يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فحص مضان القائم من الفوسفوليبيدية Scramblase آخر

13.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54635

⸱

سبتمبر 20, 2016

 , 
1Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College

في هذه المقالة

ملخص

نصف الاختبار القائم على التألق لقياس تدافع الدهون الفوسفورية في الجسيمات الشحمية أحادية الصفيحة الكبيرة المعاد تشكيلها باستخدام opsin.

الملخص

Scramblases نقل من الدهون الفوسفاتية عبر طبقة ثنائية الغشاء الاتجاهين بطريقة مستقلة اعبي التنس المحترفين. وscramblase الأولى أن يكون تحديد وكيميائيا التحقق وأوبسين، في صميم بروتيني من رودوبسين مبصرة. رودوبسين هو مستقبلات البروتين يقترن-G المحلية في قضيب مبصرة الأغشية القرص من شبكية العين حيث أنها مسؤولة عن إدراك الضوء. النشاط scramblase رودوبسين للا تعتمد على يجند لها 11- رابطة الدول المستقلة -retinal، أي أوبسين صميم بروتيني كما تنشط باعتباره scramblase. على الرغم من التأسيسية وينظم فوسفورية الهرولة تلعب دورا هاما في علم وظائف الأعضاء الخلية، تم التعرف على عدد قليل فقط scramblases فوسفورية حتى الآن إلى جانب أوبسين. نحن هنا وصف مقايسة على أساس مضان النشاط scramblase أوبسين ل. وأعيد أوبسين في الجسيمات الشحمية unilamellar كبيرة تتألف من فسفاتيديل، phosphatidylglycerol وكمية ضئيلة من الفلورسنت وصفت دبي الوطني PC (1-صalmitoyl-2- {6- [7-نيترو-2-1،3-benzoxadiazole-4-YL) الأمينية] hexanoyl} - SN -glycero-3-phosphocholine). يتم تحديد النشاط Scramblase من خلال قياس مدى جزيئات دبي الوطني-PC الموجود في النشرة الداخلية للحويصلة قادرة على الوصول إلى النشرة الخارجية حيث يتم التخلص مضان من كيميائيا من قبل وكيل الحد الذي لا يمكن عبور الغشاء. الطرق وصفنا لها تطبيق عموما، ويمكن استخدامها لتحديد وتوصيف الأنشطة scramblase للبروتينات غشاء الأخرى.

المقدمة

رودوبسين مستقبلة للضوء، وهو نموذج أولي G البروتين يقترن مستقبلات (مراجعة على سبيل المثال، في اشارة 1)، هو أول scramblase فوسفورية الكشف عن هويته والتحقق منها كيميائيا 2،3. Scramblases هي النقل فوسفورية التي تزيد من بطء في جوهرها من transbilayer حركة فوسفورية على الناحية الفسيولوجية المستويات الملائمة في ثنائي الاتجاه، بطريقة ATP مستقلة 4-6. أمثلة من تصرفاتهم يمكن العثور عليها في الشبكة الإندوبلازمية وغشاء هيولي البكتيرية التي تحتاج إلى الهرولة التأسيسي للتوازن الغشاء والنمو، فضلا عن مجموعة متنوعة من مسارات بالغليكوزيل 5. فوسفورية ينظم الهرولة هناك حاجة لفضح فسفاتيديل (PS) على سطح الخلايا أفكارك حيث أنه بمثابة "أكل لي" -signal لالضامة 7 و يوفر سطح محفز التخثر على الصفائح الدموية تنشيط لتحفيز إنتاج بروتين عاملق اللازمة لتخثر الدم. في مبصرة الأغشية القرص، وقد اقترح النشاط الهرولة رودوبسين لمواجهة الخلل فوسفورية بين اثنين من منشورات غشاء من طبقة ثنائية التي يتم إنشاؤها من قبل لاعبي التنس المحترفين التي تعتمد، الدهن أحادي الاتجاه flippase ABCA4 4،8،9 10-12.

