يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين

29.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54640

⸱

أكتوبر 21, 2016

 ,  , 
1Departamento de Química de Biomacromoléculas, Instituto de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México

في هذه المقالة

ملخص

تفاعلات البروتين هي في صميم وظيفة الخلية. وتستخدم تقنيات مقياس الكالوري والطيفية عادة لوصف لهم. نحن هنا وصف تباين مضان كأداة لدراسة التفاعل بين البروتين تحور في متلازمة شوان دايموند (SBDS) والاستطالة عامل مثل 1 GTPase (EFL1).

الملخص

تفاعلات البروتين البروتين دورا أساسيا في وظيفة الكائن الحي. مرة واحدة تم التعرف على التفاعل والتحقق من صحتها من الضروري أن نصنفها على المستوى الهيكلي والميكانيكي. وتوجد العديد من الطرق الحيوية والفيزيائية الحيوية لهذا الغرض. من بينها، مضان تباين هي تقنية قوية تستخدم بشكل خاص عندما تبقى كثافة مضان من البروتين المسمى fluorophore ثابتة على التفاعل البروتين البروتين. في هذه التقنية، وهو بروتين المسمى fluorophore هو متحمس مع الضوء المستقطب عموديا من الطول الموجي المناسب أن يثير انتقائي مجموعة فرعية من fluorophores وفقا لتوجه النسبي مع شعاع واردة. لديه الانبعاثات الناتجة أيضا الاتجاهية التي تعرف تباين (ص) العلاقة في الطائرات العمودية والأفقية على النحو التالي: ص = (أنا VV -I VH) / (أنا VV + 2I VH)، حيث كنت VV وأنا

المقدمة

الخلايا تحتوي على العديد من الجزيئات الكبيرة التي تتفاعل باستمرار مع بعضها البعض. هذا الارتباط يثير المجمعات التي تشارك في مسارات الخلوية المسؤولة عن عملها في نقل الإشارة، وتنظيم التعبير الجيني وهجرة الخلايا وغيرها. تشمل جميع التفاعلات البروتين البروتين التي تحدث في خلية شبكة تعرف باسم interactome. في خميرة الخباز وقد تبين أن أكثر من 70٪ من البروتينات لدينا شركاء التفاعل 1. فهم interactome من خلية وتوفير وظائف لهم المعلومات ذات الصلة على مدى تعقيد وتنوع الكائنات الحية. وقد وصفت عدة منهجيات لتحديد وتوصيف التفاعلات البروتين البروتين. تختلف عالية من خلال طرق وضع مثل الخميرة اثنين الهجين 2، البروتين جزء المقايسات تكامل 3، تقارب تنقية 4 بالإضافة إلى قياس الطيف الكتلي وmicroarra البروتينتستخدم يس لتحديد التفاعل 5،6. وبمجرد تحديدها، فمن الضروري التحقق من صحة ذلك، وهذا قد تختلف على أساس كل حالة على حدة. عادة، هذه التجارب تنطوي على تعطيل التفاعل نفسه في مستوى أفراد الزوج التفاعل، على سبيل المثال، عن طريق حذف الجينات أو overexpression من واحد من البروتينات، وبعد ذلك تبحث عن التغيرات في خصائص أو وظيفة عضو آخر في المستوى الخلوي. وفي وقت لاحق، وتستخدم التقنيات الفيزيائية الحيوية 7 لوصف التفاعل البروتين البروتين على المستوى الجزيئي. تحقيقا لهذه الغاية، ويتم تحديد بنية البروتين المجمعات التي كتبها البلورات بالأشعة السينية، الرنين المغناطيسي النووي والفحص المجهري البرد الإلكترون في حين تستخدم الكالوري ومضان الطيفي لكميا وميكانيكيا وصفها.

في هذا العمل، وقد استخدم مضان تباين كأسلوب لوصف التفاعل بين GTPase EFL1 وSBDS البروتين. تشارك هذه البروتينات في تركيب الريبوسومات من خلال تشجيع إطلاق سراح حقيقية النواة عامل بدء 6 من سطح 60S الوحيدات الريباسي 8. وتحور البروتين SBDS في المرض المعروف باسم Shwachman الماس متلازمة 9 و بمثابة عامل الصرف جوانين النوكليوتيدات لEFL1 انخفاض تقارب من أجل غوانوزين ثنائي فسفات 10،11. الطفرات المرض في SBDS تلغي التفاعل مع EFL1 وبالتالي تمنع تفعيله.

