يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصور المراحل المبكرة من البلعمة

16.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54646

⸱

فبراير 3, 2017

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health & Science University, 2Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نصف هنا تقنية قائمة على المجهر لتصور وتحديد الشلالات المبكرة للأحداث أثناء البلعمة لمسببات الأمراض مثل الفطريات المبيضات البيضاء والجسيمات التي يزيد حجمها عن 0.5 ميكرومتر بما في ذلك الخرز الزيموزان والمغلفة ب IgG.

الملخص

وقد تم تجهيز جسم الثدييات مع طبقات مختلفة من الآليات التي تساعد على الدفاع عن نفسها من الغزوات الممرض. البالعات المهنية للنظام المناعي - مثل العدلات، والخلايا الجذعية، والضامة - تحتفظ القدرة الفطرية لكشف ومسح هذه الجراثيم الغازية من خلال البلعمة 1. تتضمن البلعمة الأحداث فشلت في إعادة تنظيم الغشاء وإعادة الأكتين على سطح الخلية 2 و 3. البالعات استيعاب بنجاح والقضاء على الجزيئات الغريبة فقط عندما يتم استيفاء جميع مراحل البلعمة. وتشمل هذه الخطوات الاعتراف وملزمة من مسببات المرض عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) المقيمين على سطح الخلية، وتشكيل كوب أكلة من خلال نتوءات غشائي التخصيب الأكتين (pseudopods) لتطويق الجسيمات، وانفصال من يبلوع تليها النضج يحلول يبلوعي أن النتائج فيمقتل الممرض 3 و 4.

التصوير النوعي والكمي لمراحل مختلفة من البلعمة هو أساسي لتوضيح الآليات الجزيئية لهذه العملية الخلوية. المخطوطة تقديم تقارير طرق لدراسة مختلف مراحل البلعمة. نحن تصف النهج القائم على المجهر لتصور وتحديد، تشكيل كوب أكلة ملزم، واستيعاب الجسيمات من قبل البالعات. كما تحدث البلعمة عندما مستقبلات الفطرية على الخلايا البلعمية تواجه بروابط على الجسيمات الهدف أكبر من 0.5 ميكرون، والمقايسات نقدم هنا تشمل استخدام الفطريات المسببة للأمراض المبيضات البيض وغيرها من الجسيمات مثل زيموزان وحبات مغلفة مفتش.

المقدمة

وعلى الرغم من التعرض المستمر لمسببات الأمراض مثل البكتيريا والفيروسات والفطريات، وأجسامنا مجهزة تجهيزا جيدا مع الآلية المناعية التي توفر الحماية ضد العدوى. نظام المناعة الفطري هو خط الدفاع الأول ضد الجراثيم الغازية ويعتمد أساسا على الخلايا البلعمية التي تعترف واستيعاب اهداف اجنبية.

البلعمة هي عملية الخلوية الحفاظ تطويريا الذي يشمل ابتلاع الجسيمات غير المرغوب فيها أكبر من 0.5 ميكرون. الخلايا البلعمية تعبر عن مجموعة واسعة من مستقبلات المناعة (المعروف أيضا باسم مستقبلات التعرف على الأنماط، PRRs) على سطح الخلية التي تمكنهم من التعرف على الأنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs) موجودة على مسببات الأمراض قبل الغمر 3. الممرض ويتبع ملزمة من قبل تجمع مستقبلات على سطح الخلية ويطلق تشكيل كوب البلعمة. وهذا يؤدي إلى يحركها الأكتين يعيد الغشاء الذي يبرز حولالهدف، في نهاية المطاف يغلف ذلك ومعسر النعاس، لتشكل منفصلة phagosomal فجوة 2، 5. ويبلوع ثم ينضج والخواص الحمضية الانصهار لاحق مع أواخر الإندوسومات والجسيمات الحالة التي تشكل يحلول يبلوعي 6.

