / في 96-جيدا لوحات مسطحة القاع لمدة 72 ساعة.
  2. للخلايا T المسمى CFSE، إعادة تعليق ل0.5-3 × 10 6 خلية / مل في كامل المتوسطة RPMI والثقافة في ثلاث نسخ مع 0.5-3 × 10 5 خلايا جيدا / في 96-جيدا لوحات أسفل الجولة لمدة 48 أو 72 ساعة .

6. في فيفو تحفيز

  1. في الجسم الحي التحفيز، نقل adoptively 4 × 10 6 المسمى CFSE خلايا T في الماوس (عن طريق الوريد (IV) في 200 ميكرولتر PBS) إلى كل فأر متلق MHC المطابقة.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، وخلايا T وصفت CFSE ويمكن نقل adoptively باستخدام الوريد الذيل أو حقن الرجعية المداري حيث أن هذه الخلايا سوف تضم اللمفاوية أجهزة مثل الطحال والغدد الليمفاوية.
  2. تحدي الفئران المتلقي في وقت لاحق يوم واحد مع المستضد.
    ملاحظة:في هذا المثال، ونحن نستخدم ألبومين البيض (البروتين OVA، 50 ميكروغرام / الماوس) كما مستضد لOVA محددة، تم نقل الخلايا التائية مستقبلات (TCR) خلايا T -transgenic adoptively في الفئران المتلقي. إعداد البروتين OVA في برنامج تلفزيوني العقيمة وحقن 100 ميكرولتر من OVA بروتين / برنامج تلفزيوني أو السيطرة برنامج تلفزيوني، عن طريق الحقن تحت الجلد (سي)، إلى كل فأر متلق 5.
  3. الحصاد وتوليد تعليق خلية واحدة من الأجهزة اللمفاوية (الغدد الليمفاوية والطحال) من الفئران المتلقي بعد 3 أيام التحصين مع البروتين OVA أو برنامج تلفزيوني. الغدد الليمفاوية منفصلة إلى الغدد الليمفاوية القريبة (PLN)، والذي يتضمن إبطي، العضدية والغدد الليمفاوية العنقية سطحية) والعقد الليمفاوية البعيدة (DLN)، التي تضم المساريقي، مأبضي، الاربية، وأسفل الظهر، والغدد الليمفاوية الذيلية. خلايا وصمة عار باستخدام الأجسام المضادة نظام مراقبة الأصول الميدانية المناسبة للتحقق من انتشار الخلايا التائية.
    ملاحظة: في هذا CFSE خلية تجربة تتبع، CFSE المسمى خلايا T من السيطرة على الفئران المحقونة برنامج تلفزيوني تأسيس مضان الأساس لعدم دىviding الخلايا. انقسامات الخلية من المتكاثرة، وتصور، الخلايا المسمى CFSE-حفز مستضد عن طريق قياس قمم مضان 12،13. مع تحكم في برنامج تلفزيوني، وعدد من انقسامات الخلية من المتكاثرة، وخلايا T وصفت CFSE-يمكن تحديد 12،13.
  4. تحليل البيانات تكاثر الخلايا المسمى CFSE بمقارنة عدد من انقسامات الخلية أو قمم بين العينات (الشكلان 1 و 2).
    ملاحظة: على سبيل المثال، CFSE المسمى، وخلايا T-OVA محددة نقل adoptively في الفئران المتلقي تلقي مستضد OVA سيخضع انتشار نشاطا مقارنة مع السيطرة على الفئران المحقونة برنامج تلفزيوني 5،12. وعلاوة على ذلك، من الجدير بالذكر أن نشير إلى أن هناك العديد من الطرق لتحليل البيانات تكاثر الخلايا CFSE، كما يتبين من هوكينز وزملاؤه 14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تنقية الخلايا المغناطيسية من الخلايا الليمفاوية يسمح للمستخدمين لتنقية السكان الخلية المستهدفة في فترة قصيرة نسبيا من الزمن. باستخدام بروتوكول استنزاف لدينا، كنا قادرين على زيادة النسبة المئوية للخلايا التائية CD8 (OT-I في وتفعيل إعادة التركيب الجيني 1 (الفريق الاستشاري-1) الفئران -deficient) من 72.8٪ (قبل تنقية) إلى 94.2٪ (بعد تنقيتها. الشكل 1A) 4،5. ويمكن بعد هذه الخلايا الليمفاوية تنقيته أن تستخدم لفحوصات وظيفية المصب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود إجراءات لتنقية الخلايا الليمفاوية من الأجهزة اللمفاوية. تنقية الخلايا باستخدام الفرز حبة المغناطيسي هي طريقة سريعة وبسيطة يمكن أن ينتج قابلة للحياة، الخلايا المستهدفة عالي النقاء.