وعلى الرغم من أهمية الفسيولوجية للscramblases، وظلت هويتهم بعيد المنال حتى أفيد رودوبسين باعتباره scramblase في أقراص مستقبلة للضوء 2، تم تحديد أعضاء الأسرة البروتين TMEM16 كما كا 2+ scramblases معتمد على الحاجة للتعرض PS في غشاء البلازما (مراجعة في إشارة 13)، واقترح البروتين البكتيري FtsW باعتباره الدهن الثاني scramblase المطلوبة لتخليق ببتيدوغليكان 14. واستندت هذه الاكتشافات على إعادة تشكيل تنقية البروتينات في الجسيمات الشحمية ومظاهرة من النشاط scramblase في proteoliposomes الناتجة باستخدام describ منهجيةإد هنا. scramblases إمكانات أخرى 15-21 - البروتينات MurJ وAMJ المتورطين في التركيب الحيوي ببتيدوغليكان، WzxE والبروتينات ذات الصلة المتورطين في الهرولة السلائف-O مستضد، البروتين منتدى مادهيسي اللازمة لنقل من phosphatidylglycerol aminoacylated عبر غشاء هيولي البكتيرية، وأفراد الأسرة Xkr8 أنه قد أقترح لفضح PS على سطح الخلايا أفكارك - لا يزال يتعين اختبار كيميائيا. هذا يسلط الضوء على أهمية فحص قوية لتحديد وتوصيف النشاط scramblase.

هنا، نحن تصف إعادة تشكيل أوبسين النقي، وصميم بروتيني من رودوبسين مبصرة، إلى الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs)، وتحليل لاحقة من النشاط scramblase في proteoliposomes الناتجة باستخدام مقايسة على أساس مضان. وهناك العديد من البروتوكولات وصفها جيدا المتاحة في الأدب للتعبير مغاير وتنقية أوبسين، وبالتالي فإننا لن وصف في هذا البروتوكول. نستخدم البروتوكولات المذكورة في غورين وآخرون. (3) الذي ينتج العلم الموسومة، أوبسين بالحرارة بنحو 100 نانوغرام / ميكرولتر في 0.1٪ (ث / ت) dodecylmaltoside (DDM).

ويتحقق إعادة بواسطة علاج LUVs مع المنظفات كافية بحيث تنتفخ ولكن لا تذوب. في ظل هذه الظروف، وهو بروتين الغشاء - المتوفرة في شكل المذيلات البروتين المنظفات - والاندماج في الجسيمات الشحمية وتصبح أعاد في غشاء الحويصلية على إزالة المنظفات، مما أدى إلى proteoliposomes. لإعادة أوبسين (تم الحصول عليها من البروتين النقي في 0.1٪ (ث / ت) DDM)، يتم إعداد LUVs من خليط من POPC (1-بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine) وPOPG (1- بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3- [الفوسفات-rac- (1-الجلسرين)]) ومشبعة DDM قبل إضافة أوبسين وبنك دبي الوطني-PC. ثم تتم إزالة المنظفات عن طريق التعامل مع عينة مع الخرز البوليسترين.

معشوقة = "jove_content"> ويظهر المبدأ الأساس لفحص القائم على مضان في الشكل 1B. وأعيد LUVs بشكل متناظر مع كمية ضئيلة من بنك دبي الوطني-PC أو غيرها المسمى دبي الوطني، مراسل فوسفورية فلوري (الشكل 1A). على إضافة dithionite، يتم تخفيض على غشاء impermeant dianion، يتم تقديم جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الخارجية للLUVs غير الفلورسنت كما نيترو-مجموعة بنك دبي الوطني إلى الأمينية مجموعة غير الفلورسنت. كما لا الجزيئات دبي الوطني-PC ولا dithionite قادرة على اجتياز الغشاء على المدى الزمني للتجربة (<10 دقيقة)، وهذا يؤدي إلى تخفيض 50٪ من إشارة الفلورسنت. ومع ذلك، إذا تم إعادة تشكيل الجسيمات الشحمية مع scramblase، جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الداخلية يمكن أن يتبارى بسرعة إلى الخارج حيث تقوم بتقليل. وهذا يؤدي إلى فقدان تام للمضان في حالة مثالية (الشكل 1C).

