مقالة منهجية

إجراء ميكانيكي بسيط لإنشاء الحوفي نقص الخلايا الجذعية في الفأر

DOI:

10.3791/54658

⸱

نوفمبر 17, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Illinois at Chicago

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنص المادة التالية سهلة وتقنية استنساخه لخلق فعالية نموذج الفأر المستدام للالحوفي نقص الخلايا الجذعية (LSCD). هذا نموذج حيواني مفيد في اختبار ومقارنة فعالية من العلاجات لأمراض الخلايا الجذعية الحوفي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحوفي نقص الخلايا الجذعية (LSCD) هو حالة من عطل أو فقدان الخلايا الجذعية الظهارية الحوفي، وبعد ذلك يتم استبدال ظهارة القرنية مع الملتحمة. المرضى الذين يعانون من عيوب المتكررة القرنية، الألم والالتهاب، وفقدان الرؤية.

سابقا، وقد وصفت نموذج الفئران من LSCD وبالمقارنة مع اثنين من نماذج أخرى. وكان الهدف هو إنتاج نموذج الفأر ثابت من LSCD أن كلا يحاكي النمط الظاهري في البشر وتستمر لفترة كافية لتجعل من الممكن لدراسة الفيزيولوجيا المرضية المرض وتقييم علاجات جديدة. هنا، يتم وصف هذه التقنية في مزيد من التفاصيل.

وقد تم تصميم أداة الآلية مع لدغ الدورية لإزالة الصدأ حلقات من سطح القرنية أو لتسهيل السرير الظفرة في المرضى. وهو جهاز مناسبة لإنشاء نموذج LSCD المطلوب. وهي متوفرة بسهولة، وسهلة الاستخدام وأداة مع طرف على ما يرام التي تجعلها مناسبة للعمل على عيون صغيرة، كمافي الفئران. تطبيقه يمنع الصدمات النفسية التي لا داعي لها للعين وأنها لا تؤدي إلى إصابات غير المرغوب فيها، في كثير من الأحيان هو الحال مع نماذج إصابة الكيميائية. وعلى عكس مكشطة حادة، فإنه يزيل ظهارة مع الغشاء القاعدي. في هذا البروتوكول، ومتآكل المنطقة الحوفي مرتين، وبعد ذلك تم حلق ظهارة القرنية بأكملها من حوف إلى حوف. لتجنب الإصابة سدى، والحرص على عدم فرشاة سطح القرنية بمجرد إزالة ظهارة بالفعل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مطلوب ظهارة القرنية للحفاظ على وضوح وسلامة القرنية. يتجدد باستمرار طوال الحياة عن طريق الخلايا الجذعية الظهارية المقيمين في واحد حوف منطقة ضيقة عند تقاطع القرنية والملتحمة. هذه الخلايا الجذعية الحوفي تجديد الذات تلعب دورا حاسما في تجديد ظهارة القرنية، سواء بشكل طبيعي وبعد الاصابة. ونضوب جزئي أو كامل من هذه الخلايا الجذعية يؤدي إلى تقرحات القرنية المتكررة، والألم، تندب القرنية واتساع الأوعية الدموية، وظهور الخلايا الكأسية، وإذا تركت دون علاج، والعمى القرنية. وتعرف هذه الحالة باسم الحوفي نقص الخلايا الجذعية (LSCD) ويمكن أن يكون مجهول السبب. وراثي. أو مكتسبة بسبب الإصابات الكيميائية أو الحرارية، وارتداء العدسات اللاصقة على المدى الطويل، والتهاب مزمن 1-6.

البحث عن LSCD يتطلب نماذج حيوانية مناسبة أن يقلد ليس فقط المرض في البشر، ولكن لا يمكن استنساخه ومستدام، مع الأقلجبل إصابة الهياكل القرنية والعين الأخرى. هذا النموذج هو ضروري لتقييم العلاجات وتوضيح آليات المرض على المستوى الجزيئي والخلوي. كما هو موضح قبل 1، مع استخدام لدغ الدورية، يمكن للمرء بسهولة تطوير نموذج الفأر من LSCD الذي يضم مزايا المشار إليها، واستمرت لمدة ثلاثة أشهر على الأقل. الهدف من هذه الدراسة هو تقديم نموذج الفأر بسيطة، قابلة للتكرار، والمستدام للLSCD.