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

بقاء الخلية والعائد الخلية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ويدعم هذه الدراسة من قبل وزارة التربية والتعليم، سنغافورة (AcRF Tier1-RG40 / 13 و Tier2-MOE2013-T2-2-038). تم تحرير مخطوطة كتبها ايمي سوليفان من Obrizus الاتصالات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>المواد< قوي>
RPMI 1640 (بدون L-Glutamine)Gibco31870025
مصلالجنيني تعطيل الحرارة 
L-glutamineGibco25030024
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140114
2-mercaptoethanolGibco21985023
الميكروبيدات المغناطيسية المضادة ل CD43Miltenyi Biotec130-049-801امزج جيدا قبل الاستخدام
الميكروبيدات StreptavidinMiltenyi Biotec130-048-101تخلط جيدا قبل الاستخدام
الخرز المغناطيسي المضاد للملحق VMiltenyi Biotec130-090-201خلط جيدا قبل الاستخدام
MACS LD & nbsp ؛Miltenyi Biotec130-042-901
96 جيدا U-bottom لوحة ثقافة معقمةGreiner Bio-one650180
96-well F-bottom لوحة ثقافة معقمةGreiner Bio-one655180
100 & mu ؛ شبكةللتعقيم باستخدام الأشعة فوق البنفسجية قبل الاستخدام
0.2 & mu ؛ m  وحدات التصفية المعقمة التي يمكن التخلصNalgene567-0020يمكن استبدالها بأي جهاز تصفية معقم
CellTrace VioletInvitrogenC34557CTV لفترة قصيرة ؛ بديل ل CFSE
CellTrace YellowInvitrogenC34567CTY لفترة قصيرة ؛ بديل ل CFSE
CellTrace Far RedInvitrogenC34564CTFR لفترة قصيرة ؛ بديل ل CFSE
صبغة تكاثر الخلايا eFluor 670eBioscience65-0840CPD670 لفترة قصيرة ؛ بديل ل CFSE
PKH26Sigma AldrichPKH26GLPKH26 ، بديل ل CFSE
strong>Name< / strong>CompanyCatalog NumberComments
Chemicals
سكر العنبسيجما ألدريتشG7021
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجما ألدريتشP5655
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةسيجما ألدريتشS5136
الفينول الأحمرسيجما ألدريتشP0290
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتسيجما ألدريتشC7902
كلوريد البوتاسيومسيجما ألدريتشP5405
كلوريد الصوديومميرك ميليبورS7653يمكن استخدامه من مصادر
أخرى كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتسيجما ألدريتشM2393
كبريتات المغنيسيومسيجما ألدريتشM2643
كلوريد الأمونيومسيجما ألدريتشA9434
تريس بیس
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتش   ؛D8418
(5- (و 6-) كربوكسي فلوريسين ثنائي الأسيتات إستر السكسينيميديل (CFSE) المجساتالجزيئيةC-1157إعادة التكوين في DMSO
Phorbol 12،13-dibutyrate (PBDU ، Phorbol ester)Sigma AldrichP1269
A23187 (أيونوفور الكالسيوم)Sigma AldrichC7522
Name< / strong>Company< / strong> <قوي>رقم الكتالوجتعليقات
> الأجسام المضادة والبروتين المؤتلف
CD11b البيوتين (استنساخ m1 / 70)Biolegend101204كوكتيل استنفاد الخلايا
التائية CD11c البيوتين (استنساخ N418)Biolegend117304كوكتيل استنفاد الخلايا
التائية Gr-1 البيوتين (استنساخ RB6-8C5)كوكتيل Biolegend108404استنفاد الخلايا التائية
Ter119 البيوتين (استنساخ Ter119) Biolegend116204كوكتيل استنفاد الخلايا
التائية TCR-& جاما ؛ & دلتا. البيوتين (استنساخ GL-3)Biolegend118103كوكتيل استنفاد الخلايا التائية
CD19 البيوتين (استنساخ 6D5)Biolegend115504كوكتيل استنفاد الخلايا التائية
B220 البيوتين (استنساخ RA3-6B2)Biolegend103204كوكتيل استنفاد الخلايا التائية
CD49b البيوتين (استنساخ DX5)Biolegend108904كوكتيل استنفاد الخلايا التائية
CD4 البيوتين (استنساخ GK1.5)Biolegend100404كوكتيل استنفاد الخلايا
التائية CD8 البيوتين (استنساخ 53-6.7)كوكتيل استنفاد الخلايا التائيةBiolegend100704
F (ab')2 ماعز مضاد للفأر IgM (لوحة مطلي)Jackson ImmunoResearch 115-006-07550 & micro; لتر / بئر للطلاء (96 بئر)
مضاد للفأر CD40 مللي أمبير (مطلي بالألوان)Pharmingen & nbsp ؛55372250 & ميكرو; لتر / بئر للطلاء (96 بئر)
المؤتلف IL-4ProSpec   ؛Cyt-282
LPS من الإشريكية القولونية النمط المصلي 055: B5Sigma AldrichL-4005
Anti-CD3 (استنساخ استنساخ OKT3) (لوحة مطلية)eBioscience   ؛16-0037-8550 & مايكرو; لتر / بئر للطلاء (96 بئر)
مضاد ل CD28 (استنساخ استنساخ 37.51) (مطلي بالألوان)eBioscience   ؛16-0281-8550 & مايكرو ؛ لتر / بئر للطلاء (96 بئر)
المؤتلف IL-2ProSpecCyt-370
الألبومين من بياض بيض الدجاج ، OvalbuminSigma AldrichA7641
الأبقار مصفاة الخلايا m منها <

المراجع

  1. Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
  2. LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
  3. Brownlie, R., Zamoyska, R. T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound. Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).
  4. Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells. J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).
  5. Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).
  6. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
  7. Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit. J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).
  8. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765(2013).
  9. Su, I., et al. Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement. Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).
  10. Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance. Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).
  11. Rush, J. S., Hodgkin, P. D. B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation. Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).
  12. Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  13. Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  14. Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  15. Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CFSE
العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.