وفاق / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. الشكل 1: تمثيل تخطيطي لفحص النشاط scramblase يستخدم فحص والمسمى دبي الوطني الفلورسنت مراسل الدهنية؛ ويرد دبي الوطني-PC (A). وأعيد الحويصلات unilamellar كبيرة مع كمية ضئيلة من بنك دبي الوطني-PC. إعادة تنتج الحويصلات متماثل، مع بنك دبي الوطني-PC موزعة بالتساوي في منشورات الخارجي والداخلي. Dithionite (S 2 O 4 2-) يقلل كيميائيا نيترو مجموعة بنك دبي الوطني إلى الأمينية مجموعة غير الفلورسنت. علاج الجسيمات الشحمية خالية من البروتين مع dithionite (ب، أعلى) يؤدي إلى تخفيض 50٪ من مضان فقط منذ جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الخارجي يتم تخفيض: تم شحن dithionite سلبا ولا يمكن عبور الغشاء لتتفاعل مع جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الداخلية. العلاج Dithionite من proteoliposomes التي تحتوي على أوبسين (B، أسفل)، أي proteoliposomes-scramblase نشط، والنتائج في فقدان 100٪ من وluorescence كما أوبسين يسهل حركة بنك دبي الوطني-PC بين الداخلية والنشرة الخارجية. (C) ويظهر آثار مضان المثالية الحصول على علاج الجسيمات الشحمية خالية من البروتين وproteoliposomes التي تحتوي على أوبسين مع dithionite. معدل فقدان مضان هو نفسه في الحالتين يشير إلى أن تخفيض الكيميائية دبي الوطني dithionite هو معدل الحد، والتي تسعى جاهدة يحدث بمعدل يساوي أو أكبر من معدل التفاعل الكيميائي. وتظهر آثار الحصول عليها من تجربة الفعلية في الشكل (3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الطرق وصفنا يمكن استخدامها لإعادة بناء ومقايسة تنقية البروتينات الأخرى، فضلا عن خليط من البروتينات الغشاء تم الحصول عليها، على سبيل المثال، عن طريق استخراج microsomes ل مع المنظفات 22.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الليبوزومات وProteoliposomes

