يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقنيات التصوير طليعة الطور والطورية من الانقسام الاختزالي الأول في مجال الاتصالات الأرضية

8.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54666

⸱

أكتوبر 31, 2016

 , 
1Waksman Institute, Rutgers University, 2Department of Genetics, Rutgers University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولات لجمع وإعداد وتصوير بويضات ذبابة الفاكهة الناضجة. تسمح هذه الطرق بتصور سلوك الكروموسوم وتجميع المغزل ووظيفته أثناء الانقسام الاختزالي.

الملخص

فصل الكروموسومات في البويضات البشرية عرضة للخطأ ، مما يؤدي إلى اختلال الصيغة الصبغية ، وهو السبب الوراثي الرئيسي للإجهاض والعيوب الخلقية. تحمل دراسة سلوك الكروموسوم في البويضات من الكائنات الحية النموذجية الكثير من الوعد للكشف عن الأساس الجزيئي لقابلية البويضات البشرية لاختلال الصيغة الصبغية. ذبابة الفاكهة السوداء قابلة للتلاعب الجيني ، مع أكثر من 100 عام من البحث والمجتمع وتطوير التقنية. ومع ذلك ، فإن تصور سلوك الكروموسوم وتجميع المغزل في ذبابة الفاكهة يواجه تحديات خاصة ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى وجود أغشية تحيط بالبويضة لا يمكن اختراقها للأجسام المضادة. نصف هنا بروتوكولات جمع وإعداد وتصوير تجميع مغزل الانقسام الاختزالي الأول وسلوك الكروموسوم في ذبابة الفاكهة البويضات ، والتي تسمح بالتشريح الجزيئي لفصل الكروموسوم في هذا الكائن الحي النموذجي المهم.

المقدمة

توصف دراسة الانقسام الاختزالي أحيانا بأنها "علم الوراثة في علم الوراثة". وذلك لأن الخصائص الأساسية لوراثة الكروموسوم والتشكيلة المستقلة تتم من خلال فصل الكروموسومات أثناء إنتاج الأمشاج. جاء عرض مهم لنظرية الكروموسوم للوراثة في عام 1916 من عمل كالفن بريدجز في ذبابة الفاكهة السوداء1. ساهمت هذه الدراسات وغيرها من دراسات علم الوراثة الكلاسيكية في ذبابة الفاكهة بشكل كبير في فهمنا لعلم الوراثة. ومع ذلك ، كان الفحص الخلوي للكروموسومات الانتصافية في ذبابة الفاكهة البويضات أمرا صعبا. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى أن التألق المناعي لبويضات ذبابة الفاكهة في المرحلة المتأخرة ، عندما يتجمع المغزل ويتم توجيه الكروموسومات للفصل ، يعوقه وجود أغشية تجعل البويضة غير قابلة للاختراق للأجسام المضادة.

على الرغم من هذا التحدي ، تظل بويضات ذبابة الفاكهة نموذجا جذابا لدراسة سلوك الكروموسوم وتجميع المغزل. هذا بسبب الأدوات الجينية القوية المتوفرة في ذبابة الفاكهة ، ولكن أيضا لأن البويضات تتوقف عند الطور الأول ، عندما تكون الكروموسومات موجهة والمغزل يتشكل بالكامل. هذا يسهل جمع وفحص أعداد كبيرة من البويضات في هذه المرحلة المهمة من انقسام الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للكائن الحي النموذجي البسيط القابل للتلاعب الجيني لدراسة فصل كروموسومات البويضات أن يوفر مساهمة مهمة في فهمنا للصحة الإنجابية للإنسان. الأخطاء في عدد الكروموسوم هي السبب الوراثي الرئيسي للإجهاض والعيوب الخلقية لدى البشر2. يمكن إرجاع غالبية هذه الأخطاء إلى البويضة وترتبط بزيادة عمر الأم. يتزايد متوسط عمر الأمهات في الولايات المتحدة ، مما يجعل هذا مصدر قلق كبير للصحة العامة.