لدغ الدورية هو أداة قوية التي تزيل بالتساوي الظهارة دون إصابة سدى الأساسي 1. وقد تم استخدامه للحث على تآكل القرنية المركزي 7 و 8 في الدراسات شفاء الجروح. لم تم الإبلاغ عن تقنية المعروض على خلق LSCD في الماوس قبل. سبق عرضه أساليب تجريف ظهارة مع نتيجة ملعقة حادة في أقل موحدة إصابة خاصة في حوف والنمط الظاهري أكثر متغير 1، 9، مع مزيد من استعادة سو طبيعية ظهارة القرنية 1. على عكس مكشطة حادة، ولدغ الدورية يزيل الغشاء القاعدي الظهارية، وكذلك 7 و 8 و 10. طرق ذكرت أخرى لقطع الخلايا الجذعية تنطوي على استخدام المواد الكيميائية، مثل هيدروكسيد الصوديوم، ن heptanol، وكلوريد البنزالكونيوم، والتي لا يمكن أن تحفز الإصابة غير المرغوب فيها للهياكل العين الكامنة، ولكن أيضا قد تؤدي إلى التهابا حادا وعتامة القرنية لاحقة أو الظهارية الحرشفية حؤول 11-15. لا يرتبط لدغ بالتناوب مع هذه المضاعفات الشديدة. إزالة جراحيا ظهارة الحوفي، وحدها أو مع استخدام المواد الكيميائية 10، 11، 16، هو أكثر صعوبة لأداء وليس الخيار الأفضل في الحيوانات مع عيون صغيرة وظهائر الحوفي رقيقة (مثل الفئران). وبالإضافة إلى ذلك، من المستغرب، limbectomy قد لا تزال تترك بعض من ظهارة الحوفي وراء 10.

وهذا الاسلوب هو موضح أدناه، يؤدي إلى LSCD مع اتساع الأوعية الدمويةد conjunctivalization الذي يحاكي عرض LSCD الكامل في المرضى ويستمر لمدة ثلاثة أشهر على الأقل 1. وهي مناسبة لأولئك الذين يهدفون إلى دراسة LSCD أو جرح الفيزيولوجيا المرضية الشفاء، علم المناعة، والعلاجات المحتملة في الفئران. ربما، مع بعض التعديلات، وهذا الإجراء لا يمكن أن يؤديها في الفئران أو الأرانب 10. كما لدغ الدورية يزيل بكفاءة ظهارة، ويمكن استخدامها في أي بحث المتعلقة القرنية الطلائية الكشط / جرح وفي أي معاملة ذات الصلة أو دراسات البيولوجيا الجزيئية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كافة الإجراءات التي أجريت على الحيوانات تتوافق مع جمعية البحوث في تصريحات الرؤية وطب العيون للاستخدام الحيواني في مجال البحوث الرؤية. استخدمت أربعة عشر أربع إلى الذكور / الإناث C57BL / 6J الفئران نوع البرية القديمة ستة أشهر: عشرة الفئران لنموذج الإصابة والأربعة الحيوانات التحكم (القرنيات المعافين).

1. إعداد الحيوان

  1. تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 5 ملغم / كغم من خليط زيلازين. بعد التخدير اتخذت تأثير، قرصة أخمص القدمين إلى تأكيد عمق التخدير. يجب أن الحيوان لا تتفاعل.
  2. تفقد العين تحت المصباح الشقي قبل إجراء التجارب للتحقق من عدم وجود أي إصابة القرنية السابقة.
  3. غرس بنسبة انخفاض قدرها 1٪ تتراكائين هيدروكلوريد على العين. بعد 60-90 ثانية، واختبار رد الفعل القرنية لتأكيد غياب الإحساس. بروباراكايين هيدروكلوريد 0.5٪ يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك.
  4. عندما فقدان الإحساس القرنية هيالمؤكد، ضع بلطف قطرة من 5٪ بوفيدون اليود على العين وعلى الشعر حول العين. تمحو الانخفاض بعد 1 دقيقة أو انتشاره على الشعر حول العين لمنع الشعر من التدخل في تلميح أداة.

2. كاشط ظهارة القرنية

  1. ارتداء القفازات الجراحية وثوب. إعداد الأدوات اللازمة: لدغ الدورية معقمة وزوج من ملاقط معقمة. للتحكم بشكل أفضل، واستخدام الملقط عازمة. وضع الأدوات على ورقة معقمة أثناء العملية.
  2. باستخدام الملقط عازمة واستقرار العين عن طريق الاستيلاء على أغطية من جانب الأنف وproptosing بلطف العين. تجنب استخدام الكثير من الضغط.
  3. تحت المجهر الجراحي، حلاقة 360 درجة في جميع أنحاء المنطقة الحوفي مرتين باستخدام لدغ الدورية العقيمة. يرحل حوف مع سرعة 5-6 ثانية في الجولة.
    ملاحظة: إن لدغ ديه سرعة ثابتة واحدة. ومع ذلك، من أجل أن تناوب على سرعة ثابتة، و"الجوز نهاية" يجب تشديد تماما.
  4. إزالة ظهارة القرنية بأكملها من حوف إلى حوف مع لدغ الدورية. للحصول على نتائج أفضل، حرك أداة بطريقة دائرية وأنه عقد بالتوازي إلى حد ما على سطح القرنية للعمل مع الجانب الوحشي من طرفها. احرص على عدم جرح سدى من خلال عدم إعادة تنظيف المناطق حيث تم بالفعل إزالة ظهارة. لا تنطبق أي ضغط على العين. تنظيف رأس الفرشاة على النحو المطلوب.
  5. غرس قطرة العقيمة المالحة الفوسفات مخزنة على القرنية وإزالة أي صفائح الظهارية منفصلة مع تنظيف الأنسجة اللينة.
  6. حلق ظهارة المتبقية، إن وجدت.
  7. إيلاء الاهتمام لذيل الماوس أثناء الجراحة.
    ملاحظة: في حالة حدوث أي حركة، قد تلاشى عمق التخدير وهناك حاجة إلى مزيد الحقن. وينبغي أن يكون ثلث إلى ثلثي حجم حقن الأساسي كافية. لا جرعة زائدة الحيوان مع دواء مخدر.
  8. تعقيم جميع الأدوات قبل استخدامها على العين آخر.