  1. الحويصلية تشكيل
    1. باستخدام حقنة زجاجية، إضافة 1،435 ميكرولتر POPC (25 ملغ / مل، في الكلوروفورم) و 160 POPG ميكرولتر (25 ملغ / مل، في الكلوروفورم) إلى قارورة أسفل جولة للحصول على 52.5 مكرومول الدهون في نسبة المولي من POPC: POPG = 9: 1.
    2. تجفيف الدهون لمدة 30 دقيقة باستخدام المبخر الدوار في سرعة دوران 145 دورة في الدقيقة (لا حاجة لحمام الماء لهذا الحجم من المذيبات)، ثم نقل القارورة إلى مجفف فراغ لا يقل عن 3 ساعة، أو بين عشية وضحاها، في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. هيدرات الفيلم الدهون المجففة مع 10 مل من 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4، 100 مم كلوريد الصوديوم (المشار إليه فيما عازلة أ) من قبل يحوم بلطف القارورة حتى متجانسة، والنتائج تعليق العكرة.
      ملاحظة: تركيز الدهون في هذه المرحلة ومن المتوقع أن يكون 5.25 ملي كما لا خسائر ينبغي أن يكون حدث حتى الآن.
    4. يصوتن تعليق في حمام مائي لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تردد سو 40 كيلو هرتز. فإن الحل يبدو أكثر وضوحا إلى حد ما.
    5. باستخدام الطارد، تمرير تعليق 10 مرات من خلال الغشاء مع حجم المسام 400 نانومتر، تليها المرحلة الثانية من قذف مع 4 تمريرات من خلال الغشاء مع حجم المسام 200 نانومتر.
      ملاحظة: متوسط ​​قطر LUVs الناتج هو ~ 175 نانومتر. إذا لزم الأمر، وحجم وتجانس LUVs يمكن فحصها من قبل الحيوي تشتت الضوء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    6. قياس تركيز فوسفورية من تعليق LUV كما هو موضح في القسم 1.2).
      ملاحظة: نظرا للخسائر خلال البثق، وتركز عادة حوالي 3.6 ملي.
    7. تخزين LUVs في 4 درجة مئوية لمدة حوالي 2 أسابيع إن لم يكن استخدامها على الفور.
  2. الكمي فوسفورية
    ملاحظة: لتحديد تركيز فوسفورية من تعليق LUV المستخدمة لإعادة تشكيل، وكذلك من proteoliposomes التي يتم إنشاؤها في نهاية المطاف، قسامة من العينة subjeالإدارة التنفيذية للأكسدة حمض البيركلوريك. هذا الإجراء ينهار الدهون الفوسفاتية للافراج عن الفوسفات غير العضوية التي يتم بعد ذلك كميا عن طريق فحص اللونية في المقارنة مع المعايير 23.
    1. يعد حل 40 ملي الأسهم من فوسفات الصوديوم (نا 2 هبو 4) في الماء المقطر منزوع الأيونات.
    2. تمييع الحل الأسهم مع الماء المقطر منزوع الأيونات للحصول على 4 ملم و 0.4 ملم الحلول التي ستكون بمثابة معايير المعايرة العمل.
    3. باستخدام حلول العمل، وإعداد المعايير في 13 أنابيب × 100 مم 2 كوب تتراوح 0-80 نانومول فوسفات الصوديوم في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر.
    4. يستغرق 10 ميكرولتر كل من العينات LUV وproteoliposome أن يكون كميا وتمييع مع 40 ميكرولتر من ده 2 O في 13 أنابيب × 100 مم 2 الزجاج.
      ملاحظة: كما في تركيز الدهون من LUVs وproteoliposomes هو في حدود 2.5-5 ميكرومتر، 10 ميكرولتر من العينة يجب أن يحتوي على 25-50 نانومول الدهون الفوسفور.
    5. إضافة حمض 300 ميكرولتر البيركلوريك إلى كل من المعايير والعينات والحرارة لمدة 1 ساعة على 145 درجة مئوية في كتلة التدفئة. وضع الرخام على الأنابيب لمنع التبخر.
    6. السماح للأنابيب بارد لدرجة حرارة الغرفة وإضافة 1 مل من ده 2 O.
    7. إضافة 400 ميكرولتر من كل الطازجة 12 غ / كربونات الأمونيوم L و 50 جرام / لتر أسكوربات الصوديوم ودوامة لخلط.
    8. الحرارة لمدة 10 دقيقة في 100 درجة مئوية مع الرخام على أعلى الأنابيب. إزالة الأنابيب من كتلة التدفئة والسماح لهم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