على الرغم من أن يوصف البلعمة كما بوساطة مستقبلات ويحركها الأكتين الحدث، وهذه العملية تعتمد أيضا على تعديل المكانية والزمانية من الدهون التي تشكل غشاء البلازما، مثل phosphoinositides (حزب القانون والعدالة)، والإسفنجية 7 و 8. في حين تمليه البلمرة أكتين من قبل تراكم المحلي phosphoinositol-4،5-biphosphate (PI (4،5) ف 2) في قاعدة الكأس أكلة، الأكتين التحلل يعتمد على تحويل (PI (4،5) ف 2 إلى كل من التعديلات phosphoinositol-3،4،5-biphosphate (PI (3،4،5) ف 3) 3 و 9.لا غنى عنها كما يؤدي السابقة للتمديد الناجح لpseudopods حول الهدف وهذا الأخير تمكن غرق الجزيئات في العصارة الخلوية للبلعمية 10.

الخلايا التي لديها القدرة في phagocytose إما البالعات المهنية، مثل الضامة / حيدات، والمحببة / العدلات، والخلايا الجذعية (DCS) أو البالعات غير مهني، مثل الخلايا الليفية والخلايا الظهارية 11. البلعمة التي يقوم بها كل البالعات تلعب دورا مركزيا في صيانة الأنسجة وإعادة عرض، في حين البلعمة التي يقوم بها البالعات المهنية هي المسؤولة عن تنسيق الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية ضد مسببات الأمراض. البالعات المهنية لا فقط يغمر وقتل الممرض، ولكن أيضا المستضدات الموجودة على الخلايا اللمفاوية في الجهاز المناعي التكيفي. هذا يساهم في الإفراج عن السيتوكينات الموالية للالتهابات وإلى إشراك الخلايا اللمفاوية، وبالتالي يؤدي إلىالحصار الناجح لإصابة 12.

وقد تقنيات الكيمياء الحيوية التقليدية دورا أساسيا في اكتساب المعرفة حول الآلية الجزيئية من العمليات الخلوية المختلفة خلال البلعمة، مثل التعديلات بعد متعدية ومختلف الجمعيات عالية تقارب بين البروتينات. ومع ذلك، فمن الصعب الحصول على معلومات بشأن ديناميات المكانية والزمانية لأحداث أكلة باستخدام الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية. الخلية الحية التصوير ليس فقط يسمح لنا لرصد الأحداث الخلوية بطريقة حساسة الوقت ولكن أيضا تمكننا من الحصول على معلومات على مستوى خلية واحدة. نحن هنا تصف طريقة للتحقيق في مراحل مختلفة من البلعمة، وكذلك لتحليل العملية برمتها spatiotemporally باستخدام متحد البؤر المجهري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد خطوط 264.7 خلية DC2.4 و RAW

ملاحظة: خط الخلية مثل بلعم RAW 264.7 وشجيري DC2.4 خط الخلية على حد سواء أصل الفئران، واستخدمت الشروط التالية لزراعة الخلايا.

  1. تنمو الخام 264.7 الخلايا في DMEM (الحد الأدنى المتوسطة النسر Dulbecco و) تستكمل مع 10٪ المعطل الجنين مصل بقري (FBS) عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2.
  2. زراعة خلايا DC2.4 في ظروف مماثلة مع أن من الخام 264.7 الخلايا، باستثناء استخدام المتوسطة RPMI (معهد روزويل بارك التذكاري) تستكمل مع L-الجلوتامين بدلا من DMEM.