3. تأكيد إزالة الظهارية كاملة

  1. تطبيق قطرة من 1 ملغ / مل فلوريسئين الصوديوم على القرنية. تنظيف القرنية بعد 30 ثانية و فحصها تحت المجهر مع الكوبالت الأزرق مرشح للتحقق من الاستئصال الكامل للظهارة.
    ملاحظة: يتم تصور المناطق القرنية مع العيوب الظهارية باللون الأخضر.

4. بعد عملية العناية

  1. وضع الحيوان على بطانية التدفئة والحفاظ عليه في مكان آمن (على سبيل المثال، في قفصه)، في حين ظل الانتعاش. لا تبقي حيوان فاقد الوعي في الشركة من تلك اعية.
  2. تطبيق 1٪ الاريثروميسين مرهم للعين. وهذا أيضا منع جفاف العين. مواصلة تطبيق يوميا المضادات الحيوية لمدة أسبوع.
  3. ضخ 0.1 ملغم / كغم البوبرينورفين تحت الجلد بعد العملية، ومرة ​​أخرى بعد 12 ساعة. مواصلة حقن مرتين يوميا لمدة يومين.
  4. مراقبة الحيوانات ل30 - 45 دقيقة، حتى الشفاء التام من المخدر.
    ملاحظة: حركة خفيفة في عضلات التنفس على السطح البطني تشير العافية الحيوان في حين ظل الانتعاش.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في غضون شهر بعد أداء هذه التقنية، وضعت 100٪ من القرنيات اتساع الأوعية الدموية السطحية (الشكل 1A. تم التقاط الصور مع كاميرا متصلة المصباح الشقي تحت حقل مشرق والكوبالت مرشح الأزرق). في 18/20 (90٪) من العيون، وتشارك اتساع الأوعية الدموية على سطح القرنية كله (الشكل 1A). في 2/20 (10٪)، وقد لوحظ اتساع الأوعية الدموية في ثلاثة من أربعة أجزاء القرنية، لكنه لا يزال صلت إلى مركز القرنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة تقنية استنساخه وبسيطة نسبيا لخلق نموذج الفأر من LSCD. هناك عدة جوانب هامة من هذا الطراز التي تستحق الملاحظة. أولا، نماذج خلافا التي تستخدم المواد الكيميائية 11، 12، وإصابة ينطوي في المقام الأول ظهارة السطحية (والغشاء القاعدي)، مع الحد الأدنى من الضرر للسدى القرنية الأساسي أو الهياكل داخل العين الأخرى. وبالتالي، ليس هناك سوى التهاب محدود وتندب، وكلاهما يمكن أن تعقيد الإجراءات وجعلها أكثر صعوبة لتقييم نتائج أي تدخلات تستهدف الخلايا الجذعية الحوفي. دراسة ح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أشكر روث Zelkha، MS، لمساعدتها السخية في مجال التصوير. وأيد هذا البحث من قبل برنامج السريرية التنمية العلماء جائزة K12EY021475 إلى ME، منح R01 EY024349-01A1 إلى ARD، الأساسية منحة EY01792 من المعهد الوطني للعيون، المعاهد الوطنية للصحة، ومنحة غير المقيد من البحوث للوقاية من العمى. ARD هو حاصل على جائزة التطوير المهني من البحوث للوقاية من العمى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
لدغ دوارة: مزيل حلقة الصدأ AlgerBrush II شركة رومكس الدولية ، كليرووتر ، فلوريدا16-141لدغ 0.5 مم. متاح أيضا من شركات أخرى.
المجهر الجراحيوايلد هيربروج ، سويسراوايلد M691
كاميرا رقميةنيكون ، تايلاند
نيكون FS-2 مصباح شقنيكون ، اليابان
النسيلة المضاد ل CK12 الأجسام المضادةسانتا كروز بلوتكنولوجي ، كاليفورنيا ،SC-171011: 100 تركيز
أحادي النسيلة المضاد للجسم المضادTROMA-I-S ، أيوا سيتي ، IAAB_531826تركيز 1:50
متعدد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Afsharkhamseh, N., et al. Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice. Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).
  2. Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence. Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).
  3. Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. The culture and transplantation of human limbal stem cells. J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).
  4. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  5. Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).
  6. He, H., Yiu, S. C. Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies. Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).
  7. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).
  8. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).
  9. Amirjamshidi, H., et al. Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency. Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).
  10. Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).
  11. Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).
  12. Ma, Y., et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).
  13. Bu, P., et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury. Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).
  14. Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns. J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).
  15. Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
  16. Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).
  17. Liu, C. Y., et al. Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development. Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).
  18. Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).
  19. Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency. Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).
  20. McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة