Method Article

توصيف مجمعات متعدد فرعية البروتين من MXA الإنسان عن طريق عدم تغيير طبيعة بولي أكريلاميد هلام الكهربائي

DOI:

10.3791/54683

⸱

October 28th, 2016

 , 
1Institute for Medical Virology, University of Zurich, 2Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المقالة بروتوكولا بسيطا وسريعا لتقييم حالة قلة القلة لبروتين GTPase MxA الشبيه بالدينامين من محللات الخلايا البشرية باستخدام مزيج من PAGE غير المتمسخ مع تحليل اللطخة الغربية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تكوين مجمعات قليلة القلة شرطا أساسيا أساسيا للبنية والوظيفة الصحيحة للعديد من البروتينات. يمارس البروتين المستجيب المضاد للفيروسات المستحث بالإنترفيرون MxA نشاطا واسعا مضادا للفيروسات ضد العديد من الفيروسات. MxA هو GTPase يشبه الدينامين ولديه القدرة على تكوين هياكل قليلة الجودة من الدرجة الأعلى. ومع ذلك ، فإن ما إذا كان قلة القلة MxA مطلوبا لنشاطه المضاد للفيروسات هو مسألة نقاش. نصف هنا بروتوكولا بسيطا لتقييم حالة القلة من القلة المعبر عنها داخليا أو خارج الرحم MxA في الجزء السيتوبلازمي لخطوط الخلايا البشرية عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد غير المتغيرة (PAGE) بالاشتراك مع تحليل اللطخة الغربية. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في البروتوكول في اختيار المنظفات لمنع تراكم و / أو ترسيب البروتينات المرتبطة بشكل خاص بالأغشية الخلوية مثل MxA ، دون التدخل في نشاطها الأنزيمي. جانب آخر حاسم من البروتوكول هو الحماية التي لا رجعة فيها لمجموعات الثيول الحرة من بقايا السيستين بواسطة اليودوأسيتاميد لمنع التفاعلات الاصطناعية للبروتين. هذا البروتوكول مناسب لتقييم بسيط لحالة القلة من MxA ، علاوة على ذلك يسمح بارتباط مباشر للنشاط المضاد للفيروسات لطفرات واجهة MxA مع حالات القلة الخاصة بها.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هيكل رباعي من بروتين يلعب دورا حاسما في العديد من العمليات الخلوية. مسارات الإشارات والتعبير الجيني، وانزيم تفعيل / تعطيل كل تعتمد على التجميع السليم للمجمعات البروتين 1-4. ومن المقرر أن التساهمية لا رجعة فيها أو عكسها تفاعلات البروتين البروتين كهرباء ومسعور هذه العملية التي تعرف أيضا باسم هومو أو مغاير oligomerization. Oligomerization ليس فقط ينوع العمليات الخلوية المختلفة دون زيادة حجم الجينوم، ولكنها توفر أيضا استراتيجية للبروتينات لبناء المجمعات المستقرة التي هي أكثر مقاومة تجاه تمسخ وتدهور 5. عيوب في oligomerization لها تأثير على وظيفة البروتينات ويمكن أن يؤدي إلى تطور أمراض. على سبيل المثال، هيدروكسيلاز أنزيم فينيل الأنين يشكل مجمع رباعي القسيمات. بعض الطفرات داخل المجمع البروتين يمكن أن تضعف تشكيل tetramer وتؤدي إلى بيلة الفينيل كيتون المرض 6.

الصورة = "jove_content"> البروتين MXA الإنسان هو مضاد للفيروسات (IFN) -induced المضادة للفيروسات البروتين المستجيب تمارس نشاط مضاد للفيروسات واسع ضد مختلف RNA، فضلا عن الفيروسات الحمض النووي 7. انه ينتمي الى الفصيلة من GTPases كبيرة مثل dynamin ولديه القدرة على تشكيل الهياكل بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة في المختبر 8. وقد اقترح Oligomerization لحماية MXA من التدهور السريع 9،10. وعلى الرغم من الجهود المكثفة من قبل العديد من المجموعات البحثية، الآلية الجزيئية العمل لا تزال بعيدة المنال إلى حد كبير ودور الدولة oligomerization من MXA عن وظيفتها المضادة للفيروسات هو قيد المناقشة 9،11،12. وفي هذا الصدد، اقترح قاو وزملاء العمل نموذجا حيث يمارس MXA نشاطها المضاد للفيروسات من خلال التفاعل مع البروتينيات الفيروسية في شكل هياكل بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة تشبه حلقة 11. ومع ذلك، في الآونة الأخيرة، أثبتنا أن dimers MXA المعرض نشاط مضاد للفيروسات وتتفاعل مع البروتين النووي من فيروس إنفلونزا 12. بASED على التركيب البلوري للMXA، حدد غاو وزملاء العمل عدة مخلفات الأحماض الأمينية في المناطق اجهة التي تعتبر بالغة الأهمية لoligomerization في المختبر وظيفة مضادة للفيروسات في 11،13. ولذلك، من أجل توضيح التي تنص على بلازميدة قليلة القسيمات من MXA تمارس نشاط مضاد للفيروسات، سعينا إلى وضع بروتوكول بسيط لتحديد بسرعة الدولة oligmeric من المسوخ واجهة MXA أعرب في الخلايا البشرية وكذلك أعرب الذاتية MXA بعد التحفيز IFNα.

على الرغم من أن هناك العديد من التقنيات التي تستخدم عادة لتحقيق التفاعل بين البروتينات مثل بروتين تقسيم الفلوري الأخضر (تقسيم GFP) تكامل فحص 14، سطح مأكل بالرنين 15 و فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) 16، فإنها لا توفر معلومات رياضيات الكيمياء الدقيق للمجمع البروتين بلازميدة قليلة القسيمات. للتحقيق في هذا الجانب بالذات، تقنيات مثلمتعددة زاوية تشتت الضوء (ملس) 17 وتنبيذ فائق التحليلية 18 هي مفيدة جدا. عادة، والبروتينات تحليلها باستخدام هذه الأساليب هي بروتينات النقاء. قد تعتمد عمليات Oligomerization أيضا على عوامل الخلوية الأخرى. وإذا كانت هذه العوامل هي غير معروفة، وتحليل أكثر صعوبة. بالإضافة إلى ذلك، بعض البروتينات يصعب التعبير عنها في E. القولونية وتنقية. لذلك، وهذه الأساليب ليست هي الخيار الأمثل لتحليل oligomerization البروتين في البيئة الخلوية. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنيات تتطلب الأدوات الباهظة الثمن التي لا تتوفر بسهولة.

غير تغيير طبيعة الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (PAGE)، اللوني حجم الإقصاء أو يشابك الكيميائية تليها التقليدية دوديسيل الصوديوم كبريتات (SDS) -PAGE هي أدوات مفيدة لتوصيف تشكيل الأوليغومرات من الخلية لست] 2،19،20. هذه الأساليب لا تتطلب معدات متخصصة ويمكن أن يكون المؤسسة العامة بسهولةrformed في المختبر القياسية. قمنا بتقييم البداية مختلف البروتوكولات عبر ربط الكيميائية التي أدت invariantly إلى تجميع وترسيب MXA غير محددة. لذلك، نحن اختبار القادم بروتوكولات PAGE عدم تغيير طبيعة. كما تستثني عدم تغيير طبيعة-PAGE استخدام SDS، والهجرة من البروتينات يعتمد على تهمة وطنهم. يستخدم زرقاء أصلية PAGE coomassie G250 الزرقاء الرائعة لتحميل البروتينات مع شحنة سالبة العام، على غرار SDS، ولكن لا تفسد البروتين 21. للأسف، coomassie رواسب الزرقاء الرائعة في وجود الأملاح العالية والكاتيونات ثنائي التكافؤ (مثل المغنيسيوم 2+) التي غالبا ما يتم تضمينها في مخازن تحلل. اعتمادا على مخازن المستخدمة، قد يكون من الصعب لتحليل عينة من دون مزيد من التحسين من الخطوات التي يمكن أن يكون لها تأثير على بروتين معقد بلازميدة قليلة القسيمات.

هنا نقدم بروتوكول البسيط القائم على طريقة نشرت سابقا 22 لتحديد oligomerization منالبروتين MXA حقوق الإنسان مستمد من لست] الخلوية استخدام غير تغيير طبيعة-PAGE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يعتمد هذا البروتوكول على نشرها سابقا عدم تغيير طبيعة بروتوكول PAGE 12. في هذه الدراسة، تم تقييم حالة بلازميدة قليلة القسيمات من البروتين MXA باستخدام خلايا الفيرو overexpressing MXA أو خلايا A549 تحفيز الإنترفيرون α، معربا عن الذاتية MXA. البروتوكول هو موضح أدناه يمكن استخدامها لتحليل حالة بلازميدة قليلة القسيمات من أي بروتين بالإضافة إلى MXA. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة مزيد من التحسين.

1. إعداد الخلايا المحللة للPAGE عدم تغيير طبيعة،

ملاحظة: لتحليل حالة بلازميدة قليلة القسيمات من البروتين MXA البشري في أي فيرو أو A549 الخلايا، كانت تحصد 1.0 × 10 6 خلايا. اعتمادا على نوع من الخلايا أو وفرة البروتين لتحليل، ينبغي تعديل عدد الخلايا. ومن المهم أيضا لحماية المنطقة العازلة تحلل من التعرض للضوء، في أقرب وقت يتم إضافة iodoacetamide حساسة للضوء.

  1. البذور 0.3 × 10 6 A549 أو فيرو خلايا لكل بئر فيإلى 6 جيدا الأطباق. إبقاء الخلايا في 2 مل متوسطة النمو لكل بئر (انظر الجدول 1). احتضان خلايا بين عشية وضحاها في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2).
  2. حصاد الخلايا عن طريق الغسيل مع 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وفصل بإضافة 0.5 مل من 0.25٪ حمض التربسين ethylenediaminetetraacetic (EDTA) 1X حل لحوالي 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. في أقرب وقت فصل الخلايا من الطبق، إضافة 0.5 مل متوسطة النمو وتخلط بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
  4. نقل الخلايا من كل بئر في واحدة أنبوب 2 مل وبيليه لهم باستخدام جهاز للطرد المركزي أعلى الجدول (5000 x ج، 4 درجات مئوية، 5 دقائق).
  5. إزالة بعناية طاف قبل pipetting دون إزعاج بيليه الخلية.
  6. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 مل الجليد الباردة من قبل pipetting بعناية تعليق الخلية صعودا وهبوطا.
  7. بيليه الخلايا في أعلى الجدول الطرد المركزي (5000 x ج، 4 درجات مئوية، 5 دقائق).
  8. إزالة بعناية طاف بواسطة pipetting وايthout فصل بيليه الخلية.
  9. Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر العازلة الجليد الباردة تحلل (انظر الجدول 1) من قبل pipetting صعودا وهبوطا وضعت على الجليد.
  10. على الفور، وحماية المحللة من الضوء من خلال تغطية الأنابيب باستخدام رقائق القصدير واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    ملاحظة: بعد مرور فترة الحضانة لمدة 30 دقيقة على الجليد، فإنه لم يعد ضروريا لحماية المحللة من التعرض للضوء، لأن حماية المجموعات ثيول حرة لا رجعة فيه.
  11. إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي في قبل المبردة أعلى الجدول الطرد المركزي (13000 x ج، 4 درجات مئوية، 20 دقيقة).
  12. تتوازن أعمدة غسيل الكلى في المخزن غسيل الكلى (الجدول 1) في الغرفة الباردة عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أثناء خطوة الطرد المركزي. استخدام عمود مع الوزن الجزيئي قطع من 10،000.
    1. إرفاق الأعمدة إلى عوامة تطفو ووضعها في كوب مملوء عازلة لغسيل الكلى. لضمان التحريك لطيف، واستخدام محرك مغناطيسي. لا تلمس الغشاء.
      ملاحظة: Dialysوالأعمدة يمكن شراؤها أو تحضيرها من 1.5 مل أنابيب وفقا لبروتوكول صفها فيالا وزملاء العمل 19.
  13. إزالة الأعمدة من المخزن المؤقت لغسيل الكلى وعوامة تطفو. نقل لست] مسح في العمود غسيل الكلى استعداد من قبل pipetting دون لمس الغشاء. إرفاق الأعمدة إلى عوامة تطفو ووضعها مرة أخرى في دورق مملوء عازلة لغسيل الكلى.
  14. Dialyze المحللة في دورق يحتوي على عازلة لغسيل الكلى المثلج (الجدول 1) لا يقل عن 4 ساعة (أو يفضل أن يكون بين عشية وضحاها) في 4 درجات مئوية مع التحريك بعناية باستخدام محرك مغناطيسي. استخدام لا يقل عن 100 مل العازلة غسيل الكلى لالمحللة 200 ميكرولتر.
  15. نقل العينة dialysed في أنبوب 1.5 مل. إزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي أعلى الجدول (13000 x ج، 4 درجات مئوية، 20 دقيقة). لمنع تفكك البروتين بلازميدة قليلة القسيمات تستمر المجمعات مع البروتوكول (القسم 2) مباشرة بعد غسيل الكلى. لا تجمدولست] المعدة.

2. الكهربائي

تم تنفيذ الكهربائي كما هو موضح من قبل مع بعض التعديلات 22: ملاحظة. في البروتوكول هو موضح أدناه، استخدمت مسبقة الصب المواد الهلامية التدرج (4-15٪ التدرج). بدلا من ذلك، المواد الهلامية يمكن أن تكون مستعدة في المختبر. من المهم جدا لاستبعاد أي عامل تغيير طبيعة مثل SDS لمنع تفكك المجمعات البروتين بلازميدة قليلة القسيمات. تم تحسين وقت الكهربائي لدول بلازميدة قليلة القسيمات مختلفة من البروتين MXA البشري. ومع ذلك، يمكن أن تختلف عن غيرها من البروتينات، وهذا يتوقف على حجم مجمع بلازميدة قليلة القسيمات فضلا عن مجموعة من الانفصال التي من المفترض أن يتحقق لتحليل مجمع. ولذلك، فإن الوقت الأمثل لالكهربائي وينبغي أن تحدد تجريبيا. لحل الأمثل للالأوليغومرات ليتم تحليلها وينبغي ألا يتجاوز التيار 25 أمبير.

  1. تجميع جل PAGE عدم تغيير طبيعة في غرفة هلام. ملء ركان الغرفة الداخلية والخارجية مع العازلة تشغيل قبل المبردة (الجدول 1).
  2. قبل تشغيل هلام مع العازلة تشغيل قبل المبردة في 25 مللي أمبير في هلام لمدة 15 دقيقة في غرفة باردة في 4 درجات مئوية.
  3. مزيج 15 ميكرولتر من لست] أعدت المذكورة أعلاه مع 5 ميكرولتر من عينة العازلة 4X (الجدول 1). لا تغلي العينة.
  4. تحميل 15 ميكرولتر من العينة ومستوى البروتين الأصلي من خيار في هلام. تشغيل هلام في 25 مللي أمبير لمدة 4 ساعة في غرفة باردة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: للحصول على التحليلات شبه الكمية، وبروتوكول البروتين الكمي (مثل برادفورد البروتين فحص 23) لا يمكن أن يؤديها من أجل ضمان تحميل من كميات متساوية من البروتين الكلي في الممر.

3. ويسترن وصمة عار

ملاحظة: هو موضح أدناه بروتوكول نظام صمة عار الغربي الرطب. أي غشاء النشاف يمكن استخدامها. تفعيل فلوريد البولي فينيل (PVDF) الأغشية في الميثانول بنسبة 100٪ قبل موازنة في النشاف BUFفر. تقنية لطخة غربية شبه الجافة يمكن استخدامها بدلا من ذلك، ولكن لابد الأمثل للمجمعات بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة.

  1. تفكيك جل ونقل بعناية في عازلة SDS (الجدول 1).
  2. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في حين يهز بلطف.
  3. إعداد 2 الإسفنج، 4 ورقة ورقة فلتر السليلوز وغشاء النشاف في هلام. نقع عليها في النشاف عازلة (الجدول 1).
  4. تجميع ساندويتش على النحو التالي (أسفل إلى أعلى): 1 الاسفنج، 2 السليلوز ورقة ورقة الترشيح، غشاء، هلام، 2 السليلوز ورقة ورقة فلتر، 1 الاسفنج.
  5. وضع شطيرة في خزان النشاف. تأكد من أن غشاء يواجه القطب الإيجابي في حين يواجه هلام القطب ناقص.
  6. ملء خزان النشاف مع العازلة النشاف قبل المبردة.
  7. وصمة عار في 90 مللي أمبير بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية حصول على أفضل النتائج نقل البروتين.
  8. تفكيك شطيرة وتصور مستوى بروتين التي يحتضنها الغشاء في Poncماء S حل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. يزيل اللون الغشاء عن طريق غسل بعناية قبالة الشقائقية S مع الماء منزوع الأيونات حتى يمكنك أن ترى بوضوح الفرق في مستوى البروتين.
  10. بمناسبة عصابات من مستوى البروتين باستخدام القلم.
    ملاحظة: المتبقية الشقائقية S يمكن أن تتداخل مع المناعية. لتجنب هذا، يمكن للغشاء مزيد destained التي كتبها حضانة في 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم لمدة 1 دقيقة وغسل لاحق مع الماء منزوع الأيونات.
  11. منع الغشاء مع عازلة تمنع (انظر الجدول 1) لا يقل عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  12. تصور بروتين (ق) من الفائدة عن طريق المناعية باستخدام أجسام مضادة موجهة ضد البروتين ليتم تحليلها.
    ملاحظة: البروتين MXA البشري وتصور باستخدام الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة المحددة لMX1 الإنسان المخفف 1: 1000 في عرقلة العازلة (الجدول 1). وقد حضنت الحل الأضداد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. بدلا من ذلك، وحيدة النسيلة لالمعهد القومي للاتصالات-MXA الأجسام المضادة (استنساخ 143) ويمكن استخدام (لا تظهر البيانات) 24.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام غير تغيير طبيعة-PAGE، قمنا بتحليل الدولة بلازميدة قليلة القسيمات من النوع البري البشري MXA، ومثنوي المسوخ واجهة MXA (R640A) وMXA (L617D)، فضلا عن واجهة أحادى الطور MXA (M527D) من الخلية لست] 12. كانت هي lysed الخلايا في العازلة التي تحتوي على 1٪ octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) وiodoacetamide لضمان ذوبان البروتين وحماية الفئات ثيول مجانية (انظر الشكل 1). كما هو موضح من قبل، تم إزالة الملح والأيض الصغيرة عن طريق غسيل الكلى 19. وجر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف طريقة بسيطة التي تسمح بتحديد السريع للدولة بلازميدة قليلة القسيمات من البروتينات التي أعرب عنها في خلايا الثدييات التي PAGE عدم تغيير طبيعة-يليه تحليل لطخة غربية. والميزة الرئيسية لهذا النهج هو أن الدولة بلازميدة قليلة القسيمات من بروتين معين يمكن تحديده من لست] خلية كاملة دون تنقية البروتين السابقة. قد يكون هذا هاما للبروتينات التي oligomerize أو ممارسة وظيفتها بالاشتراك مع عوامل مساعدة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البروتينات لا تزال في حالتها الأصلية، وإذا استخراج مزيد من...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (Grant nr. 31003A_143834) إلى JP.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
وحدات غسيل الكلى Slide-A-Lyzer MINI ، 10K MWCO ، 0.5 ملThermo Fisher Scientific69570التوازن المسبق في المخزن المؤقت لغسيل الكلى (إذا كانت إزالة الجلسرين مطلوبة)
يمكن أن تكون ذاتية الصنع وفقا ل Fiala et al. 2011
4 & ndash ؛ 15٪ Mini-PROTEAN TGX جل بروتين مسبقة الصب ، 10 بئر ،Bio-Rad456-1083تشغيل مسبق في تشغيل المخزن المؤقت لضبط نظام العازلة
cOmplete ، Mini ، Edta-freeRoche   ؛11836170001استخدام قرص واحد لكل 50 مل
PBS ، درجة الحموضة 7.4   زجاجة 500 مل GibcoThermo Fisher Scientific14190-094
Ponceau S solutionSigma-AldrichP7170TOXIC< / Strong> ارتداء القفازات وحماية العينين
NativeMark Unstained Protein Standard  50 & micro; لInvitrogenP / N 57030تحميل 5 & مايكرو ؛ ل/بئر
خلايا A549ATCCATCC CCL185تنمو في وسط النمو (انظر <قوي>الجدول 1< / قوي>)
خلايا فيروATCCATCC CCL81تنمو في وسط النمو (انظر <قوي>الجدول 1< / قوي>)
الأجسام المضادةالمضادة ل Mx1 Novus BiologicalsH00004599_D01Pاستخدامها عند تخفيف 1: 1,000
ECL المضاد للأرانب IgG ، الفجل الحار بيروكسيداز الجسم المضاد الكامل المرتبط (من حمار)GE-HealthcareNA934Vاستخدم عند تخفيف 1: 10،000
0.5٪ Trypsin-EDTA (1x)   ؛             لايف تكنولوجيزثيرمو فيشر15400-054
يودوأسيتاميد    5 جمSigma-AldrichI-6125مخزون   100 ملي مولار
برومفينول بلوسيجما ألدريتشB0126-25G
DMEM + 4.5 جم / لتر Gluc ، + L-Glut ، + تقنيات حياة البيروفاتThermo Fisher Scientific41966-029
Pen  البكتيريا العقدية 100 x        100ml                            لايف تكنولوجيزثيرمو فيشر العلمي15140 - 130
جلوتاماكس 100x مخزون ، 100 مل & nbsp ؛       تقنيات الحياةثيرمو فيشر Scientific350500-038
مصل الأبقار الجنيني ، غسيل الكلى ، أصل أمريكي 500 مل Gibco Lot: 42G9552KThermo Fisher Scientific10270-106
ورق ترشيح السليلوزBio-Rad1703965
PVDF blotting   غشاءGE-Healthcare10600022
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثانBiosolve0020092391BS
فلوريد الصوديوم (NaF)Sigma AldrichS-7920
NP-40Calbiochem492015
cOmplete ، Mini ، FreeEDTA Roche   ؛11836170001
Tween 20Calbiochem6555204
CHAPS 10٪ محلولAmrescoN907
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich43819
GlycineBiosolve0007132391BS
orthovanadate الصوديوم (Na3< / sub>VO4< / sub>)سيجما ألدريتش450243
GlycerolSigma AldrichG7757
& # 946 ؛ -GlycerophospateSigma AldrichG9422
مسحوق الحليبMigros / Switzerland
ميثانولميليبور1.06009
كلوريد الصوديوم (NaCl)سيجما ألدريتش71380
كلوريد المغنيسيوم (MgCl2< / sub>)Amresco288
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)سيجما ألدريتشL4509
هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)سيجما ألدريتشS-8045

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
  2. Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
  3. Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
  4. Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
  5. Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
  6. Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
  7. Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
  8. Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
  9. Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
  10. Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
  11. Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
  12. Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
  13. Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
  14. Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
  15. Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
  16. Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
  17. Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).
  18. Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
  19. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. , (2011).
  20. Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
  21. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
  22. Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
  23. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  24. Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
  25. Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
  26. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
  27. Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
  28. Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
  29. Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
  30. Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MxA OligomerizationNon denaturing PAGEWestern Blot AnalysisIodoacetamide ProtectionCell Lysate PreparationDialysis Buffer EquilibrationProtein Complex CharacterizationAntiviral Activity AssessmentEndogenous MxA DetectionTetramer Formation Analysis

Related Articles