نصف هنا طرق الفحص الخلوي لذبابة الفاكهة البويضات ، بما في ذلك عرض توضيحي لكيفية إزالة أغشية البويضات. هذه الطرق هي تعديلات على البروتوكولات التي وصفها Theurkauf و Hawley3 و Zou et al.4 ، وديرنبورغ وآخرون.5. نقوم أيضا بتضمين طرق لإثراء مراحل مختلفة من البويضات ، بناء على بروتوكول وصفه لأول مرة جيليلاند وآخرون.6. أخيرا ، نضيف تعليمات للعلاج الدوائي لبويضات ذبابة الفاكهة. تسمح هذه الطرق معا بالتحقيق الخلوي لفصل كروموسوم البويضة وتجميع المغزل في ذبابة الفاكهة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتم تنفيذ الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك: مذكرة. وتستخدم حاضنات التحكم في درجة حرارته للحفاظ على درجات الحرارة لتربية ذبابة ويعبر ما لم يذكر خلاف ذلك.

1. التحضيرات

  1. إعداد الذباب.
    1. مجموعات بويضة طليعة الطور التالي التخصيب.
      1. الذباب الكبار واضحا من الشباب الأصحاء الأسهم أو عبر الثقافات. زجاجات العمر لمدة يومين عند 25 درجة مئوية.
        ملاحظة: عموما زجاجتين صحية تكفي، على الرغم من أن أكثر قد تكون هناك حاجة لبعض الثقافات عبر.
      2. بعد يومين، وجمع ~ 100-300 الإناث (الذين هم 0-2 أيام من العمر في هذه النقطة) من الزجاجات. الإناث لا تحتاج إلى أن تكون العذارى. إضافة لمسة من معجون الخميرة إلى جانب قارورة ووضع 30 من الإناث و 10 إلى 15 من الذكور كل في قارورة yeasted. قارورة العمر لمدة يومين عند 25 درجة مئوية.
    2. الطورية التخصيب مجموعة سيت.
      1. جمع ~ 100-300 الإناث من الأسهم أو عبر الثقافيهوفاق. إضافة لمسة من معجون الخميرة إلى جانب قارورة ووضع 30 الإناث كل (مع عدم وجود الذكور المضافة) في قارورة yeasted. قارورة العمر لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام عند 25 درجة مئوية.
  2. إعداد الحلول.
    ملاحظة: قد تكون مخزنة حلول أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة، ما لم يذكر خلاف ذلك.
    1. استعد التعديل العازلة روب ل(5X): 500 ملي HEPES، 500 ملي السكروز، 275 ملي خلات الصوديوم، 200 ملي خلات البوتاسيوم، 50 ملي الجلوكوز، كلوريد المغنيسيوم 6 مم، و 5 ملي كلوريد الكالسيوم. استخدام 10 N 11: 8 هيدروكسيد الصوديوم: هيدروكسيد البوتاسيوم لجلب الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. تعقيم عن طريق الترشيح. لا الأوتوكلاف. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد عند الحاجة لإعداد ~ 200 مل من 1X روب نصيب بويضة الإعدادية.
    2. حلول التثبيت.
      1. الخيار رقم 1: إعداد الفورمالديهايد / هيبتان التثبيت. إعداد التثبيت العازلة: مخزنة المالحة الفوسفات 1X (PBS)، بالإضافة إلى 150 ملي السكروز. لاستخدام، وجعل جديدة مع 687.5 ميكرولتر التثبيت العازلة و312.5 ميكرولتر 16٪ الفورمالديهايدفي الإعدادية بويضة.
        تنبيه: ارتداء قفازات أثناء استخدام حلول الفورمالديهايد في غطاء الدخان. التخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
      2. الخيار رقم 2: إعداد الفورمالديهايد / كاكوديلات التثبيت. إعداد فيكس ميكس: 250 ملم السكروز، 100 ملي البوتاسيوم خلات (7.5 درجة الحموضة)، و 25 ملي خلات الصوديوم (7.0 درجة الحموضة)، و 25 ملي EGTA (8.0 درجة الحموضة). لاستخدام، وجعل جديدة مع 400 ميكرولتر إصلاح ميكس، 100 ميكرولتر كاكوديلات البوتاسيوم (1 م، ودرجة الحموضة 7.2)، و 500 ميكرولتر 16٪ الفورمالديهايد في الإعدادية بويضة.
        تنبيه: كاكوديلات البوتاسيوم يحتوي على الزرنيخ.
    3. إعداد برنامج تلفزيوني / تريتون X-100: برنامج تلفزيوني 1X بالإضافة إلى 1٪ أو 0.05٪ تريتون X-100. تخزينها في 4 درجات مئوية.
    4. إعداد برنامج تلفزيوني توين 20-الأبقار مصل الزلال (BSA) (PTB): برنامج تلفزيوني 1X، 0.5٪ BSA (ث ت /)، و 0.1٪ توين-20. ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.
    5. مضان في حلول التهجين الموضعي (FISH).
      1. إعداد 20X الصوديوم كلوريد الصوديوم السيترات (SSC): 3 M كلوريد الصوديوم و 0.3 M سيترات الصوديوم.
      2. إعداد 2X SSC-توين-20 (SSCT): 2X SSC بالإضافة إلى 0.1٪ توين-20. جعل جديدة، ~ 20 مل لكل الإعدادية بويضة.
      3. إعداد الحلول الفورماميد: 2X SSC، 0.1٪ توين 20، بالإضافة إلى الفورماميد. جعل طازجة، 1 مل 20٪ الفورماميد، 0.5 مل 40٪ الفورماميد، و 2 مل 50٪ الفورماميد في الإعدادية بويضة.
        تنبيه: ارتداء قفازات أثناء استخدام حلول الفورماميد في غطاء الدخان. التخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
      4. يعد حل التهجين: 2X SSC، 50٪ الفورماميد، و 10٪ كبريتات ديكستران (ث / ت). تخزينها في 4 درجات مئوية.
    6. تحقيقات الأسماك.
      1. [أليغنوكليوتيد النظام (انظر الجدول رقم 1 لمتواليات) مع تنقية HPLC والمرجوة 5 'تعديل فلوري (على سبيل المثال، و Cy3 أو Cy5). resuspend في تريس، EDTA (TE) في 50 نانوغرام / ميكرولتر.
        ملاحظة: حماية oligos من التعرض للضوء في جميع الأوقات.

2. جمع في وقت متأخر من مرحلة ذبابة الفاكهة البويضات

  1. مثل البويضات ذبابة الفاكهة مع الأغشية سليمة ستلتزم البلاستيك والزجاج، قبل معطف داخل أنبوب واحد 5 مل والماصة باستور واحد لكل الإعدادية بويضة مع PTB.
  2. تخدير جميع ~ 100-300 الذباب yeasted مع ثاني أكسيد الكربون وإضافة إلى خلاط تحتوي على ~ 100 مل 1X العازلة روب ل. نبض ثلاث مرات (~ 1 ثانية لكل منهما). إبقاء البويضات والتي روب ل <20 دقيقة لتجنب التنشيط.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، البويضات يمكن تسليم تشريح-من الإناث. وميزة هذا الأسلوب هو أنه يتطلب أقل من الإناث. ومع ذلك، يجب توخي الحذر للحد من التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون لبضع دقائق فقط لتجنب القطع الأثرية مرتبطة بنقص الأكسجة 7.
  3. تصفية من خلال شبكة كبيرة (~ 1500 ميكرون) إلى 250 مل دورق لإزالة أجزاء الجسم الكبيرة. إذا لا تزال العديد من بطون سليمة على مواد شبكة، وإعادة طحن باستخدام إضافية العازلة روب، ووالفلتر مرة أخرى. دعونا تسوية ~ 2 دقيقة، ثم نضح من الطبقة العليا، وإزالة أكبر عدد ممكن من أجزاء الجسم كبيرة ممكن.
  4. فايlter من خلال شبكة صغيرة (~ 300 ميكرون) في كوب 250 مل. شطف المتبقية البويضات من الكأس الأول باستخدام إضافي لروب والمغلفة باستور الماصة. دعونا تسوية ~ 3 دقائق. والبويضات يستقر بها. نضح قبالة جميع ولكن ~ 10 مل.
  5. صب أكبر قدر من 10 مل كما سوف تناسب المغلفة أنبوب 5 مل. دعونا تسوية، وإزالة السائل، وكرر مع بقية. شطف البويضات المتبقية من الدورق باستخدام إضافية روب والمغلفة باستور الماصة. دعونا تسوية في 5 مل أنبوب ل~ 3-5 دقيقة.

3. العلاج بالعقاقير (اختياري)

  1. معطف الثاني أنبوب 5 مل مع PTB لكل الإعدادية بويضة. إضافة مذيب مناسب (السيطرة) أو المخدرات إلى 1 مل روب في كل لكل الإعدادية بويضة (الجدول 2).
  2. البويضات انقسم الى المغلفة الثانية أنبوب 5 مل. دعونا تسوية، وإزالة السائل، وإضافة 1 مل من روب بالإضافة إلى المذيبات في أنبوب واحد وفي 1 مل روب بالإضافة إلى المخدرات في أنبوب الثاني. Nutate لكمية مناسبة من الوقت لمعالجة مدمني المخدرات (الجدول 2). Lوآخرون تسوية.

4. التثبيت

  1. نضح قبالة كل السائل وعلى الفور إضافة 1 مل الإصلاح.
  2. الخيار رقم 1: الفورمالديهايد / تثبيت هيبتان (التثبيت العازلة بالإضافة إلى 5٪ الفورمالديهايد).
    1. إصلاح مقابل 2.5 دقيقة على nutator. إضافة 1 مل هيبتان ودوامة 1 دقيقة. دعونا تسوية ~ 1 دقيقة.
    2. إزالة جميع السائل، ثم إضافة 1 مل برنامج تلفزيوني 1X. دوامة 30 ثانية. دعونا تسوية ~ 1 دقيقة.
    3. إزالة جميع السائل، ومن ثم ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني 1X.
      ويمكن استخدام البويضات على الفور أو تبقى على nutator لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة: ملاحظة.
  3. الخيار رقم 2: الفورمالديهايد / كاكوديلات تثبيت (فيكس ميكس بالإضافة إلى 8٪ الفورمالديهايد و 100 كاكوديلات ملم).
    1. إصلاح لمدة 6 دقائق على nutator. دعونا تسوية 2 دقيقة. إزالة السائل، ومن ثم ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني 1X.
      ويمكن استخدام البويضات على الفور أو تبقى على nutator لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة: ملاحظة.

5. إزالة الأغشية ( "المتداول")

  1. باستخدام المغلفة باستور الماصة، إضافة ~ 500 إلى 1000 البويضات إلى الجزء بلوري (الرمال انتقد) من شريحة زجاجية. إزالة جميع أجزاء الجسم وملقط المواد باستخدام الدخيلة. لا تدع البويضات تجف. إضافة برنامج تلفزيوني 1X عند الضرورة.
  2. وضع ساترة على أعلى من البويضات وبلطف البويضات "لفة" حتى جميع أغشية يتم إزالة (سحب حافة ساترة عبر البويضات يعمل على نحو أفضل.) فحص دوري التقدم تحت المجهر، إضافة المزيد من برنامج تلفزيوني 1X الضرورة. رعاية مثل الكثير من الضغط سوف يدمر البويضات.
    ملاحظة: للحصول المناعي فقط، تستمر مع الخطوة 6. بالنسبة للأسماك (مع أو بدون المناعي)، تواصل مع الخطوة 7.

6. تلوين الأجسام المضادة من ذبابة الفاكهة البويضات

  1. استخراج والحجب
    1. شطف البويضات توالت في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على ~ 15 مل PBS / 1٪ تريتون X-100. البويضات Nutate في هذا الحل لمدة لا تقل عن 1.5 ساعة ولا يزيد عن 2 ساعة.هذه الخطوة تتيح اختراق الأجسام المضادة.
    2. السماح البويضات تستقر ~ 2 دقيقة. إزالة السائل جنبا إلى جنب مع العديد من الأغشية وقت ممكن، ثم إضافة برنامج تلفزيوني / 0.05٪ تريتون X-100.
      ملاحظة: سوف الأغشية يستقر أبطأ من البويضات تدحرجت.
    3. اسمحوا البويضات تستقر ~ 2 دقيقة، ثم إزالة كافة ولكن ~ 1 مل السائل. نقل البويضات لتخرج أنبوب 1.5 مل وإزالة ما تبقى السائل. إضافة 1 مل PTB من أجل الحيلولة دون وnutate لمدة 1 ساعة.
  2. الأجسام المضادة تلطيخ
    1. قبل امتصاص الأجسام المضادة الثانوية ضد الأجنة.
      ملاحظة: هذه الخطوة يلغي تلوين الخلفية من التفاعلات الأجسام المضادة غير محددة مع البروتينات ذبابة الفاكهة.
      1. جمع وتحديد الأجنة ذبابة الفاكهة (~ 25 ميكرولتر) في إجراء نموذجي 8. تخزين في الميثانول في -20 درجة مئوية.
      2. إزالة الميثانول من الأجنة، إضافة 800 ميكرولتر الميثانول بالإضافة إلى 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X، وnutate لمدة 15 دقيقة. إزالة 500 ميكرولتر من طاف واستبدالها مع 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X. ثم nutate لمدة 15 دقيقة. كرر مرتين (أي ما مجموعه ~ 1 ساعة يغسل)، وبعد ذلك تنتهي في PTB.
        ملاحظة: الأجنة يمكن استخدامها على الفور أو الاحتفاظ بها على nutator لعدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      3. إزالة السائل، وملء مع PTB إلى 200 ميكرولتر في الإعدادية بويضة، وإضافة الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى في التخفيفات المناسبة (مع الأخذ في الاعتبار أن الحجم النهائي سيكون 300 ميكرولتر؛ انظر الخطوة 7.4) Nutate في 4 درجات مئوية خلال الليل (الأفضل) أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 إلى 4 ساعات.
        ملاحظة: سيتم استخدام الأجسام المضادة استيعابها مسبقا في الخطوة 6.2.4.
        ملاحظة: حافظ على عينات في الظلام قدر الإمكان مرة واحدة تم إضافة الأجسام المضادة الفلورسنت.
    2. إزالة السائل من البويضات، وملء مع PTB إلى 300 ميكرولتر وإضافة الأجسام المضادة الأولية في التخفيفات المناسبة. Nutate في 4 درجات مئوية خلال الليل (الأفضل) أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 إلى 4 ساعات.
    3. غسل البويضات أربع مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما مع 1 مل PTB.
    4. إزالةالسائل من البويضات، إضافة 200 ميكرولتر من طاف من الأجنة (قبل يمتص الأجسام المضادة الثانوية). ثم ملء مع PTB إلى 300 ميكرولتر. Nutate في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 إلى 4 ساعات (الأفضل) أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
    5. غسل البويضات مرة واحدة لمدة 15 دقيقة مع 1 مل PTB، وإزالة السائل. ثم يضاف 0.5 ميكرولتر هويشت 33342 و 500 PTB ميكرولتر وnutate لمدة 7 دقائق.
    6. غسل البويضات مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما مع 1 مل PTB.
      ملاحظة: قد يتم تنظيمها البويضات على شريحة فورا أو قد تكون مخزنة في PTB في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للتصوير.

7. FISH (تابع من الخطوة 5 أعلاه)

  1. شطف البويضات توالت في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 15 مل ~ 2X SSCT. السماح البويضات تستقر ~ 2 دقيقة. إزالة كافة ولكن ~ 0.5 مل السائل جنبا إلى جنب مع العديد من الأغشية ممكن.
    ملاحظة: سوف الأغشية يستقر أبطأ من البويضات تدحرجت.
  2. نقل البويضات إلى 0.5 مل أنبوب وإزالة ما تبقى السائل. تباعا إضافة وإزالة 500 ميكرولتر20٪، 40٪، و 50٪ حلول الفورماميد، الإيماء لمدة 10 دقيقة في كل حل.
    ملاحظة: سوف البويضات يستقر أبطأ مع نسب أعلى من الفورماميد.
  3. إزالة السائل، ثم تضاف حل الفورماميد 500 ميكرولتر 50٪، وnutate عند 37 درجة مئوية لمدة 1-5 ساعة.
    ملاحظة: أطول حضانات تؤدي إلى اختراق أفضل التحقيق.
  4. إزالة السائل، مخلفة وراءها ما لا يزيد عن 100 ~ البويضات ميكرولتر وإضافة 36 ميكرولتر حل التهجين زائد 2 ميكرولتر من التحقيق (50 نانوغرام / ميكرولتر) و 2 ميكرولتر من الماء أو 2 ميكرولتر من التحقيق الثانية 2 (الجدول 1).
  5. احتضان عند 91 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (FISH فقط) أو 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (FISH زائد المناعي)، تليها الحضانة في 37 ° C حمام الماء بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: قد يتم تنفيذ هذه الخطوات في thermocycler.
  6. لا تقم بإزالة السائل. إضافة 500 ميكرولتر 50٪ محلول الفورماميد وnutate عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  7. دعونا تسوية، وإزالة السائل، إضافة 500 ميكرولتر 50٪ محلول الفورماميد، لد nutate عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  8. دعونا تسوية، وإزالة السائل، إضافة حل الفورماميد 500 ميكرولتر 20٪، وnutate في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  9. تنفيذ ثلاث يغسل سريعة في 500 ميكرولتر 2X SSCT (السماح تسوية، إزالة ثم إضافة السائل، عكس عدة مرات، وتكرار.) واسمحوا تسوية، وإزالة السائل، ثم إضافة 500 ميكرولتر PTB وnutate لمدة 4 ساعة.

8. تلوين الأجسام المضادة بعد FISH

  1. إزالة السائل من البويضات، وملء مع PTB إلى 300 ميكرولتر وإضافة 10 ميكرولتر مكافحة α-تويولين الضد مترافق FITC. بدلا من ذلك، والأجسام المضادة الأخرى يمكن استخدامها، بعد بروتوكول أعلاه. Nutate في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
  2. غسل البويضات مرة واحدة لمدة 15 دقيقة مع 500 ميكرولتر PTB، وإزالة السائل، ثم يضاف 0.5 ميكرولتر هويشت 33342 و 500 PTB ميكرولتر وnutate لمدة 7 دقائق.
  3. غسل البويضات مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما مع 500 ميكرولتر PTB.
    قد يتم تنظيمها البويضات على شريحة فورا أو قد تكون مخزنة في PTB في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة لل: ملاحظةالتصوير. إبقاء البويضات في الظلام قدر الإمكان مرة واحدة تم إضافة الأجسام المضادة الفلورسنت.
تكرار اسم كروموسوم بنسبة ضئيلة تسلسل *
359 X GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC 2 AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
dodeca 3 CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1.686 2 + 3 AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT 4 (+ Y) AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
* 359 تسلسل من إريك جويس، والاتصالات الشخصية، سلاسل أخرى من سوليفان وآخرون. 8

الجدول 1: تحقيقات FISH ليكرر القسيم المركزي ذبابة الفاكهة.

عقار مذيب تركيز الأسهم التركيز النهائي وقت العلاج تأثير
الكولشيسين الإيثانول 125 ملي 150 ميكرومتر 10 دقيقة أو 30 دقيقة زعزعة الاستقرار في غير الحيز الحركي (10 دقيقة) 9 أو كل (30 دقيقة) ميكروتثبول
باكليتاكسيل [دمس] 10 ملي 10 ميكرومتر 10 دقائق استقرار هيئة التصنيع العسكريrotubules
Binucleine 2 [دمس] 25 ملي 25 ميكرومتر 20 دقيقة تمنع كيناز أورورا B 10

الجدول 2: العلاج من تعاطي المخدرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

سوف الأساليب التي وصفناها هنا يؤدي إلى مجموعة من المراحل المتأخرة من البويضات ذبابة الفاكهة تمثل ثلاث مراحل الانقسام الاختزالي (الشكل 1). وتتميز البويضات في الطور الأول من وجود الغلاف النووي، وهو أمر واضح بسبب عدم وجود إشارة تويولين في المنطقة المحيطة جسيم نووي (الشكل 1A). طليعة الطور التالي هو فترة ما بعد انهيار الغلاف النووي خلالها تجميع المغزل. خلال طليعة الطور التالي، وجسيم نووي يفترض الشكل المميز، لتص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

انطلاق ذبابة الفاكهة البويضات

على الرغم من أن جسيم نووي ممدود غالبا ما ينظر في البويضات طليعة الطور التالي، وذلك باستخدام جسيم نووي شكل للتمييز طليعة الطور التالي من البويضات الطورية يمكن أن يكون مشكلة. خلال طليعة الطور التالي، يبدأ جسيم نووي كما شكل دائري، يستطيل، ومن ثم تتراجع إلى شكل دائري مع اقتراب البويضة اعتقال الطورية. وهذا يعني أن العديد من البويضات طليعة الطور التالي لم يكن لديك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر كريستيان لينر على توفير الجسم المضاد CENP-C وإريك جويس على التوصيات بشأن FISH. تم تمويل العمل في مختبر McKim بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (GM101955).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب مخروطية 15 ملمختلفة
16٪ فورمالديهايدتيد بيلا ، Inc.18505خطرة ؛ بمجرد فتحها ، تخلص منها بعد شهر
واحد 250 مل أكوابمختلفة
مل أنابيب
خميرةمختلفة مع الماء لعمل عجينة قوام زبدة الفول
السوداني المضادة للجسم المضاد ألفا توبولين المقترن ب FITCSigmaF2168استنساخ DM1A
ثنائي النوكلين 2خلاط سيجماB1186الخطير
ألبومين مصل الأبقار
كلوريد الكالسيوممختلف
الكولشيسينسيجماC-9754أغطية خطرة
VWR48366-227رقم 1 1/2
DMSOمختلف
EGTAملقط
مختلفالإيثانول
تيد بيلا ، وشركة5622ملاقط دومون عالية الدقة على الطراز 5
فورماميدسيجما47670-250ML-F
شرائح زجاجيةVWR48312-003
جلوكوزأنابيب متدرجة
مختلفة 1.5 مل
HEPESVWREM-5330متوفرة من العديد من البائعين
Hoechst 33342كلوريد المغنيسيوم المختلفة
الميثانول
م)VWRAA43657-NKمجموعة متنوعة من التنسيقات والموردين الآخرين ، 12 أو 14
شبكة صغيرة (~ 300 & مايكرو ؛ م)مختبرات الطيف146 424مجموعة متنوعة من التنسيقات ، على سبيل المثال < / em> ، 146 422 أو 146 486
nutatorماصات باستور
أسيتات البوتاسيوم
SigmaC0125DANGEROUS ؛ بدلا من ذلك ، يمكن استبدال كاكوديلات الصوديوم
هيدروكسيدالصوديوم المختلفة
كلوريد الصوديوم
هيدروكسيد الصوديوم
تريتون X-100فيشرPI-28314
توين 20فيشرPI-28320
دوامةمختلفة
5 مختلفة جافة نشطة المتنوع سيجما A4161 كبريتات ديكستران مختلفة من مختلف شبكة كبيرة مختلفة (~ 1،500 & micro; مختلفة حمض الكاكوديليك المختلفة بالبوتاسيوم أسيتات المختلفة سترات الصوديوم المختلفة السكروز المختلف تاكسول مختلف (باكليتاكسل) سيجما T1912 الخطرة

المراجع

  1. Bridges, C. B. Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity. Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein. J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).
  4. Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes. J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).
  5. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86 (1), 135-146 (1996).
  6. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  7. Gilliland, W. D., et al. Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes. PLoS One. 4 (10), e7544(2009).
  8. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  9. Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes. PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).
  10. Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis. ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).
  11. Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
  12. Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
  13. Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila. EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).
  14. Endow, S. A., Komma, D. J. Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes. J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).
  15. Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).
  16. Colombié, N., et al. Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis. Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تجميع المغزلسلوك الكروموسوماتإزالة الغشاءالتألق المناعيالمجهر البؤرينفاذية الأجسام المضادةتثبيت البويضةتحليل الكاريوسوم
تقنيات التصوير طليعة الطور والطورية من الانقسام الاختزالي الأول في مجال الاتصالات الأرضية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.