2. إعداد نيون مترافق الجسيمات: الخرز جيم البيض، زيموزان، مفتش المغلفة

  1. تزايد المبيضات البيض
    1. تطعيم C. المبيضة البيضاء سلالة SC5314 من المخزون الجلسرين المجمدة في 25 مل من YPD تستكمل مع أوري (2٪ Bacto-ببتون، 1٪خلاصة الخميرة، 2٪ الجلوكوز و 80 ميكروغرام / مل يوريدين) بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
      ملاحظة: تجنب تنامي ثقافة المبيضات أكثر من OD 600 من 12.
    2. خذ 1 مل من C. المبيضة البيضاء وتدور عليه في 2000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. نضح طاف وإعادة تعليق بيليه مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    4. جمع بيليه بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. كرر الخطوة 2.1.4.
    6. حساب وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من C. المبيضة البيضاء فيما يتعلق بعدد الخلايا البالعة والمضي قدما في فحص البلعمة كما هو موضح في القسم 3. إن OD 600 من 1 ما يعادل 2.5 × 10 7 المبيضات البيض في 1 مل.
      ووصف جيل من المبيضات، حزب الحرية، في اشارة 13: ملاحظة.
  2. إعداد زيموزان والخرز المغلفة مفتش-
    ملاحظة: زيموزان هو β-جلوكان التي تحتوي علىالفطرية إعداد الكربوهيدرات الجسيمات تلك المستمدة من خميرة الخباز. ومن المعروف زيموزان لاستحضار إشارات التهاب في الضامة والخلايا الجذعية، واستخدمت على نطاق واسع في الدراسات البلعمة 13 و 14 و 15.
    1. لفترة وجيزة دوامة الأنبوب الذي يحتوي على جسيمات، وقسامة، وهو مبلغ كاف لتجربة في أنبوب 1.5 مل.
      ملاحظة: عادة نستخدم 01:10 نسبة (لخلية واحدة، إضافة 10 الجسيمات زيموزان أو حبات مغلفة مفتش).
    2. إضافة 1 مل من الجليد PBS الباردة، وجمع الجزيئات بواسطة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10000 ز س.
    3. نضح طاف و resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني 1 مل الجليد الباردة.
    4. كرر الخطوات 2.2.2-2.2.3
      ملاحظة: انتقل إلى الخطوة 2.2.5 أو تخزين أنبوب في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    5. يصوتن الجسيمات لمدة 10 ثانية في sonicator حمام بالموجات فوق الصوتية (120 V، 50-60 كيلو هرتز) وذلك لتجنبنيويورك الجسيمات التجميع.

3. البلعمة

ملاحظة: البلعمة هي عملية معقدة تبدأ مع ربط جزيئات على سطح خلية من الخلايا البالعة من خلال تفاعل PRRs مع بروابط على سطح الجسيمات. ويتبع ملزمة من قبل الجمعية العامة للالأكتين والبروتينات المرتبطة بها في موقع التماس، وتشكيل كوب البلعمة. يحدث التفكيك الأكتين لاحق في يبلوع والنتائج في الإحاطة الكاملة للجسيمات. أدناه وصفنا مختلف مراحل البلعمة.

  1. ملزمة الفحص
    ملاحظة: إن الغرض من هذه التجربة لمراقبة الخطوة الأولى من البلعمة التي تنطوي على التفاعل بين بروابط على الجزيئات المستهدفة والمستقبلات على البالعات.
    1. البذور حوالي 5 × 10 4 خلايا في شريحة الغرفة بحيث تكون 60-70٪ متكدسة في وقت التجربة. Alternatively، وخلايا لوحة على زلات غطاء (في 24- أو شكل 12 أيضا) أو لوحات 96-جيدا أسفل الزجاج. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2.
      يمكن عدها الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو تقنية مشابهة: ملاحظة.
    2. ضع الشريحة الغرفة (أو لوحة) في 10 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    3. إزالة بلطف المتوسطة من كل بئر باستخدام ماصة أو الشافطة.
      تنبيه: تنفيذ هذه الخطوة بعناية حيث أن كل بئر من نظام ساترة غرف صغيرة. فمن السهل أن التشويش على الخلايا مع غيض من ماصة أو تيار قوي من الشافطة.
    4. مزيج من الجسيمات fluorescently المسمى مع خلية ثقافة المتوسط ​​(أعد كما هو موضح أعلاه). إضافة المبيضات -BFP (في وزارة الداخلية من 10)، fluorescently مترافق-زيموزان أو اللاتكس الخرز أرنب مفتش-FITC (10 جسيمات لكل خلية) إلى الخلايا. استخدام الحجم النهائي من 200 ميكرولتر وسائل الاعلام لغرفة واحدة كذلك لضمان تغطية جميع الخلايا.
    5. تدور باستمرار الشريحة غرفة في 277x ج لمدة 3 دقائق في 10 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه الخطوة الطرد المركزي يساعد على زيادة الاتصال بين الجسيمات والخلايا، وذلك بالتزامن عملية الربط.
    6. على الفور نقل الشريحة غرفة إلى حاضنة ترطيب 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق.
    7. إزالة الشريحة الغرفة من الحاضنة ونضح وسائل الإعلام.
    8. غسل الخلايا 3X مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: تحقق من وجود جزيئات غير منضم مع مجهر الضوء وغسل أكثر من مرة مع برنامج تلفزيوني إذا لزم الأمر. ومن الضروري إزالة الجزيئات غير منضم من البئر للحد من الضوضاء الخلفية أثناء التحليل.
    9. إصلاح الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني التي يحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: هذه الخطوة يتطلب استخدام PFA 4٪ وهي عالية السمية، تآكل، ومادة مسرطنة محتملة. وينبغي اتخاذ الحذر المناسب عند استخدام هذا السائل. أيضا، حماية عينات من الضوء.
    10. غسل الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في غرفة ونضح الحل بلطف.
    11. كرر 3.1.9 الخطوة مرتين.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، إعادة ملء القنينة الواحدة فورا بعد إزالة برنامج تلفزيوني السابق.
    12. وقف التثبيت التي يحتضنها مع 500 ميكرولتر من 50 ملي NH 4 الكلورين في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
    13. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 3.1.10.
    14. Permeabilize الخلايا بإضافة 250 ميكرولتر العازلة ملزمة (0.1٪ سابونين، 0.2٪ في جيش صرب البوسنة PBS) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    15. وصمة عار F-الأكتين عن طريق إضافة phalloidin مترافق fluorescently (المخفف 1: 500 في المخزن ملزمة). احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    16. غسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 3.1.10.
    17. التقاط الصور باستخدام المجهر متحد البؤر (الهدف 63X، و 402 نانومتر و 488 نانومتر ليزر) وتحليل الصور باستخدام يماغيج 16.
      ملاحظة: الجسيمات الناجح يتميز ملزمة من قبل وجود مكعب أكلةp في الموقع حيث الاتصال الجسيمات الخلية البلعمية (الشكل 1). راجع الخطوة 3.2.5.
  2. البلعمة امتصاص الفحص
    ملاحظة: تم تصميم هذه التجربة لمراقبة استيعاب كامل من الجسيمات التي fluorescently المسمى البالعات باستخدام المجهر متحد البؤر (الشكل 2).
    1. البذور حوالي 5 × 10 4 خلايا في شريحة الغرفة بحيث تكون 60-70٪ متكدسة في وقت التجربة. بدلا من ذلك، وخلايا لوحة على زلات غطاء (في 24- أو شكل 12 أيضا) أو لوحات 96-جيدا أسفل الزجاج. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2.
      يمكن عدها الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو تقنية مشابهة: ملاحظة.
    2. الحفاظ على الشرائح غرفة (أو لوحة) في 10 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: التبريد هو ضروري من أجل منع الإلتقام وكذلك البلعمة غير المرغوب فيها، وبعد ذلك الحصول على البلعمة متزامنة.
    3. الأداء الإقتصادي الأداءخطوات مكتب إدارة السجلات من 3.1.3 إلى 3.1.5
    4. نقل الشريحة الغرفة إلى 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2، واحتضان للحصول على نقاط زمنية مختلفة. إصلاح الخلايا بعد الإصابة 30، 60 و 90 دقيقة بعد. مراقبة جيم البيض تبدأ في تشكيل خيوط في آخر إصابة 60 دقيقة. تبدأ الخلايا البالعة لإظهار موت الخلايا (pyroptosis) بعد 90 دقيقة 8.
      ملاحظة: هذا هو التوصية، والأمثل هو ضروري اعتمادا على نوع من الخلايا والجسيمات المستخدمة.
    5. تنفيذ الخطوات من 3.1.7 إلى 3.1.15. تحليل الصور باستخدام يماغيج 16.
      ملاحظة: تتميز امتصاص الناجحة التي قام بها لاستيعاب كامل من الجسيمات داخل السيتوبلازم من بلعمية (الشكل 2). تلطيخ الخلايا البالعة مع علامة سطح الخلية مثل phalloidin يساعد على رسم كفاف من الخلايا. ومن الضروري لأداء ض أكوام من أجل أيضا لتحديد ما إذا كان لا بد من الجسيمات إلى سطح الخلية أو مجمعات للالمنضوية etely.
  3. تصوير لايف البلعمة
    ملاحظة: في هذا البروتوكول وصفنا استخدام الميكروسكوب متحد البؤر لالتقاط مختلف مراحل البلعمة باستخدام زيموزان مترافق fluorescently. نحن نستخدم خط الخلية شجيري DC2.4 التي تعبر عن مستقر الموسومة mCherry-F-الأكتين 8، جهاز الاستشعار البيولوجي الذي يظهر توزيع الأكتين الخيطية في الخلايا الحية. منذ البلعمة هي عملية يحركها الأكتين والتصوير الحي في هذه الخلية تمكن ليس فقط لنا لالتقاط حركة وديناميكية الشبكة F-أكتين، ولكن أيضا لتصور أحداث مختلفة أكلة داخل الخلايا الحية (الشكل 3، فيلم 1).
    1. البذور حوالي 5 × 10 4 خلايا في شريحة غرفة بتركيز بحيث تكون 60-70٪ متكدسة في وقت التجربة. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2.
      يمكن عدها الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو ملاحظة:تقنية مماثلة.
    2. الحفاظ على الشرائح غرفة على الجليد لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: التبريد هو ضروري من أجل منع امتصاص غير المرغوب فيها، والحصول على البلعمة متزامنة.
    3. تنفيذ الخطوات من 3.1.3 إلى 3.1.5
    4. قبل تدفئة المرحلة المجهر إلى 37 درجة مئوية، وتتوازن الغرفة مع 5٪ CO 2. الانتظار 30-45 دقيقة لدرجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 في الاستقرار قبل بدء التصوير.
      ملاحظة: منذ CO 2 ودرجة الحرارة مستويات بالغة الأهمية بالنسبة لالبلعمة، فمن المهم لتشغيل سخان المجهر قبل التجربة لكي تتوازن الغرفة البيئية.
    5. ضع الشريحة غرفة تحتوي على خلايا في العلبة المجهر حاضنة معايرتها عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
    6. أداء التصوير الحي 17 و 18.
      ملاحظة: إعدادات لقوة الليزر (ربح، الثقب، وما إلى ذلك) يمكن أن تختلف تبعا لنوع من الالبريد المجهر والتحقيق الفلورسنت استخدامها. ولذلك، فإننا نوصي التشاور دليل المجهر للحالة المثلى لتصوير حي لديك 17،18.
      1. استخدام متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر (والبرامج المرتبطة بها) لتصوير حي. استخدام الهدف النفط 63X 1.4NA مع الثقب من 1-1،1 حدات إيري.
      2. لبدء التصوير، واستخدام الحقل مشرق للعثور على منطقة تمثيلية على الشريحة الغرفة. بعد ذلك، حدد الحقل عن طريق النقر على خيار الوظيفة على البرنامج. للكشف عن GFP في المسار 1 استخدام مجموعة تصفية 488 نانومتر ليزر مع الخائن شعاع في 582 نانومتر، للكشف عن الموجات بين 488 و 582 نانومتر.
      3. في المسار 2 اختيار مرشح وضع الأمثل لmCherry (RFP) باستخدام الحزمة الخائن في 578 نانومتر، والكشف عن موجات بين 578 و 600 نانومتر. استخدام 488 نانومتر و 578 نانومتر ليزر مع قوة الليزر 50٪ وانتاج كسب 600-700. الحصول على الصور كل 30 ثانية ليصبح المجموع 90 دقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وتقدم طريقة القائم على المجهر لمراقبة مختلف مراحل البلعمة. وأظهرت أحداث مختلفة خلال البلعمة من مختلف الجسيمات الفلورسنت من الخلايا DC2.4. استخدام الأساليب المذكورة هنا، ونحن التحقيق في دور الإسفنجية في المراحل المبكرة من البلعمة. لهذا الغرض، DC2.4 الخلايا الجذعية ناقصة وراثيا في Sptlc2، الإنزيم الذي يحفز الخطوة الأولى والحد من معدل في مسار السكروز الشحميات السفينغولية، استخدمت. بالمقارنة مع خلايا نوع البرية، Sptlc2 - / - خلايا DC2.4 خفضت بشكل كبير مستوى الإسفنجية بما في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