    9. قياس الامتصاصية من العينات ضد فارغة (عينة القياسية التي تحتوي على 0 نانومول فوسفات الصوديوم) مع مطياف عند طول موجي 797 نانومتر.
    10. تحديد محتوى الفوسفات من عينات ضد منحنى المعايرة القياسية.
  3. إعادة تشكيل أوبسين
    ملاحظة: من الضروري تحديد شروط تورم المثلى لإعادة وهذه تعتمد على طبيعة المنظفات، وكذلككما تكوين الدهون وتركيز LUVs. كما LUVs تغيير خصائص تشتت الضوء على تورم عملية يمكن رصدها من خلال قياس الامتصاصية (الشكل 2) على النحو الذي استعرضه ريغو وليفي 24 و Geertsma وآخرون. 25.
    1. ماصة 800 ميكرولتر من LUVs (من القسم 1.1؛ والانتعاش الدهون بعد قذف هو 70٪، وتركيز المتوقع من LUVs 3.6 ملي فوسفورية) في أنبوب microfuge 2 مل.
    2. إضافة 5.3 ميكرولتر من العازلة وو 34.7 ميكرولتر من 10٪ (ث / ت) DDM حل في المخزن A.
    3. احتضان لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة مع نهاية الإفراط في نهاية الاختلاط.
    4. وفي الوقت نفسه إعداد الخرز البوليسترين:
      1. استخدام 400 ملغ من الخرز لكل عينة ووزن لهم في كوب زجاجي.
      2. غسلها مرتين مع الميثانول، ثلاث مرات بالماء ومرة ​​واحدة مع العازلة A. للحصول على كل استعمال خطوة الغسيل 5 مل من السائل ويحرك ببطء لمدة 10 دقيقة.
        ملاحظة: من المستحسن لإعداد البوليسترينحبات لعدة عينات في وقت واحد، على سبيل المثال، في وزن 6 غرام من الخرز ويغسل مع 75 مل من السائل. حبات الزائدة يمكن تخزينها في الثلاجة لعدة أيام.
    5. خلال 30 دقيقة الماضي من زعزعة الاستقرار حويصلة تجفيف فوسفورية المسمى بنك دبي الوطني في أنبوب المسمار سقف زجاجية ( "إعادة أنبوب زجاجي '): لكل عينة، 9.5 ميكرولتر من بنك دبي الوطني-PC (1 ملغ / مل في الكلوروفورم، مما أسفر عن 0.4 مول٪ من إجمالي الدهون الفوسفاتية) يتم تجفيفها تحت تيار من النيتروجين في أنبوب زجاجي وحلت في وقت لاحق في 45 ميكرولتر من 0.1٪ (ث / ت) DDM في المخزن A.
    6. بعد 3 ساعات من زعزعة الاستقرار الحويصلة تضاف فوسفورية المنحل-دبي الوطني المسمى، البروتين DDM-بالفاعلات وعازلة بحيث الحجم النهائي من 1 مل يحتوي على 0.36٪ (ث / ت)، أي 7 ملم، DDM.
      1. وهكذا، لتوليد الجسيمات الشحمية خالية من البروتين (المستخدمة كعينة مراقبة) إضافة 45 ميكرولتر من بنك دبي الوطني-PC (المنحلة في 0.1٪ DDM)، 60 ميكرولتر من 0.1٪ DDM و 55 ميكرولتر من العازلة A؛ لproteoliposomes إضافة للامتحانسبيل، 40 ميكرولتر من البروتين (من محلول المخزون نموذجي من ~ 110 نانوغرام / ميكرولتر) في 0.1٪ DDM، 45 ميكرولتر من بنك دبي الوطني-PC (حل في 0.1٪ DDM)، و 20 ميكرولتر من 0.1٪ DDM و 55 ميكرولتر من العازلة لل .
        ملاحظة: ترتيب بالإضافة يجب على النحو المبين.
    7. خلط العينة لانهاء ساعة إضافية خلال نهاية في درجة حرارة الغرفة.
    8. إضافة 80 ملغ من الخرز البوليسترين المعدة واحتضان العينة مع نهاية الإفراط في نهاية خلط لمدة 1 ساعة على RT.
    9. التالي إضافة 160 ملغ إضافي من الخرز البوليسترين واحتضان مع نهاية الإفراط في نهاية خلط ل2 ساعة إضافية في RT.
    10. نقل العينة (ترك الخرز البوليسترين قضى خلف) إلى أنبوب زجاجي المسمار الحد الأقصى تحتوي على 160 ملغ من الخرز البوليسترين الطازجة وتخلط بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: أسهل طريقة لنقل العينة وتجنب امتصاص الخرز هو استخدام ماصة باستير أن يتم الضغط على الجزء السفلي من أنبوب زجاجي مع ضغط إيجابي يذكر. مرة واحدة غيض من ماصة هو راسخ فيالجزء السفلي من الأنبوب، ثم عينة يمكن سحب بسهولة دون تدخل من الخرز.
    11. في صباح اليوم التالي، ونقل العينة إلى أنبوب microfuge دون تحمل اكثر من الخرز ومكان على الجليد تمهيدا لفحص النشاط scramblase.

2. Scramblase آخر الفحص

ملاحظة: كثافة مضان من الجسيمات الشحمية أو proteoliposomes المخفف مع العازلة ويتم رصد مرور الوقت على إضافة dithionite في مطياف مضان. للحصول على كثافة بدءا مستقرة، يتم تسجيل مضان لا يقل عن 50 ثانية (أو حتى يتم التوصل إلى إشارة مستقرة) قبل أن يضيف dithionite على عينة أثار باستمرار ومن ثم يتم متابعتهم لمدة لا يقل عن 500 ثانية بعد إضافة dithionite.

  1. إضافة 1950 ميكرولتر من العازلة ألف إلى كفيت بلاستيكية تحتوي على ميني ضجة بار.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من PROTEO استعداد (الجسيمات الشحمية)، والسماح للعينة يوازن في الطيف مضانمتر مع التحريك المستمر لعدة ثوان.
  3. وفي الوقت نفسه يعد حل من 1 M dithionite في 0.5 M غير مصقول تريس (على سبيل المثال، لعينتين تزن من 20 ملغ من dithionite في أنبوب microfuge وتذوب في 114 ميكرولتر الجليد الباردة 0.5 M تريس مباشرة قبل الاستخدام والحفاظ على الجليد لالمقبل عينة).
    ملاحظة: يجب أن يكون مستعدا الحل dithionite الطازجة ولا ينبغي أن تستخدم أكثر من 20 دقيقة بعد الإعداد؛ إذا العديد من القياسات ليكون، aliquots من dithionite يمكن أن يكون وزنه في وقت مبكر وحل الحق قبل الاستخدام.
  4. بدء رصد مضان (الإثارة 470 نانومتر، وانبعاث 530 نانومتر، شق العرض 0.5 نانومتر).
  5. إضافة 40 ميكرولتر من الحل dithionite 1 م إلى كفيت 50 ثانية بعد بدء مضان تسجيل (استخدام الحاجز في غطاء غرفة كفيت إن أمكن) والاستمرار في تسجيل مضان ل400-600 ثانية أخرى.
  6. تحليل البيانات كما هو موضح في القسم 3.