يستخدم مضان تباين شيوعا في التطبيقات البيولوجية لدراسة بروتين الببتيد أو تفاعلات حمض البروتين النووي. لأنه يقوم على مبدأ أن fluorophore منتهى السعادة لعودته وكانت النتائج الضوء المستقطب في انبعاث الاستقطاب جزئيا. ويعرف تباين مضان من المعادلة 1:

figure-introduction-1

حيث أنا VV وأنا VH هيشدة مضان من عموديا (VV) وأفقيا (VH) الاستقطاب الانبعاثات عند العينة هو متحمس مع الاستقطاب عموديا ضوء 12. مضان تباين حساسة للعوامل التي تؤثر على معدل انتشار التناوب من fluorophore ويعتمد على درجة الحرارة، واللزوجة من الحل وحجم الجزيئي واضح من fluorophore الآن. حجم واضح من البروتين تحتوي على زيادات fluorophore عندما يتفاعل مع بروتين آخر وهذا التغيير ومن ثم يمكن تقييمها على أنها تغير في الخواص المتباينة. وبشكل أكثر تحديدا، فإن fluorophore التي تدور ببطء في حل قريب لعمر الفلورسنت التي يكون لها قيمة أنا VV الكبيرة والصغيرة القيمة أنا VH وبالتالي ستعرض على تباين واسع نسبيا. لfluorophores أن تعثر بسرعة بالنسبة لحياتهم الفلورسنت، وأنا VV وأنا VH تكون مشابهة وسوف قيمة تباين على أن تكون صغيرة 12 > (الشكل 1). وبالإضافة إلى ذلك، إشارة تباين جيدة لقياس الضوضاء، فمن الضروري أن يكون هناك fluorophore مع عمر مضان مماثل للوقت ارتباط التناوب للجزيء من الفائدة. خلاف ذلك، فإنه ليس من الممكن أن يسجل بدقة الفرق في تباين بين البروتين مجانا وأنه في المجمع. على سبيل المثال، وتباين في تحقيق الفلورسنت مع عمر قريب من 4 NSEC مثل فلوريسئين أو رودامين تعلق على انخفاض الوزن الجزيئي مجمع 100 دا هو 0.05. ملزمة لجزيء من 160 كيلو دالتون وزيادة قيمة تباين ل0.29. الفرق التي يمكن قياسها بدقة. في المقابل، فإن نفس التحقيق الفلورسنت تشارك في رد فعل ملزم الذين الزيادة في حجم الجزيئي يختلف من 65 إلى 1000 كيلو دالتون يؤدي إلا إلى تغيير تباين من ،28-،3، التي هي صغيرة جدا بحيث لا يمكن قياسها بدقة. في هذا السيناريو، فإن التحقيق مع عمر من 400 NSEC أن يكون أكثر مناسبة 12.

الطبقة = "jove_content"> figure-introduction-2
الشكل 1. تمثيل تخطيطي من المعدات المستخدمة لقياس تباين مضان والإجراء. تمثيل تخطيطي من المعدات المستخدمة لإجراء البروتين البروتين التفاعل التجربة قياس تباين مضان. Fluorophores أن تعثر سريع عرض تباين الصغيرة التي يزيد عليها ملزمة لشريك التفاعل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تتطلب التطبيقات مضان وجود fluorophore في أي من الجزيئات التي شملتها الدراسة. لدراسة تفاعلات البروتين البروتين هناك ثلاثة أنواع من fluorophores: 1) بقايا التربتوفان موجودة في البروتينات، 2) fluorophores تعلق كيميائيا و 3) شركاء الانصهار فلوري مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وderiva لهاالأقارب. معظم البروتينات لها بقايا التربتوفان على هيكلها، وبالتالي فإن أسهل طريقة لقياس التفاعل هو عن طريق رصد التغيرات في أطياف مضان المقابلة أو عن طريق رصد التغيرات في كثافة مضان من بقايا التربتوفان. ومع ذلك، قد تكون بقايا التربتوفان الحالي في كل من البروتينات تعقيد التحليل. من ناحية أخرى، لfluorophore لتغيير خصائص فلوري لها بسبب التفاعل فإنه يحتاج إلى أن يكون موجودا على أو بالقرب من موقع ملزمة وأنها يمكن أن تتداخل مع التفاعل نفسها. هذا يحتاج إلى عناية خاصة عند استخدام fluorophores ضخمة مثل GFP. إذا كان أي من هذه fluorophores يمكن استخدامها لدراسات ملزمة من الضروري، بعد ذلك، إلى إدخال fluorophores خارجي إلى واحد من البروتينات ذات الصلة. وجود العديد من fluorophores تصنيعه كيميائيا ويمكن أن تعلق تساهمي للبروتينات من خلال مجموعاتهم التفاعلية مثل المجموعات أمين (سلسلة من الجانب lysines أو N-محطة) ومجموعة ثيول في السيستين. Fالمشتقات luorophore مع ثيوسيانات وsuccinimidyl استرات تتفاعل مع مجموعة أميد في حين iodoacetamide وmaleimide مجموعات ثيول-رد الفعل (13). الأصباغ الأكثر شيوعا في التطبيقات مضان هي مشتقات من فلوريسئين والأصباغ الخضراء رودامين، الكومارين، fluorophores BODIPY والأصباغ اليكسا فلور. ويمكن الاطلاع على قائمة مفصلة من fluorophores المتاحة تجاريا واستخدامها في المراجع 14،15. لوضع العلامات ناجحة، يجب أن تتعرض لمجموعة رد الفعل على سطح البروتين، ولكن نظرا لوجود عدد كبير من المجموعات الوظيفية على رد الفعل الحالية عادة في البروتينية من الصعب جدا الحصول على تعديل للموقع المحدد. البروتين من الاهتمام في هذه الدراسة، SBDS، ويحتوي على 5 cysteines مجانية و 33 lysines التي قد تؤدي إلى العديد من العلامات الموقع. وضع العلامات غير موحدة قد يؤثر على ملزمة وسيعقد تحليل البيانات والجزيئات fluorophore المختلفة قد تثير مختلفة إشارات كثافة الفلورسنت على ملزمة. لاوفهrcome هذه المشكلة، استخدمنا fluorophore فلاش، 4، 5'مكرر (1،3،2 dithioarsolan-2-YL) فلوريسئين لتسمية المباشر الموقع البروتين SBDS. هذا هو صبغ أرسينوكسيد مع قابلية عالية لمدة أربعة cysteines متباعدة في عزر تعرف باسم فلاش العلامة تتكون من CCXXCC تسلسل حيث X هو أي حمض أميني غير السيستين 16،17. يضاف هذا الحافز tetracysteine ​​إلى N- أو C-محطة من البروتين عن طريق الهندسة الوراثية جنبا إلى جنب مع رابط المناسبة لمنع اختلال أضعاف العام للبروتين. وقد تم تصميم هذا الزوج تتكون من فلاش صبغ وفلاش العلامة أصلا للبروتينات تسمية مواقع محددة في الخلايا الحية 17 ولكن يمكن أيضا أن تستخدم لتسمية تنقية البروتينات في المختبر كما يتجلى ذلك هنا. بالإضافة إلى ذلك، كما تم وضع استراتيجيات الأنزيمية لتمكين functionalization في مواقع محددة من البروتينات 18.

في هذه المخطوطة وصفنا فائدة مضان تباين لأداة سا لدراسة تفاعلات البروتين البروتين. ملزمة يمكن تقييمها عن طريق التفتيش بسيط من شكل منحنى ملزم بينما يمكن الحصول على معلومات كمية من نوبة من البيانات التجريبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. SBDS فلاش التعبير علامة البروتين وتنقية

ملاحظة: للحصول على التجارب تباين، ومضة العلامة المقابلة إلى السيستئين برو-الغليسين-السيستئين-السيستئين السيستئين تم إضافتها إلى C-محطة من SBDS البشرية تسلسل الترميز بواسطة PCR التسلسل. وقد subcloned هذا البناء في ناقلات التعبير pRSET-A وتحويلها إلى كولاي الخلايا C41 للتعبير عن بروتين ترميز علامة hexahistidine N-محطة (صاحب العلامة)، وSBDS البشرية تسلسل الترميز وسي صول بطاقة فلاش 10.

  1. تعبير البروتين SBDS فلاش
    1. تحويل E. المختصة خلايا القولونية C41 مع البلازميد pRSET-HisSBDS فلاش باستخدام معيار بروتوكول الصدمة الحرارية 19. لوحة الخلايا في لوريا، Bertani (LB) وسائل الاعلام الصلبة تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. يتكون LB تكوين وسائل الاعلام الصلبة من 10 غرام كلوريد الصوديوم، 5 ز خلاصة الخميرة، و 10 غرام تريبتون و 20 غ أجار لحجم 1 لتر.
    2. البكتيريا تتحول الثقافة عند 37 درجة مئوية حتىالامتصاصية في 600 نانومتر (A 600) يصل 0،5-0،7 في 1 لتر من LB السائلة وسائل الإعلام تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين.
    3. حمل بروتين تعبير بإضافة 0.5 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside للثقافة والاستمرار في حضانة لمزيد من 5 ساعة.
    4. جمع تعليق البكتيرية بواسطة الطرد المركزي في 3800 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف. عند هذه النقطة، إما تخزين بيليه خلية في -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لتنقية البروتين.
  2. تنقية البروتين SBDS فلاش
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الكروماتوغرافي باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة (FPLC) نظام بروتين سريع أو مضخة تحوي. يستخدم ني 2+ -affinity اللوني 5 مل العمود تدفق سريع. يستخدم اللوني الصرف انيوني 5 مل قوي sulfopropyl الموجبة العمود المبادلات. / تم استخدام معدل التدفق من 3 مل دقيقة لكافة الخطوات الكروماتوغرافي.
    1. resuspend الخلايا في 35 مل من SBDS تحلل بuffer (50 ملي الفوسفات عازلة درجة الحموضة 7.5، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 20 ملي ايميدازول) تستكمل مع 1 ملم phenylmethylsulfonyl فلوريد (PMSF) وليز صوتنة لفترة ما مجموعه 4 دقائق باستخدام دورات من 10 ثانية ON و 30 ثانية OFF، في 4 ° C.
    2. الطرد المركزي العينة في 9000 x ج لمدة 50 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    3. إبقاء طاف وتجاهل بيليه لإزالة الحطام الخلوي.
    4. تتوازن ني 2+ العمود تقارب مع 3 مجلدات العمود (CV) من SBDS تحلل العازلة وإدخال كله أوضح طاف على العمود.
    5. إزالة البروتين غير منضم عن طريق الغسيل مع 3 السيرة الذاتية لSBDS تحلل العازلة وأزل مع 3 السيرة الذاتية العازلة SBDS شطف (50 ملي الفوسفات عازلة درجة الحموضة 7.5، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 250 ملي ايميدازول).
    6. تمييع مزال البروتين 6 أضعاف مع 50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.5 وإزالة الركام الممكنة عن طريق الترشيح من خلال غشاء 0.22 ميكرون السليلوز.
    7. تتوازن العمود sulfopropyl الموجبة المبادلات مع 3 السيرة الذاتية لمنخفض الملح العمود Sالعازلة (50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.5، 50 ملي كلوريد الصوديوم) وإدخال عينة بروتين من الخطوة السابقة.
    8. غسل المواد غير منضم مع 3 السيرة الذاتية لمنخفض الملح S عازلة عمود وأزل البروتين في خطوة واحدة مع 50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.5، 1 M كلوريد الصوديوم.
    9. تمييع مزال البروتين 3.3 أضعاف مع 50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.5. تركيز البروتين مع أجهزة الترشيح الفائق بواسطة الطرد المركزي في 3800 x ج لمدة 15 دقيقة. فلاش تجميد البروتين في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
    10. التحقق من نقاء من البروتين عن طريق تحليل SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ 20.

2. EFL1 التعبير البروتين وتنقية

وأعرب عن EFL1 تحت تنظيم غال 10/01 المروج المتباينة 21 وخميرة الخباز MAT و3'UTR في pRS426 ناقلات: ملاحظة. البروتين المؤتلف بترميز EFL1 الإسوي الإنسان 1 تنصهر لفيروس البروتيني التبغ حفر (TEV) الموقع الاعتراف وعلامة hexahistidine في محطة سي.

  1. تعبير البروتين EFL1
    1. تحويل س. خلايا خميرة BCY123 مع البلازميد pRS426-EFL1TevHis باستخدام بروتوكول خلات ليثيوم معيار 22. لوحة كافة الخلايا تحولت في انخفاض الاصطناعية من وسائل الإعلام دون اليوراسيل (SD-URA) تستكمل مع 2٪ (ث / ت) الجلوكوز. تكوين وسائل الإعلام SD-URA تتكون من 8 ز قاعدة الخميرة النيتروجين دون الأحماض الأمينية، الأحماض 11 ز casamino، 55 ملغ الأدينين كبريتات، التيروزين 55 ملغ، ليسين 60 ملغ و 60 ملغ التربتوفان لحجم 1 لتر.
    2. ثقافة حولت الخميرة في 30 درجة مئوية حتى تصل إلى 600 1.8 في 1 لتر من وسائل الإعلام SD-URA تستكمل مع 0.5٪ (ث / ت) الجلوكوز.
    3. حمل بروتين تعبير بإضافة 2.8٪ (ث / ت) اللبن للثقافة والاستمرار في حضانة لمزيد من 18 ساعة على 30 درجة مئوية.
    4. جمع تعليق الخميرة عن طريق الطرد المركزي في 3800 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف.عند هذه النقطة، إما تخزين بيليه خلية في -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لتنقية البروتين.
  2. تنقية البروتين EFL1
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الكروماتوغرافي باستخدام نظام FPLC أو مضخة تحوي. يستخدم ني 2+ -affinity اللوني 5 مل العمود تدفق سريع في معدل التدفق من 3 مل / دقيقة. يستخدم حجم الإقصاء اللوني عمود 125 مل قبل معبأة مع Superdex 200 الراتنج بمعدل تدفق من 1 مل / دقيقة.
    1. resuspend الخلايا في 50 مل من EFL1 تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 20 ملي إميدازول 5 ملي MgCl 2، 10٪ الجلسرين) تستكمل مع 1 ملم PMSF و 1 ملي benzamidine وتعطيل الخلايا الاحتكاك على الخافق حبة باستخدام الخرز الزجاجي (ط = 0.5 ملم) لفترة ما مجموعه 6 دقيقة باستخدام دورات 2 دقيقة على و 15 دقيقة OFF، في 4 درجات مئوية.
    2. الطرد المركزي العينة في 9000 x ج لمدة 50 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    3. إبقاء طاف وتجاهل بيليه لإزالة الحطام الخلوي.
    4. تتوازن العمود تقارب ني 2+ مع 3 السيرة الذاتية لEFL1 تحلل العازلة وإدخال جميع طاف أوضح على العمود.
    5. إزالة البروتين غير منضم عن طريق الغسيل مع 3 السيرة الذاتية لEFL1 تحلل العازلة وأزل مع 3 السيرة الذاتية العازلة EFL1 شطف (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 250 ملي إميدازول 5 ملي MgCl 2، 10٪ الجلسرين).
    6. تتوازن العمود حجم الإقصاء مع 1.5 السيرة الذاتية العازلة تباين الخواص (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي MgCl 2، 10٪ الجلسرين، 5 ملي β-المركابتويثانول).
    7. التركيز إلى 1 مل البروتين EFL1 مزال من العمود تقارب ني 2+ مع أجهزة الترشيح الفائق بواسطة الطرد المركزي في 3800 x ج لحجم المطلوب. إدخال العينة على العمود حجم الإقصاء.
    8. جمع بروتين مزال والتركيز من قبل الفائق إلى تركيز النهائي من ما يقرب من 30 ميكرومتر. فلاش تجميد البروتين في النيتروجين السائل ومخزن في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. تحقق من عشرالبريد نقاء من البروتين عن طريق تحليل SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ 20.

3. صفها من SBDS فلاش مع فلاش صبغ نيون 4 "، 5'البس (1،3،2 dithioarsolan-2-YL) فلوريسئين

  1. مزيج 3 نانومول من البروتين SBDS فلاش مع 3 نانومول من 4، 5'مكرر (1،3،2 dithioarsolan-2-YL) صبغة فلوريسئين في حجم 5 ميكرولتر من العازلة تباين الخواص.
  2. دع رد فعل المضي قدما لمدة 8 ساعات في 4 درجات مئوية. Dialyze العينة ضد عازلة تباين الخواص أكثر من ليلة لإزالة الصبغة الحرة.
  3. استخدام القانون لامبرت-البيرة لقياس٪ من البروتين المسمى. قياس الامتصاصية في 280 نانومتر و 508 نانومتر في معمل باستخدام كوفيت الكوارتز من حجم مناسب. ملاحظة: النظر في معاملات امتصاص المولي التالية (M -1 سم -1):
    figure-protocol-1
  4. حساب تركيز البروتين المسمى SBDS فلاش باستخدام المعادلة 2.
    figure-protocol-2
  5. حساب تركيز البروتين الكلي SBDS باستخدام المعادلة 3 عن طريق استبدال المحسوب C SBDS فلاش من الخطوة السابقة.
    figure-protocol-3
  6. حساب نسبة البروتين المسمى باستخدام المعادلة (4).
    figure-protocol-4

4. التجارب الإسفار تباين الخواص

ملاحظة: تم القيام به التجارب تباين الخواص في الطيفي مجهزة تم تنفيذ مجموعة الأدوات الاستقطاب وبيانات باستخدام برنامج تباين المقدمة في البرنامج من المعدات. تم تعيين الطول الموجي الإثارة في 494 نانومتر مع عرض النطاق الترددي الطيفي لل8 نانومتر و تم تسجيل الانبعاثات باستخدام فلتر الفرقة تمريرة من 530 ± 25 نانومتر. وقد أجريت القياسات عند 25 درجة مئوية في كوفيت 200 ميكرولتر مع 5 ملم طول الطريق 10.

  1. في كفيت مضان، وضع 200 ميكرولتر من 30 نانومتر SBDS فلاش العازلة في تباين ويعاير 2 ميكرولتر من EFL1 30 ميكرومتر. تخلط جيدا وترك رد فعل الوقوف لمدة 3 دقائق قبل قياس قيمة تباين.
  2. تمت إضافة كرر الخطوة 4.1 حتى الحجم الكلي لل40 ميكرولتر من EFL1.

تحليل 5. البيانات

  1. احتواء البيانات للنموذج ملزم المناسب باستخدام غير الخطية أقل خوارزمية الساحات الانحدار. وتعرض المعادلات لنماذج ملزمة الأكثر شيوعا في الجدول 1.
  2. تقييم أفضل نموذج يصف التفاعل بين البروتينات عن طريق فحص المخلفات لائقا 23. دعم النموذج المختار مع تجارب إضافية.

الجدول 1. نماذج المشترك تفاعل البروتين البروتين ملزمة والمعادلات الرياضية التي تصف لهم.0 / 54640table1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.
figure-protocol-5

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إجراء أية تجربة تباين من المهم استبعاد تغييرات كبيرة في كثافة مضان من fluorophore منذ يتم تمثيل تباين الملحوظ من خليط من الأنواع من المعادلة 5:

figure-results-1

حيث F ط يمثل مضان ك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

معظم التجارب الكيميائية الحيوية مع البروتينات تتطلب ليس فقط من البروتين النقي ولكن أيضا على كميات كبيرة منها، بغض النظر عن التقنية المستخدمة. لهذا السبب، يتم الحصول على البروتينات المستخدمة لهذا النوع من التجارب التي كتبها تعبير مغايرة، كما كان الحال المقدمة هنا. تنوير الطيفي يتطلب وجود fluorophore في جزيء درس. بقايا العطرية تشكل fluorophores الجوهرية للبروتين، ولكن، وذلك باستخدام إشارة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين يعقد التحليل، إذ أنها شائعة في معظم البروتينات، وسوف يكون حاضر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه وليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون

بالدعم المالي المقدم من أرقام مشاريع CONACyT 167359 و 177138 ، ومن مشروع DGAPA-UNAM رقم IN201615.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 مم خرز زجاجيBiospec Products11079105
Tris BaseFormediumTRIS01صبغة فائقة
النقاء من الجلسرينسيجما-ألدريتشG5516
4'، 5'-bis (1،3،2 dithioarsolan-2-yl) fluoresceinThermoFischer ScientificLC6090تحتوي هذه المجموعة على الصبغة لتسمية علامة FlAsH
AmpicilineIBI Shelton Scientific, IncIB02040
D (+) -الجلوكوز اللامائيللمتوسطGLU03
D (+) -GalactoseFormediumGAL03
L-LeucineFormediumDOC0157
L-Tryptofan   ؛فورميدDOC0189
بيزاميدين هيدروكلوريدسيجما-ألدريتشB6506-5G
PMSFالذهب للتكنولوجيا الحيوية، شركةP-470-25فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد
NaClفورميدNAC02كلوريد الصوديوم  
GlycerolTecsiquim, S.A. de C.V.GT1980-6
MgCl 2< / sub>شركة Merck MilliporeCorporation 1725711000كلوريد المغنيسيوم
إيميدازولسيجما ألدريتشI2399-500G
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250-100ML
K2< / sub>HPO4< / sub>Sigma-AldrichP3786-500Gفوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة
NaH2< / sub>PO4< / sub>Sigma-AldrichS3139-500Gفوسفات الصوديوم أحادي القاعدة
قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينيةمستخلصCYN0410
من أجل متوسطYEM03حبيبات
L-TyroisneلمتوسطDOC0193
كبريتاتالأدينينFormediumDOC0230
أحماض الكازامينوFormediumCAS03
TryptoneIBI Shelton Scientific، IncIB49182
IPTGFormediumIPTG025
وحدات الترشيحMerck Millipore CorporationUFC901096Amicon Ultra-15 ، membrana PLGC Ultracel-PL ، 10 & nbsp ؛ kDa
مرشح غشاءشركة ميرك ميليبورGSWP04700مرشح غشاء ، استرات السليلوز المختلطة ، ماء ، 0.22 & nbsp ؛ ومايكرو. م ، 47   ؛ مم ، أبيض ، عادي
Ni2 + < / sup> عمود التقاربQIAGEN30760خرطوشة مملوءة مسبقا مع 5 & nbsp ؛ مل Ni-NTA Superflow
قوي سلفوبروبيل الكاتيون مبادل العمودGE Healthcare Life Science17-5157-01HiTrap SP Sepharose FF 5 مل
حجم عمود الاستبعادGE Healthcare LifeScience 28989335HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
خلية مضانHellma Analytics111-057-40
مقياس الطيفالضوئي Agilent TechnologiesG6860AAكاري 60 UV-Vis
شاكرThermoFischer ScientificSHKA4000-7MaxQ 4000 نطاق درجة حرارة Benchtop Ambient-15 درجة ؛ إلى 60 درجة ؛ C
أجهزة الطرد المركزيThermoFischer Scientific75004271Heraeus Megafuge 16R
FPLCPharmacia Biotech توقفموصلية نظام FPLC الأشعة فوق البنفسجية MM II مراقب P500 مضخة جزء
الطيف الفلوريOlisلا يمكن تطبيقهOlis DM 45 مع صندوق أدوات الاستقطاب
الخميرة المتوسطة دقيق

المراجع

  1. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
  2. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
  3. Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
  4. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  5. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).
  6. Snider, J., et al. Fundamentals of protein interaction network mapping. Mol Syst Biol. 11 (12), 848(2015).
  7. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).
  8. Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).
  9. Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).
  10. Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).
  11. Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).
  12. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Third, Springer US. (2010).
  13. Nishigaki, T., Treviño, C. L. Tools to understand protein-protein interactions. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).
  14. Johnson, I. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).
  15. Sabnis, R. W. Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. , Wiley. (2015).
  16. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  17. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  18. Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).
  19. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  20. Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
  21. West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).
  22. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
  23. Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
  24. Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).
  25. Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).
  26. Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).
  27. Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
  28. Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
  29. Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

SDS PAGE
تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.