البالعات المهنية، مثل الضامة والخلايا الجذعية، تبتلع، والقضاء على غزو الجراثيم مما يجعل البلعمة عنصرا هاما من نظام دفاع المضيف. وخلال هذه العملية البالعات تخضع إعادة تنظيم الغشاء واسعة النطاق وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي في سطحها خلية 8، 19، 20. من أجل فهم أفضل هذه العملية الحيوية، وتصور مختلف مراحل البلعمة أمر ضروري. نحن هنا وصف طريقة القائم المجهر الذي تم استخدامه لمراقبة مختلف مراحل البل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر ويندي السلمون ونيكي واتسون للمنشأة كيك في معهد وايتهيد من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا للتصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
β-MercaptoethanolAppliChemA1108
ألبومين مصل الأبقار (BSA)تقنية إشارات الخلية 9998
DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، Dilactate) ThermoFisherD3571
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ThermoFisherBP-231-1
DMEM (Dulbecco' s الحد الأدنى من النسر s متوسط)Gibco11965
PBS ، 1x (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)Corning cellgro21-031-CV
مصل الأبقار الجنينيSigma Aldrich12003C
حبات اللاتكس المطلية ب IgG المقترنة ب FITCكايمان500290
L-Glutamine 200 ملم (100x)محلول ThermoFisher25030081
Paraformaldehyde (4٪ في PBS)Affymetrix19943 1 LT
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)ThermoFisher15-140-122< / a>
Phalloidin-Alexa Fluor 488ThermoFisherA12379
RAW 264.7 خلاياATCCTIB-71
RPMI (معهد روزويل بارك التذكاري)Gibco61870
SaponinSigma AldrichS7900
محلول تريبان الأزرق (0.4٪ (وزن / حجم) في PBS)Corning cellgroMT25900CI
Trypsin-EDTA (1x) (0.05٪)ThermoFisher25300054
Tween 20 محلول منظف Surfact-AmpsThermoFisher  85114
Zymosan-Alexa Fluor 594ThermoFisherZ23374
1.0 نظام غطاء زجاجي من البورسليكات (8 غرف)ThermoFisher155361
شريحة زجاجية 10 مع شبكاتHycor87144

المراجع

  1. Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).
  2. Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).
  3. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  4. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
  5. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).
  6. Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
  7. Botelho, R. J., et al. Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis. J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).
  8. Tafesse, F. G., et al. Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans. PLoS Pathog. 11, e1005188(2015).
  9. Kwik, J., et al. Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin. PNAS. 100, 13964-13969 (2003).
  10. Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis. BBA. 1851, 805-823 (2015).
  11. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).
  12. Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).
  13. Strijbis, K., et al. Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages. PLoS Pathog. 9, e1003446(2013).
  14. Li, X., et al. The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance. Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).
  15. Esteban, A., et al. Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages. PNAS. 108, 14270-14275 (2011).
  16. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).
  17. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).
  18. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
  19. Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
  20. Jaumouille, V., et al. Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering. Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).
  21. Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).
  22. Forestier, C. L. Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis. Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).
  23. John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii. Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

المجهر البؤريصبغ F-actinامتصاص الزيموزانالتصوير الحيالمبيضة البيضاء (Candida albicans)خلايا DC 2.4إعادة تشكيل الأكتينارتباط الجسيماتتحليل ImageJ
تصور المراحل المبكرة من البلعمة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.