3.تحليل البيانات

  1. حركية الجهاد
    1. تميز أثر مضان من كل عينة التي حصل عليها النشاط فحص scramblase من خلال تحديد مضان الأولي، F ط، قبل إضافة dithionite، ومضان نقطة النهاية، F، وصلت بعد> 400 ثانية. يتم تحديد F ط لكل عينة حيث بلغت قيمة متوسط ​​مضان لفترة 30 ثانية قبل إضافة dithionite.
    2. تحديد البيانات نقطة النهاية المقابلة لمدى انخفاض مضان، R = 100 • F / F ط. نحن نستخدم المصطلحات R L لالجسيمات الشحمية خالية من البروتين وR P لproteoliposomes التي تحتوي على أوبسين.
  2. تحديد الوزن الجزيئي للوظيفيا المعاد Scramblase
    1. تحويل البيانات للحد من مضان وفقا للمعادلة التالية:
      ص (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R ماكس - R L) (المعادلة 1)
      ملاحظة: أين R الحد الأقصى هو الحد الأقصى للتخفيض التي يتم الحصول عليها عند إعادة تشكيل ما يكفي من البروتين مثل هذا أن جميع الحويصلات في العينة تمتلك scramblase وظيفي واحد على الأقل، و p هو احتمال أن حويصلة خاصة في عينة تشكيلها هو 'scramblase نشط، أي أنها تمتلك scramblase وظيفي واحد على الأقل. قيمة R L هو عادة 45٪ 3 في حين R الحد الأقصى هو عادة 82.5٪ 3، بدلا من المتوقع 100٪ (يمكن تجريبيا لproteoliposomes أوبسين مع طاعون المجترات الصغيرة من> 1 ملغ / مليمول R ماكس). كما R ماكس <100٪ فمن المفترض أن شبه السكان من الحويصلات هو صهر لإعادة. لR الحد الأقصى = 82.5٪، ونسبة من الحويصلات التي لا يستطيع قبول البروتين هو 0.35.
    2. وصف العلاقة بين ص (≥1 scramblase) وطاعون المجترات الصغيرة (ملغ من البروتين / مليمول فوسفورية) من خلال إحصاءات بواسون على النحو التالي:
      ص (≥1 scramblase) = 1 - ه -m = 1 - إكسب (-PPR / α) (المعادلة 2)
      ملاحظة: أين م = عدد scramblases في الحويصلة وα = أحادية الأسي مناسبا ثابت في وحدات ملغ فوسفورية بروتين / ملمول.
    3. كما لا يسهم جزء من الحويصلات إلى الهرولة حتى في طاعون المجترات الصغيرة عالية (انظر المناقشة)، تعديل المعادلة إلى:
      ص (≥1 scramblase) = 1 - إكسب (-PPR * / α) (المعادلة 3)
      ملاحظة: أين طاعون المجترات الصغيرة * = طاعون المجترات الصغيرة / (1- و)، حيث f هو السكان الحرارية من الحويصلات، أو في هذه الحالة، طاعون المجترات الصغيرة * = طاعون المجترات الصغيرة / 0.65 (المعادلة 4).
      ملاحظة: يتم تحديد α ثابت مناسبا من المناسب على الرسم البياني للص (≥1 scramblase) مقابل طاعون المجترات الصغيرة * مع وظيفة أحادية الأسي. إذا أوبسين (الوزن الجزيئي 41.7 كيلو دالتون) reconstitutes وظيفيا إلى الحويصلات 175 نانومتر القطر (كل حويصلة ديها 280،000 الفوسفورية 26) كما مونومر، α = 0.187 ملغ مليمول -1. إذا dimerizes أوبسين قبل إعادة 3 لانتاج الحويصلات scramblase النشط، ثم α= 0.37 ملغ مليمول -1. إذا كانت طاعون المجترات الصغيرة بدلا من طاعون المجترات الصغيرة * لاستخدامها في التحليل، ثم القيم ألفا المقابلة ستكون 0.122 و 0.244 ملغ مليمول -1. تفترض هذه القيم المتوقعة للα أن جميع الجزيئات أوبسين هي المختصة وظيفيا. ولو جزء بسيط من جزيئات غير أكفاء لتغيير معالم الدهون، ثم القيم المناظرة من α سيكون أكبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وصفنا إعادة تشكيل أوبسين إلى LUVs لوصف النشاط scramblase وذلك باستخدام مقايسة على أساس مضان. نحن تحليل النتائج لوضع الحد الأدنى لمعدل فوسفورية بوساطة أوبسين الهرولة ولتحديد حالة بلازميدة قليلة القسيمات التي أوبسين reconstitutes وظيفيا إلى الحويصلات.

لتحديد شروط إعادة الأمثل، فإنه من الضروري تحديد تجريبيا كمية من المنظفات التي يجب أن تستخدم لتضخيم L...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

فحص النشاط scramblase مكنتنا أصلا لتحديد ما أوبسين ديه فوسفورية النشاط scramblase 2. يسمح فحص لنا أيضا لوصف النشاط scramblase أوبسين عن طريق اختبار خصوصية (كنا مجموعة متنوعة من الدهون مراسل المسمى دبي الوطني مثل بنك دبي الوطني فسفاتيديل إيثانولامين، وصفت مع بنك دبي الوطني على سلسلة أسيل كما هو مبين لبنك دبي الوطني-PC في الشكل 1A، أو على headgroup، بنك دبي الوطني، سفينغوميالين أو NBD- فسفاتيديل 2)، وتأثير حويصلة تكوين الدهون (على سبيل المث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة Velux Stiftung (A.K.M.) و EY024207 منحة المعاهد الوطنية للصحة (AKM) ومشروع الصندوق النمساوي للعلوم (FWF) J3686 (B.P.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1-بالميتويل -2-أوليويل <م > SN < / م > جلسيرو -3-فوسفوكولينأفانتي القطبية الدهون850457CPOPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn< / em>-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (ملح الصوديوم)AvantiPolar Lipids840457CPOPG
1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1،3-benzoxadiazol-4-yl) أمينو] hexanoyl}-sn< / em>-glycero-3-phosphocholineأفانتي بولر ليبيدات810130CNBD-PC
4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمضVWR ScientificEM-5330هيبس
كلوريد الصوديومسيجماS7653-1KGكلوريد الصوديوم
دوديسيل-بيتا -D-مالتوسيدأناترايسD310 5 جمDDM
فلوريمتر كوفيتسيجماC0918-100EAكوفيت
مقياس الطيف فلوريفوتون تكنولوجي إنترناشيونالالفلور
هيدروكبريتيت الصوديوم الصف التقني ، 85٪Sigma157953-5Gdithionite
GraphPad Prism 5 softwarePrism Tris
BaseVWRJTX171-3Tris
LIPEX 10 ml extruder شركة Northern Lipids، Inc.الطارد
Whatman ، قرص التصريف ، PE ، 25 ممSigma28156-243دعم القرص
Whatman Nuclepore Track-Strhed Membranes ، 0.4 & micro ؛ م ، قطر 25 ممسيجماWHA110607غشاء 400 نانومتر
أغشية Whatman Nucleopore Track-Stred ، 0.2 & micro ؛ م ، قطر 25 ممسيجماWHA110606غشاء
فوسفات الصوديومSigmaS3264-500G
VWR أنابيب الثقافة ، يمكن التخلص منها ، زجاج البورسليكات ، 13 × 100 ممVWR Scientific47729-572أنابيب زجاجية حمض
البيركلوريكSigma30755-500ML
الأمونيوم موليبدات رباعي الهيدراتSigmaA-7302موليبدات الأمونيوم
(+) - الصوديوم L-ascorbateSigmaA7631-25Gأسكوربات الصوديوم
Bio-Beads SM2 الماصاتRad1523920حبات البوليسترين
  ؛ 2.0 مل Microtubes ClearVWR Scientific10011-742إعادة التكوين أنابيب
إعادة التكوين أنبوب زجاجيVWR Scientific53283-800إعادة تكوين الأنابيب الزجاجية
Zetasizer   ؛مالفيرن DLS
مقياس Bio

المراجع

  1. Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
  2. Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
  3. Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115(2014).
  4. Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).
  5. Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an' what's the reason for? ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
  6. Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
  7. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
  8. Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925(2012).
  9. Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
  10. Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
  11. Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
  12. Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
  13. Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
  14. Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
  15. Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
  16. Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
  17. Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
  18. Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
  19. Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
  20. Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
  21. Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
  22. Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
  23. Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
  24. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  25. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
  26. Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
  27. Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367(2013).
  28. Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
  29. Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
  30. Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
  31. Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
  32. Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
  33. Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

NBD PC G
فحص مضان القائم من الفوسفوليبيدية Scramblase آخر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.